Introdução à Microbiologia Clínica

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DESCRIÇÃO
Conceitos gerais de bacteriologia, testes de sensibilidade e métodos de
coloração.
PROPÓSITO
Compreender as características gerais das bactérias, reconhecer os tipos de
testes de sensibilidade e distinguir as principais técnicas de coloração
bacteriana é importante, pois facilitará a execução de procedimentos na
microbiologia clínica.
OBJETIVOS
MÓDULO 1
Descrever as características gerais das bactérias, as fases e os fatores que
afetam o crescimento bacteriano
MÓDULO 2
Reconhecer os tipos de meios de cultura, bem como os testes de
sensibilidade aos antimicrobianos
MÓDULO 3
Distinguir os métodos de visualização e coloração na prática laboratorial
INTRODUÇÃO
A Microbiologia é a ciência que estuda os organismos microscópicos, suas
características e atividades, sendo as bactérias, os fungos, as algas e os
protozoários os principais organismos estudados. Muitas bactérias são
agentes infecciosos responsáveis por uma série de doenças nos seres
humanos, podendo levar ao óbito dos indivíduos. Além disso, existe um
grupo de bactérias multirresistentes aos antimicrobianos, não apresentando
nenhum tipo de opção terapêutica.
A análise da morfologia, estrutura e metabolismo das bactérias é essencial
para a compreensão e a identificação correta do tipo bacteriano, seja através
do crescimento microbiano em meio de cultura adequado, ou através das
técnicas de coloração, ou para investigar resistência a um ou mais
antibióticos utilizados na clínica por meio dos testes de sensibilidade.
Você sabe por que algumas bactérias são classificadas como cocos gram-
positivos e outras gram-negativas? Você sabe a diferença entre meios de
culturas enriquecidos e seletivos? Como verifica-se a resistência aos
antimicrobianos? Vamos juntos decifrar e explorar mais sobre a microbiologia
clínica?
MÓDULO 1
 Descrever as características gerais das bactérias, as fases e os
fatores que afetam o crescimento bacteriano
MORFOLOGIA BACTERIANA
As bactérias podem apresentar diferentes morfologias, que caracterizam
determinados gêneros ou grupos de bactérias. A análise da morfologia
bacteriana auxilia na identificação e condução da escolha dos testes de
identificação do tipo de bactéria, isolada a partir de espécimes clínicos.
As bactérias são classificadas morfologicamente de acordo com o tamanho,
forma e arranjo e consistem nos menores seres vivos, da ordem de
milésimos de milímetro e, portanto, visíveis apenas com a ajuda de um
microscópio.
Enquanto células animais e vegetais podem ter até dezenas de micrômetros,
a maioria das bactérias estudadas nos laboratórios de microbiologia medem
em torno 1,0 µm de diâmetro.
 
Fonte: angellodeco/Shutterstock
ΜM
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Micrômetro: Unidade de comprimento onde 1,0 µm equivale a 1000
mm, ou seja, igual a 1 x 10-6 m).
Você sabe quais são os formatos que as bactérias podem se apresentar?
As bactérias podem se apresentar em três morfologias (Figura 1):
Fonte: Sakurra/Shutterstock
 Figura 1 - Morfologia das bactérias: cocos, bacilos e espiraladas.
COCOS
Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock
 Bactérias em formas de cocos.
Bactérias com formato esférico ou oval e que, de acordo com a sua divisão
celular, são exemplos de cocos de importância médica, Staphylococcus
aureus, Enterococcus spp, Streptococcus sp., Neisseria sp. Esses cocos
podem se apresentar em diferentes arranjos:
DIPLOCOCOS
Agrupamento de dois cocos. Os Streptococcus pneumoniae (pneumococo)
são diplococos que podem causar pneumonia, meningite, sinusite e infecção
do ouvido médio. Outro exemplo é a Neisseria gonorrhoeae agente etiológico
da gonorreia.
ESTREPTOCOCOS
Vários cocos agrupados em cadeia, lembrando um colar de pérolas. As
infecções estreptocócicas, causadas por várias espécies de Streptococcus,
podem desencadear diversos sintomas, como: pneumonia, faringite, febre
escarlatina, impetigo e celulite.
TÉTRADES
Agrupamento de 4 cocos de forma semelhante a um quadrado.
Exemplo: Micrococcus spp., normalmente, não são patogênicos e integram
a microbiota.
O aparecimento em uma cultura de sangue (hemocultura) desse tipo de
bactéria é sugestivo de contaminação, que pode ter ocorrido no momento da
coleta.
SARCINAS
Agrupamento de 8 cocos unidos de forma semelhante a um cubo. Exemplo:
Sarcina ventriculi, um importante patógeno em gatos, cachorros e bovinos.
Em humanos, o potencial patogênico ainda não é muito bem elucidado, mas
tem sido isolado em biopsias gástricas e relacionados com algumas
doenças, como gastrite enfisematosa e perfuração gástrica.
Essa bactéria não é fácil de isolar e cultivar em laboratório de microbiologia.
Assim, para o diagnóstico de gastrite provocada por essa bactéria
recomenda-se o exame histopatológico com colorações de Hematoxilina e
eosina.
ESTAFILOCOCOS
Cocos agrupados de forma semelhante ao cacho de uvas. Como exemplo,
temos as infecções por bactérias do gênero Staphylococcus aureus, que
causam infecções cutâneas (foliculite, impetigo, abcessos, celulite),
pneumonia, infecções na corrente sanguínea e osteomielite.
BASTONETES OU BACILOS
Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock
 Bastonetes.
São bactérias que apresentam um formato cilíndrico ou de bastão
(bastonete), podendo ser curtas ou longas e apresentar extremidade reta ou
de ponta arredondada. Normalmente, os bacilos não se agrupam em tantos
arranjos como os cocos, apresentando-se, na maioria das vezes, de forma
isolada. Entretanto, podem apresentar-se, eventualmente, como
diplobacilos ou estreptobacilos.
DIPLOBACILOS
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Agrupamento de dois bacilos.
Em alguns casos, como o da Corynebacterium diphtheriae causadora
da difteria, os bastonetes podem também apresentar arranjos
diferenciados, como crescimento em paliçada ou letras chinesas.
ESTREPTOBACILOS
Agrupamento em cadeia.
 
Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock
 C. diphteriae.
 
Fonte: SIRIKWAN DOKUTA/Shutterstock
 Bacilos gram-positivos com agrupamento de letras chinesas.
Algumas doenças causadas por bactérias em formato de bastonete ou
bacilos, são:
Tétano - Clostridium tetani
Tuberculose - Mycobacterium tuberculosis
Difteria - Bacilo diftérico
Hanseníase (lepra) - Mycobacterium leprae
É importante destacar que, durante a análise microscópica, alguns bacilos
podem ser confundidos com cocos, isso ocorre pois são bacilos muito curtos.
Esses bacilos curtos são chamados de cocobacilos.
ESPIRALADAS
 
Fonte: Tatiana Shepeleva/Shutterstock
 Bactérias espiraladas.
Bactérias com formato espiralado ou helicoidal e que ocorrem,
predominantemente, como células isoladas. Elas podem ser divididas em
espirilos, espiroquetas e vibriões, conforme observado na Figura 2.
Fonte: Olga Bolbot/Shutterstock
 Figura 2 - Formas de bactérias espiraladas.
ESPIRILOS
São móveis (locomovem-se com ajuda de flagelos), apresentam formato
espiral e corpo rígido. Ex: Spirillum minus, que causa Febre da mordedura do
rato em humanos e macacos.
ESPIROQUETAS
São móveis, mas se locomovem por contrações citoplasmáticas, apresentam
formato em espiral e são mais flexíveis; Ex: Treponema pallidum.
O T. pallium é o agente etiológico da sífilis, uma infecção bacteriana de
transmissão sexual e vertical. Quando não tratada, pode evoluir para formas
mais graves, comprometendo especialmente os sistemas nervoso e
cardiovascular. Para o diagnóstico da sífilis, podemos utilizar:
 
Métodos diretos a partir de materiais coletados das lesões primárias
causadas por essa bactéria, que permite a visualização do treponema
vivo e móvel.
Pode ser feito com material fixado seguido de coloração (pelo método
de Fontana de Tribondeau), mas é de difícil visualização.
Pelos testes imunológicos para detecção de anticorpos-
antitreponêmicos (mais empregado).
VIBRIÕES
São móveis (locomovem-se com ajuda de flagelos) apresentam formato de
vírgula. Ex: Vibrio cholerae, também conhecido como vibrião colérico, é o
agente causador da cólera.
CITOLOGIA BACTERIANA
As bactériaspertencem ao grupo dos procariotos e, portanto, não possuem
membrana nuclear (carioteca), bem como não possuem todo o conjunto de
organelas das células eucarióticas. Entretanto, possuem elementos
estruturais de grande importância, como a parede celular, que pode ser
corada, permitindo o profissional da saúde identificar e diferenciar os
principais grupos de bactérias.
PAREDE CELULAR
Você sabe por que a parede celular é uma estrutura tão relevante para as
bactérias?
Ela é importante na divisão celular, é responsável pela forma, rigidez da
bactéria e confere proteção osmótica entre os meios externo e interno.
A parede celular possui uma espessura de, aproximadamente, 10 a 20 µm, é
porosa, permitindo a passagem de metabólitos para a membrana plasmática,
é formada por camadas rígidas de peptidoglicanos (mureína), e envolve a
membrana citoplasmática da maioria dos procariotos.
As bactérias são classificadas em gram-positivas ou em gram-negativas, de
acordo com a cor de sua parede celular após a realização da coloração de
Gram.
A divisão desses dois grupos de bactérias é essencial em um laboratório de
microbiologia clínica. A identificação microscópica de bactérias gram-
positivas ou gram-negativas, além de direcionar os testes de identificação,
também permitem que o médico inicie o tratamento empiricamente, antes
mesmo de sair o resultado da cultura e do antibiograma, que demora, no
mínimo, 48 horas.
BACTÉRIA GRAM-POSITIVA
Possui uma parede celular mais espessa, com múltiplas camadas de
peptideoglicanos (Figura 3), revestindo a membrana citoplasmática. Além
disso, possui outros componentes, como os:
ÁCIDOS TEICOICOS
ÁCIDOS LIPOTEICOICOS
ÁCIDOS TEICOICOS
Polímeros de fosfato de poliol, ligados covalentemente ao peptideoglicano,
essenciais para a viabilidade da célula e considerados fatores importantes na
virulência.
ÁCIDOS LIPOTEICOICOS
Possuem um ácido graxo e estão ancorados na membrana plasmática. São
considerados antígenos de superfície, permitem a distinção dos sorotipos
bacterianos e a aderência nas superfícies das células hospedeiras.
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VIRULÊNCIA
A capacidade de um microrganismo de produzir danos que são fatais
ou graves, podendo levar ao óbito (diferente de Patogenicidade que é a
capacidade de uma bactéria de desenvolver uma doença (dano) em um
determinado organismo). São exemplos de fatores de virulências:
capacidade de multiplicar, produção de toxinas, produção de proteínas
e enzimas que auxiliam a fuga dos mecanismos de defesa do
organismo, dentre outros.
Dentre as bactérias gram-positivas, temos as que são partes da microbiota
normal do organismo e que, geralmente, não causam doenças e temos
aquelas que são patogênicas, causando difteria, carbúnculo, listeriose,
septicemia, pneumonia, entre outros tipos de infecção.
Fonte: Designua/Shutterstock
 Figura 3 - Estrutura básica da parede celular gram-positiva.
BACTÉRIA GRAM-NEGATIVA
Apresenta a parede celular com uma estrutura mais complexa e,
quimicamente, diferente quando comparada à parede celular de gram-
positiva (ver Figura 4). Esta parede celular é composta de uma fina camada
de peptideoglicanos (5-10% do peso da parede celular) e externamente a
esta fina camada, encontramos uma membrana externa.
 ATENÇÃO
1) O espaço entre membranas é conhecido como espaço periplasmático.
2) A membrana externa está presente apenas nas bactérias gram-negativas.
MEMBRANA EXTERNA
A membrana externa além de manter a estrutura bacteriana é uma barreira
de permeabilidade, confere proteção contra condições ambientais adversas,
como as do sistema digestivo do hospedeiro e resistência a alguns
antimicrobianos como a penicilina. Essa membrana é formada por uma dupla
camada lipídica, onde a camada interna é constituída basicamente de
fosfolipídios e a camada externa possui uma molécula anfipática, o
lipopolissacarídeo (LPS) ou endotoxina e proteínas.
O LPS é essencial para a viabilidade das bactérias, funciona como um
potente indutor de respostas imunológicas, ativando linfócitos B e induzindo
a produção de citocinas por macrófagos, células dendríticas e outras células.
Por outro lado, provoca febre e pode causar choque endotoxêmico, sendo
chamado também de endotoxina. As proteínas permitem a difusão de
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metabolitos pequenos, antibióticos hidrofílicos, têm função estrutural e atuam
como receptoras para bacteriófagos e outros ligantes.
LPS
O LPS é composto de três secções estruturais: o Lipídeo A, o núcleo
polissacarídeo e o antígeno O. O lipídeo A é responsável pelos efeitos
tóxicos do LPS.
As bactérias gram-negativas podem causar uma série de infecções graves
nos seres humanos, como peritonite, pneumonia, infecções urinárias,
meningite, dentre outras. É importante ressaltar que essas bactérias estão
cada vez mais resistentes aos antimicrobianos disponíveis para utilização
terapêutica.
Fonte: Designua/Shutterstock
 Figura 4 - Estrutura básica da parede celular Gram-negativa.
 ATENÇÃO
Exceções bacterianas
 
1) Micobactérias: Bacilos que apresentam a camada de peptideoglicanos da
parede celular com estrutura um pouco diferente, pois é formada por
polímeros de arabinogalactano e revestida por uma capa lipídica cerosa de
ácidos micólicos. Devido ao caráter hidrofóbico da parede celular destas
bactérias, a coloração pelo método de Gram não é a de escolha quando se
deseja pesquisar esse tipo de bactéria. No entanto, elas poderão ser
diferenciadas pela característica de álcool-ácido resistência (coloração de
Ziehl Neelsen). Exemplo. Mycobacterium tuberculosis (bacilo da
tuberculose). (Figura 5).
Fonte: Wikimedia
 Figura 5 - Estrutura da parede celular de micobactérias.
2) Micoplasmas: São as menores bactérias encontradas na natureza (cerca
de 0,3 µm), não apresentam parede celular e incorporam esteróis do
hospedeiro em sua membrana (Figura 6). O Mycoplasma pneumoniae é um
agente causador comum de pneumonia.
ESTERÓIS
Esteróis conferem a membrana celular fluidez e permeabilidade. Essas
moléculas estão presentes na maioria das células eucariotas, na forma
de colesterol.
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Fonte: Designua/Shutterstock
 Figura 6: Citologia do Micoplasma.
MEMBRANA CELULAR OU MEMBRANA
CITOPLASMÁTICA BACTERIANA
A membrana citoplasmática das bactérias é semipermeável, seletiva, contém
várias enzimas, limita o citoplasma, é constituída de fosfolipídios e proteínas
e, portanto, considerada semelhante à membrana plasmática dos
organismos eucarióticos, exceto pelo fato de não possuírem esteróis.
Citoplasma: O citoplasma da célula bacteriana pode ser dividido em
diferentes regiões:
Citoplasmática: rica em RNA; partículas proteicas e ribossomos
(responsáveis pela síntese proteica).
Cromatínica: rica em DNA circular dupla fita.
Porção fluída, com nutrientes dissolvidos.
 ATENÇÃO
Algumas bactérias, como o Vibrio cholerae, podem possuir mais de um DNA;
e outras, como a Borrelia burgdorferi, possuem um DNA linear).
ELEMENTOS ACESSÓRIOS
São estruturas que podem estar ou não presentes em determinadas
bactérias. Vários desses elementos acessórios são importantes na virulência,
patogenicidade e resistência bacteriana.
Fonte: Wikipedia
 Estrutura celular bacteriana.
GLICOCÁLICE
O glicocálice consiste em um revestimento de polissacarídeos. Quando o
glicocálice apresenta estrutura uniforme e encontra-se firmemente aderido à
parede celular é denominado de cápsula. Quando as camadas de
polissacarídeos possuem pouca aderência e apresentam espessura não
uniforme, são chamadas de camada viscosa. Essa estrutura, além de
fornecer um envoltório protetor, evita a fagocitose pelas células de defesa do
organismo, atua como reservatório de nutrientes e, principalmente, auxilia na
aderência bacteriana a algumas superfícies. Exemplo: o Streptococcus
mutans, que através da cápsula fixa e perfura o esmalte dentário.
A determinação dos constituintes da cápsula é fundamental na identificação
de certas bactérias patogênicas,uma vez que algumas cápsulas são
compostas de polipeptídios, ao invés de polissacarídeos, como ocorre com o
Bacillus anthracis (agente do carbúnculo/ antrax).
PLASMÍDEO
Corresponde a um DNA circular extracromossomal, capaz de se replicar de
forma autônoma, localizado no citoplasma da célula bacteriana e que não é
responsável por características essenciais da bactéria. Podem se apresentar
em várias cópias, além de possuir a capacidade de conferir vantagens
adaptativas (por exemplo, resistência a antibióticos), podendo, inclusive, ser
transferidos para outras bactérias.
GRÂNULOS OU INCLUSÕES
CITOPLASMÁTICAS
São grânulos cuja função é de armazenamento, podendo ser de glicogênio,
amido, fosfatos, enxofre etc. e podem ser visualizados através de colorações
especiais, pois, geralmente, são refringentes.
FLAGELOS
São estruturas de locomoção presentes em algumas bactérias, formadas por
subunidades proteicas acopladas na forma helicoidal (flagelina) e que
permitem às bactérias “irem” em busca de nutrientes ou fugir de substâncias
tóxicas. O flagelo fica ancorado na membrana citoplasmática através do seu
corpo basal (similar a um gancho), possui um comprimento geralmente muito
maior que o da célula, e podem ser únicos ou múltiplos, polares (apenas nas
extremidades) ou peritríquios (em todo corpo bacteriano). Embora os flagelos
não possam ser visualizados, normalmente, no microscópio óptico, existem
técnicas de coloração que os tornam visíveis no microscópio óptico e os
microbiologistas usam como auxílio no diagnóstico.
Durante a identificação de uma bactéria, a avaliação da motilidade pode ser
utilizada para diferenciar espécies de bactérias. Exemplo: Em uma cultura de
fezes (coprocultura), a presença de bactérias gram-negativas imóveis é
indicativa de Shigella sp. e móveis de Salmonella sp.
PILI E FÍMBRIAS
As fímbrias são estruturas filamentosas, que lembram fios de cabelo no lado
de fora da bactéria, compostas por subunidades proteicas (pilina), que se
projetam a partir da superfície de uma célula e, geralmente, estão em maior
quantidade do que os flagelos. As fímbrias auxiliam na colonização das
membranas de mucosas como ocorre no caso da Neisseria gonorrhoeae,
agente causador da gonorreia e, no caso da E. coli, nas células do trato
urinário. Os pili sexuais de uma bactéria se ligam a outras bactérias
permitindo a transferência de material genético na conjugação bacteriana.
Esse pili sexuais são codificados por um plasmídeo.
ESPOROS (ENDOSPOROS)
Produzidos por alguns gêneros de bactérias, como Bacillus e Clostridium, os
esporos são uma estrutura resistente a agentes físicos e químicos, que é
formada em resposta ao meio ambiente, quando este se torna inadequado
para a sobrevivência da bactéria (ex.: escassez de água ou nutrientes). A
resistência da forma esporulada possibilita que a bactéria sobreviva por
longos anos em ambientes desfavoráveis, podendo reverter à forma
vegetativa quando o local se tornar viável novamente para sua sobrevida.
Cada célula forma um único esporo, que é liberado quando a bactéria morre.
FATORES DE VIRULÊNCIA E
PATOGENICIDADE DE BACTÉRIAS
FASES DE CRESCIMENTO E
FATORES QUE AFETAM O
CRESCIMENTO BACTERIANO
As bactérias, quando inoculadas em meio de cultura adequado e em
condições apropriadas, iniciam processo de duplicação bacteriana, no qual
por divisão binária, ocorre aumento da população de forma logarítmica. O
tempo de geração, ou seja, o tempo necessário para que uma bactéria se
duplique varia de acordo com a espécie bacteriana, podendo ser
extremamente curto (E. coli ± 15 minutos) ou bastante longo (M. tuberculosis
± 932 minutos).
 SAIBA MAIS
Para uma cultura de micobactéria ser considerada negativa, temos que
esperar, no mínimo, 45 dias de incubação e não ser visualizado nenhum
crescimento.
Compreender que o crescimento bacteriano em um meio de cultura
apresenta 4 fases, cada uma com suas características peculiares, é de
extrema importância para a escolha do meio de cultura ideal e das técnicas
para isolar e identificar as bactérias em uma rotina laboratorial. Vamos
conhecer essas fases?
Fonte: Wikimedia
FASE LAG
FASE LOGARÍTMICA (FASE LOG OU
EXPONENCIAL)
FASE ESTACIONÁRIA OU FASE PLATÔ
FASE DE DECLÍNIO OU MORTE
FASE LAG
Quando bactérias são adicionadas a um meio de cultura (semeadas), elas
necessitam de um tempo para se adaptar ao novo ambiente antes de
começar a se dividir. Neste momento, não há reprodução e a população
permanece temporariamente inalterada. É importante ressaltar que, nesta
fase, as células não estão em latência, uma vez que aumentam no tamanho
e fisiologicamente estão muito ativas.
FASE LOGARÍTMICA (FASE LOG OU
EXPONENCIAL)
Nesta fase, as células iniciam a divisão que ocorre de forma exponencial,
regular e constante. A velocidade de crescimento é máxima nesta fase, e
varia de acordo com a cepa e com as condições ambientais.
FASE ESTACIONÁRIA OU FASE PLATÔ
Em determinando momento do crescimento bacteriano, haverá carência de
nutrientes e produção de substâncias tóxicas no meio, dessa forma, o
número absoluto de bactérias no meio de cultura permanecerá constante,
resultado do equilíbrio entre bactérias que ainda estão se duplicando e
bactérias que estão morrendo.
FASE DE DECLÍNIO OU MORTE
Etapa que ocorre morte bacteriana, pois há falta de nutrientes e de espaço,
aliada à toxidez do ambiente que levam os microrganismos a morrerem mais
rápido do que produzirem novas células (a morte bacteriana nesta fase se
dará de forma exponencial ou logarítmica). Sendo assim, há uma progressiva
morte celular até a cultura se tornar estéril.
FATORES AMBIENTAIS QUE AFETAM O
CRESCIMENTO BACTERIANO
Além de nutrientes apropriados, é necessário conhecer as condições físicas
ambientais ideais para o crescimento bacteriano em meio de cultura. Dentre
estes, os principais fatores são:
TEMPERATURA
A temperatura ótima de crescimento é aquela que possibilita o maior
crescimento, durante o menor tempo e varia para cada gênero. As bactérias,
no geral, são classificadas de acordo com sua temperatura ótima de
crescimento em:
BACTÉRIAS PSICRÓFILAS
Crescem melhor de 12°C e 20°C.
BACTÉRIAS MESÓFILAS
Crescem melhor de 25°C a 40°C. Neste grupo, está a maioria dos patógenos
bacterianos de importância clínica, já que nesta faixa encontra-se a
temperatura do corpo humano.
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BACTÉRIAS TERMÓFILAS
Crescem melhor de 45°C a 60°C.
 SAIBA MAIS
A temperatura de crescimento também pode ser usada durante a
identificação bacteriana. Exemplo: A N. gonorrhoeae e N. Meningitis não
crescem na temperatura de 22°C, mas as outras espécies de Neisseria sp.
são capazes de crescer.
OXIGÊNIO
As bactérias podem ser divididas de acordo com a necessidade e a
tolerância ao oxigênio:
BACTÉRIAS AERÓBIAS ESTRITAS
Só crescem na presença de oxigênio. Ex.: Acinetobacter sp.
BACTÉRIAS ANAERÓBIAS FACULTATIVAS
Crescem tanto na presença quanto na ausência de oxigênio. Ex.: E. coli.
BACTÉRIAS MICROAERÓFILAS
Só crescem em ambiente contendo baixas concentrações de oxigênio
(menores que as encontradas no ar atmosférico). Ex.: Campylobacter sp.
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BACTÉRIAS ANAERÓBIAS ESTRITAS
Só conseguem crescer na ausência de oxigênio. Em contato com O2, o
crescimento dessas bactérias é inibido ou ocorre morte bacteriana. Ex.:
Clostridium botulinum e Neisseria sp.
 SAIBA MAIS
Quanto às espécies de Neisseria, o ideal é semear imediatamente após a
coleta em meio sólido, levar para a estufa 36 °C em jarra com vela ou com
gerador de CO2 e umidade.
PH
Normalmente, a grande maioria das bactérias cresce bem em meios com pH
neutro, em torno de 6,5 a 7,5, apesar de muitas espécies tolerarem variações
de pH entre 4,0 e 9,0. Os meios de cultura geralmente são tamponados para
impedir mudanças bruscas de pH, decorrentes do próprio metabolismo das
bactérias.
PRESSÃO OSMÓTICA
A pressão osmótica é a pressão quedeve ser exercida sobre um sistema
para evitar que a passagem de água por osmose, ou seja, para o meio mais
concentrado ocorra. A parede celular, além da rigidez, impede a entrada
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excessiva de água. Dessa forma, a pressão osmótica dos meios de cultura
pode afetar diretamente a viabilidade das bactérias. Meios de cultura com
pressões osmóticas menores comparado ao interior da bactéria,
normalmente, não afetam sua viabilidade. De forma diferente, meios de
cultura com pressões osmóticas maiores causam perda de água intracelular,
trazendo efeito bacteriostático ou bactericida.
BACTERIOSTÁTICO
Bacteriostáticos são substâncias que inibem o crescimento e a
reprodução bacteriana sem provocar sua morte imediata, sendo
reversível o efeito, uma vez retirada a droga.
BACTERICIDA
Bactericidas são substâncias capazes de matar ou lesar
irreversivelmente as bactérias.
 SAIBA MAIS
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Halofismo - Certas bactérias isoladas de salmouras, pacotes de sal,
alimentos e água do mar, chamadas bactérias halofílicas ou halófitas
obrigatórias, crescem apenas quando o meio contém uma concentração
inusitadamente elevada de sal (10% a 15%). Isto representa uma resposta
especial do microrganismo à pressão osmótica.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. (ADAPTADA DE IF RS -2018). AS POPULAÇÕES
BACTERIANAS SEGUEM UMA SÉRIE DE FASES DE
CRESCIMENTO: LAG, LOGARÍTMICA OU EXPONENCIAL,
ESTACIONÁRIA E DE DECLÍNIO OU MORTE CELULAR.
ANALISE AS ASSERTIVAS ABAIXO: 
 
I. A POPULAÇÃO REDUZ SEGUINDO TAXA LOGARÍTMICA. 
II. OCORRE AUMENTO EXPONENCIAL DA POPULAÇÃO. 
III. HÁ INTENSA ATIVIDADE DE PREPARAÇÃO PARA O
CRESCIMENTO POPULACIONAL, MAS SEM AUMENTO DA
POPULAÇÃO BACTERIANA. 
IV. AS MORTES MICROBIANAS SÃO EQUILIBRADAS PELA
PRODUÇÃO DE NOVAS CÉLULAS. 
 
ASSINALE ÚNICA ALTERNATIVA CORRETA QUE
RELACIONA CORRETAMENTE AS ASSERTIVAS I, II, III E IV.
COM AS FASES LAG, LOG, ESTACIONÁRIA E DE MORTE
CELULAR:
A) Declínio (I), Log (II), Lag (III), Estacionária (IV)
B) Estacionária (I), Lag (II), Log (III), Declínio (IV)
C) Estacionária (I), Log (II, Lag (III), Declínio (IV)
D) Declínio (I), Lag (II), Log (III), Estacionária (IV)
2. APRENDEMOS QUE A CITOLOGIA BACTERIANA PREVÊ
ALGUNS COMPONENTES BACTERIANOS COMO
OBRIGATÓRIOS E OUTROS COMO ELEMENTOS
ACESSÓRIOS, PODENDO OU NÃO ESTAR PRESENTES EM
ALGUNS GRUPOS DE BACTÉRIAS E QUE,
FREQUENTEMENTE, ESTÃO ASSOCIADOS À VIRULÊNCIA,
PATOGENICIDADE, MOTILIDADE, ENTRE OUTRAS
FUNÇÕES. ASSINALE A AFIRMATIVA ABAIXO QUE
CONTENHA APENAS EXEMPLOS DE ELEMENTOS
ACESSÓRIOS BACTERIANOS.
A) Parede Celular, Ribossomos, Glicocálice e Fímbrias sexuais.
B) Glicocálice, Plasmídeos, Flagelos e Ribossomos.
C) Plasmídeos, Grânulos citoplasmáticos, Citoplasma e Endosporos.
D) Pili, endósporos, Plasmídeos e Glicocálice.
GABARITO
1. (Adaptada de IF RS -2018). As populações bacterianas seguem uma
série de fases de crescimento: lag, logarítmica ou exponencial,
estacionária e de declínio ou morte celular. Analise as assertivas
abaixo: 
 
I. A população reduz seguindo taxa logarítmica. 
II. Ocorre aumento exponencial da população. 
III. Há intensa atividade de preparação para o crescimento populacional,
mas sem aumento da população bacteriana. 
IV. As mortes microbianas são equilibradas pela produção de novas
células. 
 
Assinale única alternativa CORRETA que relaciona corretamente as
assertivas I, II, III e IV. com as fases lag, log, estacionária e de morte
celular:
A alternativa "A " está correta.
 
A fase em que a população é reduzida de forma logarítmica – declínio. A
fase de aumento exponencial da população – log. A fase de preparação para
o crescimento populacional, mas sem aumento da população é a lag. A fase
onde ocorre equilíbrio entre as mortes microbianas e a produção de novas
células é a estacionária.
2. Aprendemos que a citologia bacteriana prevê alguns componentes
bacterianos como obrigatórios e outros como elementos acessórios,
podendo ou não estar presentes em alguns grupos de bactérias e que,
frequentemente, estão associados à virulência, patogenicidade,
motilidade, entre outras funções. Assinale a afirmativa abaixo que
contenha apenas exemplos de elementos acessórios bacterianos.
A alternativa "D " está correta.
 
Dentre os elementos acessórios estudados neste módulo, temos:
plasmídeos, grânulos citoplasmáticos, fímbrias, glicocálice, esporos e
flagelos. Já os componentes obrigatórios, temos: as membranas celulares, a
parede celular (exceção dos micoplasmas), material genético e ribossomos.
MÓDULO 2
 Reconhecer os tipos de meios de cultura, bem como os testes de
sensibilidade aos antimicrobianos
MEIOS DE CULTURA:
COMPOSIÇÃO E CLASSIFICAÇÃO
Os meios de cultura são capazes de fornecer os nutrientes necessários
para o crescimento e desenvolvimento de microrganismos fora do seu habitat
natural. Os meios de cultura apresentam em sua composição diferentes
macronutrientes (carbono, oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo e hidrogênio)
e micronutrientes (ferro, zinco, manganês, cálcio, potássio, sódio, cobre,
cloro, cobalto, molibdênio, selênio, magnésio, entre tantos outros),
necessários à síntese biológica de novos organismos. Nos laboratórios
clínicos, os meios de cultivo podem ser comprados totalmente prontos ou
então serem preparados.
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Fonte: angellodeco/Shutterstock
MEIO DE CULTURA
É qualquer substância, sólida, semissólida ou líquida que possua um
conjunto de fontes de nutrientes e que seja utilizada para o cultivo de
microrganismos.
Após a coleta de uma amostra biológica, destinada para a cultura e/ou
antibiograma, essa será semeada em meios de culturas capazes de suprir as
bactérias com as exigências nutricionais mínimas, dentro das condições
ambientais necessárias para o cultivo, possibilitando o crescimento
microbiano e a formação e visualização de colônias.
Durante a semeadura de uma amostra biológica, por exemplo, o líquor, em
casos de suspeita de meningite, deve-se conhecer os principais agente
etiológicos dessa doença para escolher os meios apropriados (com
nutrientes específicos e pH), as condições ideais de crescimento, como a
presença e quantidade de oxigênio ou até mesmo a sua ausência. Todos
esses aspectos são essenciais para auxiliar na identificação bacteriana e na
conclusão diagnóstica.
Vamos juntos conhecer um pouco mais sobre a classificação dos meios de
culturas.
CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE
CULTURA
Os meios de cultura são classificados a partir do seu estado físico, da sua
composição e do seu objetivo de utilização.
Fonte: SomprasongWittayanupakorn/Shutterstock
 Microbiologista cultivando bactéria em uma placa de Petri contendo meio
de cultura.
1) DE ACORDO COM O SEU ESTADO
FÍSICO:
Você provavelmente já preparou gelatina na sua casa, correto? Lembra da
sua consistência?
Para obtermos diferentes consistências nos meios de cultura, adicionamos
ágar-ágar, um polissacarídeo complexo obtido de alga marinha vermelha e
que atua como agente solidificante, muito semelhante à maneira como a
gelatina é utilizada na sua cozinha.
É válido lembrar que, para obtenção de um meio de cultura ideal contendo
ágar, deve-se, após sua adição, aquecer a solução para dissolver o ágar em
água fervente até a solução ficar homogênea. Entretanto, não devemos
ferver ou aquecer a solução diversas vezes, pois podemos provocar
alteração no valor nutritivo, no percentual de água e outros parâmetros que
interferiam no crescimento.
 
Fonte: Yayah_Ai/Shutterstock
MEIOS SÓLIDOS 
Obtidos a partir da adição de 1,0 g a 3,0 g % de ágar. A maioria dos
microrganismos crescem formando colônias. Ex: Ágar nutritivo.
 Exemplo de preparação de meio de cultivo sólido. Após preparo,
autoclavagem, o meio é depositado nas placas para solidificar, em ambiente
estéril.
 
Fonte: MyFavoriteTime/Shutterstock
MEIOS SEMISSÓLIDOS 
Obtidos, na maioria das vezes, após adição de 0,1 g a 0,7 g %”, separando o
0,7 de g. Dentre as finalidades, temos a visualizaçãoda motilidade
bacteriana ou, muitas vezes, servir como base de meio de transporte. Ex:
Meio SIM (meio de detecção da produção de enxofre, motilidade e produção
de indol) e Cary & Blair.
 Exemplo de Meio semi-sólido (SIM) mostrando uma bactéria que não
apresenta motilidade.
 
Fonte: NonSitth/Shutterstock
MEIOS LÍQUIDOS 
Não apresentam ágar, são conhecidos como “caldos” e utilizados para
ativação das culturas, repiques de microrganismos, provas bioquímicas,
dentre outros. Ex: caldo tetrationato e selenito-cistina para cultivo de
salmonelas, caldo tioglicolato para Clostridium perfringens.
 Meios de culturas líquidos
2) DE ACORDO COM A COMPOSIÇÃO
QUÍMICA
MEIOS QUIMICAMENTE DEFINIDOS
MEIOS COMPLEXOS
MEIOS QUIMICAMENTE DEFINIDOS
A composição química de todos os seus constituintes é conhecida
(definidos). Ex: Meio AR-103.
MEIOS COMPLEXOS
A exata constituição do meio de cultura não é conhecida. Esses meios
apresentam em sua composição soro, sangue, extratos moídos ou digeridos
de órgãos animais (corações, fígados, cérebros), peixes, leveduras, e
vegetais ou outro componente que não se tem total conhecimento da
composição química. Ex: Ágar sangue.
3) DE ACORDO COM O OBJETIVO DA
UTILIZAÇÃO
MEIOS ENRIQUECIDOS OU RICOS
São os meios que contêm um grande suprimento de nutrientes pela adição
de diversas substâncias como sangue, soro, extratos de tecidos animais ou
vegetais ao caldo ou até mesmo ágar nutritivos, para permitir o crescimento
de bactérias fastidiosas (nutricionalmente exigentes), como Haemophilus
spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp.
 EXEMPLO
O ágar-sangue (ágar nutriente com 5% de eritrócitos de carneiro) e o ágar-
chocolate (ágar nutriente com hemoglobina em pó) são exemplos de meios
enriquecidos utilizados de forma rotineira nos laboratórios de bacteriologia
clínica.
 
Fonte: Jarun Ontakrai/Shutterstock
 Colônias de bactérias crescidas em meio ágar sangue
MEIOS SELETIVOS
São meios que apresentam em sua composição substâncias químicas
específicas (inibidores) adicionadas ao caldo ou ao ágar nutritivo que
previnem o crescimento de um determinado grupo de bactérias. É importante
ressaltar que os inibidores atuam em um grupo específico de bactéria,
favorecendo apenas o crescimento da bactéria de interesse.
 EXEMPLO
O ágar MacConkey é um meio seletivo pois tem em sua composição sais
biliares e cristais violeta que inibe o crescimento da maioria das bactérias
gram-positivas, permitindo o crescimento apenas das bactérias gram-
negativas.
MEIOS DIFERENCIAIS OU INDICADORES
Contêm certos reagentes ou substâncias no meio que permitem a distinção
de diferentes tipos de bactérias.
 EXEMPLO
O Ágar MacConkey, além de um meio de cultura seletivo, é, frequentemente,
utilizado para diferenciar bacilos gram-negativos isolados de amostras fecais.
As bactérias gram-negativas que fermentam a lactose (um ingrediente do
ágar MacConkey) produzem colônias rosas (Figura 7A), como E. coli,
enquanto aquelas incapazes de fermentar a lactose produzem colônias
incolores e amarelas (Figura 7B), como Acinetobacter baumanii.
COLÔNIAS ROSAS
Bactérias gram-negativas que fermentam a lactose crescem produzindo
colônias rosas.
Fonte: NonSitth/Shutterstock
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Fonte: REJO JACOB JOSEPH/Shutterstock
 Figura 7 - Diferença da coloração das colônias de bactérias gram-
negativas fermentadoras e não fermentadoras de lactose em Agar
MacConkey.
Agora que você conheceu esse meio de cultura, imagina por que temos essa
diferença?
Como mencionado anteriormente, a lactose é um nutriente presente no Ágar
MacConkey e, além desse nutriente, o meio apresenta um indicador de pH
(que permite a alteração da coloração do meio de acordo com o pH).
Bactérias que são capazes de metabolizar a lactose produzem ácidos mistos
que alteram o pH do meio que fica com uma cor rosa/ avermelhado. De
forma diferente, as bactérias que não fermentam a lactose, utilizam como
fonte de energia a peptona. A peptona, ao ser metabolizada, produz amônia,
que eleva o pH do meio e torna as colônias e o meio amarelados/ sem cor.
 EXEMPLO
Outro exemplo de meio seletivo é o ágar manitol salgado. Esse meio de
cultivo é composto de manitol e alta concentração de sal (7,5% de NaCL). Na
rotina laboratorial ele é utilizado para o isolamento de Staphylococcus aureus
a partir de diferentes amostras biológicas. Todas as espécies de
Staphylococcus são capazes de crescer nesse meio, mas o S. aureus é
capaz de fermentar o manitol presente no meio, produzindo ácido, que torna
o meio e as colônias amareladas. As outras espécies de estafilococos, como
os Staphylococcus epidermidis e o Bacillus subtillis não metabolizam o
manitol, apresentando assim colônias brancas.
 
Fonte: OneMashi/Shutterstock
 S.aureus e S.epidermidis cultivadas em ágar manitol.
MEIOS DE TRANSPORTE
Geralmente, são semissólidos e possuem o mínimo de nutrientes para a
manutenção das bactérias, durante o tempo de transporte, sem que estas se
reproduzam ou acidifiquem o meio. Atualmente, para auxiliar na coleta de
algumas amostras biológicas destinadas à cultura e à antibiograma, como
secreções vaginais, é utilizado um Swab. Após a coleta, eles são
armazenados em um tubo que contém o meio de transporte (ex: meio Stuart
– permite uma boa conservação de bactérias patogênicas como Salmonella
spp. e Shigella spp.)
SWAB
Fonte: MedstockPhotos/Shutterstock
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 Swab com meio de transporte que pode ser usado para coleta
de amostras de secreção vaginal.
TESTE DE SENSIBILIDADE AOS
ANTIMICROBIANOS (TSA)
Uma tarefa importante do laboratório de microbiologia clínica é a realização
de testes de sensibilidade aos antimicrobianos a partir de isolados
bacterianos. Os objetivos dos testes são detectar uma possível resistência
aos antibióticos em patógenos comuns, nortear a escolha do antibiótico mais
adequado a fim de predizer o sucesso do esquema terapêutico para
infecções específicas.
Os testes usados incluem macrodiluição em tubos, microdiluição em caldo e
o método de disco difusão. O método de disco difusão fornece flexibilidade e
apresenta baixo custo. Cada método tem pontos fortes e fracos, incluindo
organismos que podem ser testados com precisão pelo método. Alguns
métodos fornecem resultados quantitativos (por exemplo, concentração
inibitória mínima) e todos fornecem avaliações qualitativas usando as
categorias de suscetível, intermediário ou resistente.
 
Fonte: aslysun/Shutterstock
Em geral esses métodos são recomendados para ajudar a direcionar o
tratamento do paciente. É importante ressaltar que a detecção precisa dos
mecanismos de resistências das bactérias são utilizados para fins
epidemiológicos e medidas de contenção destas bactérias resistentes.
Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (2008): o TSA é sempre
realizado na avaliação das seguintes bactérias:
Enterobactérias
Pseudomonas spp.
Acinetobacter spp.
Staphylococcus spp.
Enterococcus spp.
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus do grupo viridans e beta-hemolítico
Haemophilus influenzae
Complexo Burkholderia cepacia
Stenotrophomonas maltophilia
Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis
 ATENÇÃO
A padronização das etapas relacionadas à realização dos TSA (da escolha
dos antibióticos até a interpretação dos resultados) é feita por organizações
especializadas, que elaboram documentos, os quais apresentam com
riqueza de detalhes como realizar e interpretar os testes de sensibilidade.
Tais organizações são:
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, EUA)
European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST,
Europa)
Brazilian Committee on Antimicrobial Susceptibility testing (BrCAST,
Brasil)
British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC, Reino Unido)
Comité de L’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie
(CA-SFM, França)
A seguir, verificaremos as diferentes técnicas empregadas na realizaçãodos
TSA, trazendo algumas de suas vantagens e desvantagens.
Independentemente da técnica escolhida pelo laboratório de microbiologia,
todas as etapas devem ser rigorosamente controladas. O bom emprego do
controle de qualidade é a melhor forma de garantir a confiabilidade e
reprodutibilidade dos resultados. Além disso, deve ser feito seguindo as
normas de biossegurança.
MACRODILUIÇÃO EM TUBOS
Um dos primeiros testes de susceptibilidade antimicrobiana desenvolvido foi
a macrodiluição em tubos. Este procedimento envolve:
Preparar diluições seriadas de antimicrobianos (por exemplo, 1, 2, 4, 8
e 16 microgramas/mL) em meio de cultura líquido.
Inocular os tubos contendo antimicrobianos com uma suspensão
bacteriana padronizada em torno de 5 X 105 UFC (Unidade Formadora
de Colônia ) /mL.
Incubar por de 18 a 24 horas, a 35°C.
Examinar a presença de turbidez, que evidencia o crescimento
microbiano. O primeiro tubo da série que apresentar aparência límpida
(sem turbidez) representa a concentração inibitória mínima (CIM ou
MIC).
CIM OU MIC
A sensibilidade dos microrganismos aos antimicrobianos é
representada pela concentração inibitória mínima (CIM ou MIC) de
cada microrganismo para cada antimicrobiano, que corresponde à
menor concentração do antimicrobiano capaz de inibir o
desenvolvimento visível do microrganismo.
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Fonte: ANVISA
 Macrodiluição em tubos. Nesse exemplo está ilustrado um antibiótico
testado nas concentrações 0, 0,25, ,0,5, 1, 2 4 e 8 µg/mL.
A vantagem da macrodiluição em tubo é a geração de um resultado
quantitativo (CIM ou MIC). As desvantagens correspondem ao trabalho
manual que leva a possibilidade de erros durante o preparo de soluções de
antibióticos para cada antibiótico testado, a quantidade relativamente grande
de reagentes e o espaço necessário para cada teste.
MICRODILUIÇÃO EM CALDO
A técnica de microdiluição em caldo é a técnica de macrodiluição, realizada
em placas estéreis de 96 poços. Essa adaptação tornou esse teste mais
prático e popular. A seguir, o passo a passo desta técnica:
PASSO 1
PASSO 2
PASSO 3
PASSO 4
PASSO 1
Preparar diluições seriadas de antimicrobianos (até 8 diluições logarítmicas)
de até 12 antimicrobianos.
PASSO 2
Inocular as bactérias a serem testadas obtendo-se uma concentração
bacteriana final de aproximadamente 5 x 104 - 105 UFC/mL por poço.
PASSO 3
Incubar as placas (também chamadas de painéis) de microdiluição a 35 ±
2ºC por 18 a 24 horas (dependendo do gênero bacteriano e do
antimicrobiano testado).
PASSO 4
Realizar a leitura da placa visualmente e, de preferência, com luminosidade
ambiente, para facilitar a leitura, observando a turbidez.
 SAIBA MAIS
Poucos laboratórios de microbiologia clínica preparam suas próprias placas.
Normalmente, os laboratórios compram painéis, com os antibióticos já
liofilizados ou congelados nas diluições necessárias, de fornecedores
comerciais. Além disso, alguns laboratórios clínicos utilizam a metodologia
automatizada, que realiza essa análise através do MIC.
Vantagens do procedimento de microdiluição incluem a geração de um
resultado quantitativo (CIM ou MIC), a reprodutibilidade dos resultados, a
conveniência de poder utilizar painéis pré-preparados, e a economia de
reagentes e espaço que ocorre devido à miniaturização do teste. A geração
de relatórios computadorizados também é possível se um leitor de painel for
utilizado. A principal desvantagem do método de microdiluição é a
inflexibilidade das seleções de drogas disponíveis em painéis comerciais
padrão, além do custo de cada placa de microdiluição.
PROVA DE SENSIBILIDADE COM
DISCOS DE PAPEL EM MEIO SÓLIDO
O teste de disco-difusão em ágar, também chamado de técnica de Kirby-
Bauer em homenagem aos microbiologistas que descreveram este teste em
1966, é um dos métodos de sensibilidade mais simples, prático, confiável e
mais utilizado nos laboratórios de microbiologia, fornecendo resultados
qualitativos. A seguir, o passo a passo desta técnica.
 
Fonte: eczserapyilmaz/Shutterstock
 Teste de disco-difusão em ágar.
TÉCNICA
Toda a etapa deve ser realizada de forma estéril, seguindo as normas
de biossegurança do laboratório.
Fonte do protocolo da técnica: (adaptado do NCCLS ‘M2-A8—
Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests;
Approved Standard—Eighth Edition (ISBN 1-56238-485-6). Cópias da
atual edição podem ser obtidas no seguinte endereço: NCCLS, 940
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West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898,
USA):
Vamos ao passo a passo:
Método do crescimento
PASSO 1
Após crescimento em placa de ágar (24 horas), selecionar de três a cinco
colônias, bem isoladas, do mesmo tipo morfológico. A superfície de cada
colônia é tocada com uma alça, e os microrganismos são transferidos para
um tubo contendo 4-5 mL de NaCL 0,9% (salina) estéril.
PASSO 2
Incuba-se a cultura na salina até alcançar a turbidez de uma solução padrão
de McFarland 0,5.
DEFINIÇÃO DE ESCALA DE
MACFARLAND:
Escala de nefelométrica de turvação. Essa é uma escala que possibilita
verificar a concentração bacteriana pela intensidade de turvação do
meio. Quanto maior a turvação do meio, maior a concentração
bacteriana, maior opacidade e mais difícil é a passagem de luz.
Essa escala é composta de 11 tubos numerados de 0,5 a 10, onde o
tubo 0,5 (indica uma concentração bacteriana de 1,0 a 2,0 x 108
colônias/mL. e o tubo 10 -30 x 108 colônias/mL). Ao preparar uma
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suspensão de bactérias para realização do antibiograma é feito a
comparação visual com os tubos padrão da escala. A leitura é feita a
olho nu utilizando um cartão de fundo branco com linhas pretas no
fundo, ou então através de um espectrofotômetro.
Fonte: Imagem adaptada
 Escala de MacFarland. Imagem adaptada.
Inoculação das placas de teste
PASSO 1
Após a preparação da suspensão bacteriana, mergulha-se um swab de
algodão estéril na suspensão. Essa etapa deve ser realizada em até 15
minutos após ajustar a turbidez da suspensão. O swab deve ser girado
várias vezes e apertado firmemente contra a parede interna do tubo, acima
do nível do líquido, o que ajuda a retirar qualquer excesso de inóculo no
swab.
PASSO 2
A superfície da placa de ágar Müeller-Hinton é inoculada esfregando o
swab em toda a superfície estéril do ágar. Repete-se o procedimento
esfregando outras duas vezes, girando a placa aproximadamente 60° cada
vez, a fim de assegurar a distribuição uniforme do inóculo. Após a
distribuição, passa-se um swab na margem de toda a placa de ágar,
completando pelo menos uma volta completa.
PASSO 3
A tampa pode ser deixada entreaberta de três a cinco minutos de maneira a
permitir que qualquer excesso de umidade seja absorvido antes de se aplicar
os discos impregnados de droga. No entanto, a placa não pode ultrapassar
15 minutos aberta.
Devemos evitar inóculos com alta concentração de bactérias. Nunca
devemos usar culturas em caldo, não diluídas, do dia anterior, ou outros
inóculos não padronizados para semear nessas placas.
ÁGAR MÜELLER-HINTON
Meio de cultura preconizado para os testes de sensibilidade da maioria
das bactérias de interesse médico.
Aplicação de discos a placas de ágar inoculadas
PASSO 1
O conjunto de antibióticos é previamente definido. Esses são discos de
papeis de filtros impregnados com concentrações definidas de antibióticos.
Os discos de antibióticos são colocados na superfície de placa de ágar
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anteriormente semeada, com auxílio de uma pinça ou com um dispensador.
Ao ser colocado, cada disco deve ser pressionado de maneira a assegurar o
contato completo do disco com a superfície de ágar. Os discos devem ser
distribuídos mantendo a distância entre os centros de pelo menos 24 mm.
Em geral, deve-se colocar 12 discos, no máximo, em uma placa de 150 mm,
ou cinco discos em uma placa de 100 mm.
Algumas drogas difundem-se quase instantaneamente quando em contato
com o meio. O disco não deve serreaplicado após ter entrado em contato
com a superfície de ágar. Em vez disso, coloque um novo disco em outra
parte da placa.
PASSO 2
As placas devem ser invertidas e colocadas em uma estufa, a 35° C, até 15
minutos após a aplicação dos discos. No entanto, no caso das cepas de
Haemophilus spp., N. gonorrhoeae e dos estreptococos, as placas não
devem ser incubadas em atmosfera enriquecida com CO2, porque os
padrões de interpretação foram estabelecidos usando incubação em ar
ambiente, e o CO2 irá alterar significativamente o tamanho dos halos de
inibição de alguns antibióticos.
Leitura das placas e interpretação dos resultados
PASSO 1
A leitura é realizada após 18 a 24 horas de incubação. Inicialmente,
analisamos a superfície da placa para verificar se a semeadura foi
satisfatória. Em seguida, os halos (diâmetros) devem ser medidos, em
milímetros, com auxílio de paquímetro ou uma régua. Para isso, a placa deve
ser invertida, e a régua ou o paquímetro apoiado na parte de trás da placa.
As medidas devem ser feitas contra uma fonte luminosa.
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FONTE LUMINOSA
Normalmente, o teste de sensibilidade das espécies de estreptococos é
feito adicionando sangue à base de ágar Müeller-Hinton . Nesse caso,
os halos deverão ser medidos a partir da superfície superior do ágar
iluminada com luz refletida, uma vez retirada a tampa. E não confundir
o halo de hemólise, característico nessas bactérias com halo de
inibição.
Se a placa foi satisfatoriamente semeada, e o inóculo era correto, os
halos de inibição resultantes serão uniformemente circulares e haverá
um tapete confluente de crescimento. Se colônias individuais forem
aparentes, o inóculo era demasiado leve e o teste deverá ser repetido.
O halo de inibição é a área sem crescimento detectável a olho nu.
Cuidado:
O crescimento de pequenas colônias, detectável apenas com lente de
aumento, na margem do halo de inibição do crescimento deve ser
ignorado.
Crescimento discreto de colônias dentro de um halo de inibição, o teste
deverá ser repetido com uma cultura ou subcultura pura de uma única
colônia, isolada da placa de cultura primária. Se pequenas colônias
continuarem a crescer no halo de inibição, o halo de inibição livre de
colônias deve ser medido.
PASSO 2
Com a medida de cada halo (diâmetro) a bactéria testada é classificada,
como sensível, intermediário, ou resistente em relação aos agentes
antimicrobianos testados, usando como comparação o tamanho dos halos
preconizados pelas organizações internacionais (CLSI, BSAC e BrCAST).
Vantagens desse método: Simplicidade do teste; não requer nenhum
equipamento especial; os resultados categóricos facilmente interpretados;
flexibilidade na seleção de discos para teste; baixo custo e de fácil execução.
Desvantagens: Teste manual, sem automação; não pode ser utilizado para
verificar a resistência a alguns microrganismos, pois falta padronização do
método.
Exemplo: Para avaliar o perfil de sensibilidade do S. pneumoniae versus
ceftriaxona, deve ser feito o teste do MIC (quantitativo). De acordo com o
CLSI (2018), esse método não pode ser mais utilizado para verificar o perfil
de sensibilidade da polimixina B nas bactérias gram negativas, pois a
polimixina apresenta baixa difusão no Agar, sendo preconizado a
microdiluição.
Qual é a acurácia aceitável de um teste de suscetibilidade?
Quando desejamos mediar a acurácia de um novo método de
suscetibilidade, é importante testar um número representativo de cepas
bacterianas resistentes a diferentes antibióticos e de cepas suscetíveis no
novo método de suscetibilidade e no método padronizado. A partir desses
resultados, conseguimos comparar e verificar se o método em estudo é
capaz de detectar as bactérias que são verdadeiramente resistentes e
sensíveis e determinar a taxa de erros que podem ser esperados em um
ambiente de laboratório clínico.
O surgimento de novos mecanismos de resistências antimicrobianas,
incluindo alguns que podem ser difíceis de detectar (por exemplo,
susceptibilidade intermediária à vancomicina em S. aureus e produção de
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carbapenemase em alguns organismos gram-negativos) requer que o
desempenho dos dispositivos de susceptibilidade seja constantemente
reavaliado e atualizado quando necessário.
ACURÁCIA
Refere-se ao grau em que o teste é capaz de determinar o verdadeiro
valor do que está sendo medido.
CARBAPENEMASE
Enzimas capazes de clivar os antibióticos da classe carbapenêmicos.
Em infecções por bactérias gram-negativas resistentes à grande
maioria dos antibióticos, os antibióticos carbapenêmicos (Imipinem e
Meropenem) representam a única escolha para o tratamento eficaz. No
entanto, nos últimos anos, algumas bactérias adquiriram resistência a
esses antibióticos, diminuindo assim a possibilidade terapêutica e a
necessidade de busca de novas drogas e métodos rápidos de
confirmação da resistência bacteriana.
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TESTE DE SENSIBILIDADE NA
PRÁTICA
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. APRENDEMOS QUE OS MEIOS DE CULTURA SÃO
COMPOSTOS DE NUTRIENTES NECESSÁRIOS PARA O
CULTIVO DE MICRORGANISMOS E PODEM SER
CLASSIFICADOS COMO SÓLIDOS, SEMISSÓLIDOS OU
LÍQUIDOS. ALÉM DISSO, ALGUNS MEIOS CONTÊM
SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS ESPECÍFICAS ADICIONADAS AO
CALDO OU AO ÁGAR NUTRITIVO QUE PREVINEM O
CRESCIMENTO DE UM DETERMINADO GRUPO DE
BACTÉRIAS SEM AGIR SOBRE OUTRO. ESSES MEIOS DE
CULTURA SÃO CHAMADOS DE:
A) Diferenciais
B) Seletivos
C) Enriquecidos
D) De transporte
2. ESTUDAMOS QUE O ANTIBIOGRAMA PERMITE A
IDENTIFICAÇÃO DA SENSIBILIDADE DE BACTÉRIAS
ISOLADAS A UM PAINEL DE ANTIBIÓTICOS. EM RELAÇÃO
AO TESTE DE SENSIBILIDADE DE DISCO-DIFUSÃO EM
ÁGAR, ASSINALE A AFIRMATIVA QUE CONTENHA UMA
VANTAGEM DESTE TESTE:
A) Pode ser feito de forma automatizada.
B) É um método quantitativo.
C) Flexibilidade quanto à escolha dos antimicrobianos.
D) Requer utilização de equipamentos especiais.
GABARITO
1. Aprendemos que os meios de cultura são compostos de nutrientes
necessários para o cultivo de microrganismos e podem ser
classificados como sólidos, semissólidos ou líquidos. Além disso,
alguns meios contêm substâncias químicas específicas adicionadas ao
caldo ou ao ágar nutritivo que previnem o crescimento de um
determinado grupo de bactérias sem agir sobre outro. Esses meios de
cultura são chamados de:
A alternativa "B " está correta.
 
Meios seletivos são os que contém substâncias que inibem o
desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos, permitindo o
crescimento de outros.
2. Estudamos que o antibiograma permite a identificação da
sensibilidade de bactérias isoladas a um painel de antibióticos. Em
relação ao teste de sensibilidade de disco-difusão em ágar, assinale a
afirmativa que contenha uma vantagem deste teste:
A alternativa "C " está correta.
 
O teste de sensibilidade de disco-difusão em ágar não pode ser feito de
forma automatizada, é um método qualitativo e não requer utilização de
equipamentos especiais. Entretanto, permite ao microbiologista uma ampla
escolha de antibióticos a serem utilizados, proporcionando, portanto,
flexibilidade quanto à escolha.
MÓDULO 3
 Distinguir os métodos de visualização e coloração na prática
laboratorial
INTRODUÇÃO
Vimos no módulo 1 que as características das células bacterianas, bem
como sua morfologia, são essenciais para entendermos e aplicarmos as
técnicas de coloração bacterianas. No entanto, uma vez que as bactérias são
seres microscópios, não podemos enxergá-las a olho nu, e necessitamos do
auxílio dos microscópios:
Óptico – permitem aumentos de até 1000 vezes.
Eletrônicos – permitem aumentos de 10.000 vezes (varredura) e
1.000.000 vezes (transmissão).
No dia a dia dos microbiologistas, a forma mais comum de se examinar os
microrganismos é utilizando técnicas associadas ao microscópio óptico.
 
Fonte: Konstantin Kolosov/Shutterstock
TODA BACTÉRIA PRECISA SER
CORADA PARA SER VISUALIZADA?
SIM NÃO
A RESPOSTA CORRETA É “NÃO”!
De uma maneira geral,as bactérias vivas podem ser observadas
quanto à forma e movimentos, a partir de material biológico em
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suspensão (uma gota) entre lâmina e lamínula (sem formar bolha). Esta
preparação é conhecida como a fresco e exige um bom manuseio do
microscópio por parte do microbiologista, uma vez que é necessário
fazer ajustes de intensidade da luz, regular bem o condensador, se
possível empregar filtros para uma melhora na qualidade da imagem a
ser visualizada e, geralmente, utilizar um microscópio de campo
escuro.
CORRETO!
De uma maneira geral, as bactérias vivas podem ser observadas
quanto à forma e movimentos, a partir de material biológico em
suspensão (uma gota) entre lâmina e lamínula (sem formar bolha). Esta
preparação é conhecida como a fresco e exige um bom manuseio do
microscópio por parte do microbiologista, uma vez que é necessário
fazer ajustes de intensidade da luz, regular bem o condensador, se
possível empregar filtros para uma melhora na qualidade da imagem a
ser visualizada e, geralmente, utilizar um microscópio de campo
escuro.
E quando preferimos este tipo de preparo?
Quando nossa intenção é visualizar a mobilidade e a morfologia de bactérias
espiraladas, as quais sob fixação ficam distorcidas, ou até mesmo observar
alterações na divisão celular e formação de esporos.
Como é de se esperar, na preparação a fresco, por não utilizar corantes, as
bactérias são vistas sem cor (incolores), mesmos que estas sejam capazes
de produzir cor quando cultivadas em meios de cultura específicos. Para
uma melhor visualização da morfologia e citologia bacteriana, vários corantes
passaram a ser utilizados e os microrganismos são corados após os
microrganismos serem fixados na lâmina (mortos), na maioria das vezes,
pelo calor, etapa chamada de fixação. A fixação permite que a bactéria fique
aderida à lâmina e evita que as bactérias sejam lavadas e perdidas durante a
coloração. No entanto, antes da etapa de fixação e coloração, devemos
lembrar da importância da realização de um bom esfregaço, que deve ser:
Pouco espesso
Bem homogêneo
Realizado em área de segurança biológica, a partir de um caldo ou
material diluído em solução salina, espalhado com alça bacteriológica
em lâmina limpa e seca
 ATENÇÃO
Todas as manipulações devem ser feitas seguindo as normas de
biossegurança e, de forma estéril, para não haver contaminação das
amostras e resultados falso positivos. Ao final, todos os resíduos produzidos
devem ser autoclavados antes de descartados.
As técnicas de coloração podem ser classificadas de acordo com o número
de corantes utilizados em:
Coloração simples: Quando utilizamos apenas um único corante para
observar a morfologia bacteriana;
Coloração diferencial: Quando utilizamos mais de um corante, além de
mordentes e do diferenciador para identificar diferenças entre grupos
de bactérias. Dentre os métodos (colorações) diferenciais, também
chamados de seletivos, de maior importância dentro de laboratórios de
Microbiologia Clínica, temos os de Gram, de Ziehl-Neelsen e de
Albert-Laybourn. Além destes, destaca-se ainda o método de
Fontana-Tribondeau, que, embora não seja diferencial, ainda é
utilizado por alguns microbiologistas. Também existem métodos de
coloração pouco utilizados, mas que podem ser úteis quando há
necessidade de evidenciar algumas estruturas bacterianas, como a
coloração de flagelos, esporos e cápsula.
MORDENTE
Substância utilizada durante a fixação que tem a função de manter a
durabilidade da coloração.
COLORAÇÃO DE GRAM
Esta técnica foi desenvolvida em 1884, pelo médico dinamarquês Hans
Christian Joachim Gram, e é a mais utilizada em bacteriologia por permitir
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distinguir bactérias gram-positivas de bactérias gram-negativas. Diferenças
nas características químicas e estruturais das paredes celulares, bem como
na permeabilidade aos reagentes químicos nestes dois grupos de bactérias
levam a diferenças de coloração.
Fonte: Schira/Shutterstock
 Coloração de GRAM. À esquerda, bactérias gram-negativas. Á direita,
bactérias gram-positivas.
Como realizamos essa coloração? Vamos conhecer?
Na técnica de Gram, utilizamos:
Corante básico (violeta genciana, cristal-violeta, metilvioleta).
Mordente (solução iodo-iodetada, conhecida como lugol) que aumenta
a afinidade da célula pelo primeiro corante utilizado (corante básico).
Ocorre assim a ligação do corante com o lugol e a formação de um
composto roxo, insolúvel que cora o espaço protoplasmático e a
parede celular de roxo.
Agente descolorante (álcool a 95% ou álcool-acetona).
Nas bactérias gram-positivas, as quais o corante está fortemente
retido devido à espessa camada de peptideoglicanos, este não é
facilmente removido pela ação do agente descolorante.
Nas bactérias gram-negativas, nas quais o agente descolorante
remove a membrana externa da parede destas bactérias, e
devido à fina camada de peptideoglicanos, estas bactérias não
conseguem reter o corante.
Segundo corante básico (safranina ou fucsina) que cora as bactérias
gram-negativas, recentemente descoradas, de vermelhas. As gram-
positivas permanecem roxas.
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem
horizontal
Dessa forma, ao final da coloração de gram, as bactérias gram-positivas
serão visualizadas no microscópio com cor roxa e as gram-negativas com
cor vermelha. De uma forma geral, a literatura científica evidencia que,
geralmente, os cocos de importância médica são gram-positivos (exceção do
gênero Neisseria), e os bastonetes gram-negativos (exceção dos gêneros
Corynebacterium, Listeria, Bacillus e Clostridium).
 ATENÇÃO
É muito importante a utilização de culturas jovens para evitar resultados
falsos.
A COLORAÇÃO DE GRAM NA
PRÁTICA
COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
No módulo 1, você aprendeu que existem bactérias cuja parede celular
fogem da classificação como gram-positivas e gram-negativas, pois possuem
acima da camada de peptideoglicanos, uma camada denominada Micolato
Arabinogalactano, formada por polímeros de arabinogalactano (açúcares) e
revestida por uma porção lipídica de ácidos micólicos. Esta constituição torna
a parede celular hidrofóbica, dificultando a penetração de corantes aquosos,
bem como a ação do lugol e, portanto, impedindo a identificação e a
diferenciação desse tipo de bactéria através da coloração de Gram.
Entretanto, em 1882, um bacteriologista chamado Franz Ziehl e um
patologista alemão Friedrich Carl Adolf Neelsen, evidenciaram que alguns
gêneros bacterianos, como Micobacterium e Nocardia são capazes de
resistir a descoloração com uma solução de álcool-ácido, após tratamento
com fucsina fenicada aquecida, de forma que permanecem vermelhas,
diferentemente de outras bactérias, que, por não possuírem esta
propriedade, apresentam a cor do corante de fundo, normalmente, feita com
azul de metileno.
 
Fonte: Wikipedia
 Friedrich Carl Adolf Neelsen
Sendo assim, estes gêneros receberam a denominação de BAAR (Bacilos-
Álcool-Ácido-Resistente), e esta capacidade de álcool-ácido-resistência
está relacionada à hidrofobicidade da parede celular, assegurada pela
presença de lipídeos como o ácido micólico. Quanto à coloração, esta ficou
conhecida como coloração de Ziehl-Neelsen.
Como realizamos essa coloração? Vamos conhecer?
Na técnica de Ziehl-Neelsen, após a confecção do esfregaço, fixamos os
esfregaços no calor. Após este passo, é depositado a solução de fucsina de
Zieel e aquecemos o corante até a emissão de vapores (sem ferver), esse
procedimento deve ser feito 3 vezes e deve durar até 5 minutos. Em seguida,
lavamos a lâmina com água e realizamos a descoloração com solução de
álcool-ácido clorídrico a 1%. Na sequência, o esfregaço deve ser coberto
com azul de metileno, por meio minuto, a lâmina é lavada com água corrente
e, após secar, está pronta para ser observada no microscópio óptico (objetiva
100 X). Os BAAR serão visualizados como bastonetesfinos, vermelhos,
sobre fundo corado em azul.
 
Fonte: Douglas Olivares/Shutterstock
 Bacilos (rosa) evidenciados pela coloração de Ziehl-Neelsen 
em um paciente com tuberculose pulmonar avançada e AIDS, amostra
escarro.
 SAIBA MAIS
A análise do escarro pela coloração de BAAR é um método simples, barato e
muito importante para o diagnóstico da tuberculose, pois confere um
resultado precoce (quando realizado de forma correta). Além disso, permite o
acompanhamento a evolução do tratamento de pacientes com essa doença.
Pacientes com sinais e sintomas (febre vespertina, tosse persistente por
mais de 3 semanas, emagrecimento, com imagem no raio x) que apresentam
bacilos gram-negativos no escarro em amostras coradas pela ZH indicam a
presença do M. tuberculosis. No entanto, é importante destacar que outras
micobactérias se coram por essa técnica e esse método. Para diferenciar as
espécies, é necessário cultura.
Essa técnica pode ser realizada em outras amostras, como: urina, líquidos
pleurais, lavado bronco alveolar, aspirado traqueal, biópsias e líquor.
COLORAÇÃO DE ALBERT-
LAYBOURN
Algumas bactérias apresentam corpúsculos citoplasmáticos (corpúsculos
metacromáticos ou corpúsculos de Babes Ernst) nas suas extremidades e
que podem ser corados pelo Lugol forte (com cor marrom), em contraste com
o corpo do bacilo, que se cora em esverdeado/azulado pela solução de
Laybourn. Esta técnica é uma técnica simples que foi sugerida em 1920 por
Henry Albert e, posteriormente, foi modificada por Ross Laybourn, em 1924.
Os corpúsculos citoplasmáticos são encontrados no gênero Corynebacterium
diphtheriae, agente causador de sintomas clínicos característicos da difteria.
Desta forma, a pesquisa por bacilos metacromáticos cuidadosamente
coletados da oro e nasofaringe serve como um método auxiliar no
diagnóstico da difteria.
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DIFTERIA
A difteria (ou crupe) é uma doença de origem bacterina, que acomete
as amígdalas, laringe, faringe, nariz, conjuntiva e pele, causando
amidalite com o aparecimento de placas bacterianas bem amareladas,
dificuldades respiratórias e até mesmo parada respiratória com óbito.
Essa doença é causada pela bactéria Corynebacterium diphtheriae e
pode ser transmitida por meio das vias respiratórias ou então através
de contato físico.
Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock
 Ilustração microscópica de Corynebacterium diphtheria.
Como é feita essa coloração?
Após a obtenção do esfregaço, este é corado com a solução de Albert-
Layborn durante 5 minutos. Após esse período, o corante deve ser retirado e
a lâmina coberta com a solução de Lugol forte, por 2 minutos. Em seguida,
com as lâminas secas, elas podem ser analisadas no microscópio. O
resultado é considerado positivo quando há presença de grânulos
metacromáticos no citoplasma de bacilos com morfologia em paliçada/letras
chinesas. Tais achados sugerem bacilo diftérico e devem ser comunicados
imediatamente ao médico.
COLORAÇÃO DE FONTANA
TRIBONDEAU
O método foi desenvolvido em 1920, com objetivo de auxiliar a visualização
de bactérias espiraladas (Leptospira interrogans e treponemas). Essas
bactérias são muito delgadas e não coram completamente pela coloração de
Gram. Esta coloração não é considerada verdadeira, pois consiste em uma
técnica de impregnação pela prata. Atualmente, os laboratórios têm utilizado
mais a microscopia de campo escuro a fresco para visualizá-las.
Como realizamos essa coloração? Vamos conhecer?
A partir de esfregaços finos, derramar sobre a lâmina algumas gotas da
solução fixadora (renová-la 3 vezes, por 30 segundos). Em seguida, cobrir
com solução mordente, aquecendo a lâmina até emitir vapores. Após 30
segundos, lavar em água corrente, acrescentar o nitrato de prata amoniacal,
aquecendo rapidamente a lâmina até ocorrer novamente a emissão de
vapores, deixando agir por 30 segundos (a preparação toma a cor marrom).
Lavar bem em água corrente, secar com papel de filtro e examinar a lâmina
ao microscópio com a objetiva de imersão (x100). As espiroquetas aparecem
amarronzadas/negras, sobre um fundo amarelo-castanho ou marrom claro.
COLORAÇÃO PARA FLAGELOS
Como visto no módulo 1, os flagelos são estruturas bacterianas responsáveis
pela locomoção e são constituídos por moléculas proteicas denominadas
flagelinas. Entretanto, como são finos, delicados e se despolimerizam com
facilidade, é necessário aplicar algumas técnicas para aumentar o diâmetro
dos flagelos, de forma a torná-los visíveis pela microscopia. A demonstração
do flagelo ocorre devido à ligação do corante ao ácido tânico, tornando-o
mais espesso.
Fonte: microbiologybook.org
 Flagelos.
Como é feita a coloração? Vamos entender?
Segundo o protocolo descrito por Teva e colaboradores (2009):
Cultivar a bactéria em estudo, de acordo com suas preferências
físicas, em uma placa de ágar infusão de cérebro-coração (BHI) ou em
ágar tríptico de soja (com ou sem sangue).
Coletar delicadamente uma alíquota do crescimento com uma alça de
platina e transferi-la para um tubo, contendo cerca de 3 mL de água
destilada. Inverter o tubo uma vez para homogeneizar a suspensão.
Colocar uma gota desta suspensão sobre uma lâmina inclinada a 45o
e deixar secar ao ar.
Cobrir a lâmina com uma mistura de corantes, que inclui fucsina e
ácido tânico (fórmula abaixo), e deixar por 5 minutos, até que um brilho
metálico esverdeado cubra metade da área. Não deixar o corante
secar sobre a lâmina.
Retirar o corante, enxaguando com água. Secar e observar ao
microscópio, com objetiva de imersão.
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem
horizontal
COLORAÇÃO PARA ESPOROS
COM VERDE MALAQUITA (WIRTZ-
CONKLIN)
Os esporos ou endósporos bacterianos consistem em uma parede espessa
formada por vários envoltórios, no interior de algumas bactérias, altamente
resistente ao calor, à dessecação e a outros agentes químicos e físicos,
permitindo que a bactéria entre em um estado de latência por longos
períodos. Este processo ocorre quando a bactéria está em condições
adversas à sua sobrevivência.
Fonte: Kateryna Kon/Shutterstock
 Bactéria C. difficile. Bactéria formadora de esporos.
A parede do esporo é impermeável, mas pode ser atravessada por corantes
(como o verde de malaquita) quando submetidos ao aquecimento, o que
confere aos esporos uma cor verde intensa. Associado a isso, essa estrutura
não consegue ser descorada pela ação do álcool, mas as outras estruturas
podem ser descoradas. Para melhorar a visualização e como contraste
(contracorante), utiliza-se a safranina, que cora outras estruturas em
vermelho, facilitando a diferenciação dos esporos.
Como é feita a coloração? Vamos entender?
Segundo o protocolo descrito por Teva e colaboradores (2009):
Técnica para coloração de esporos
Preparar esfregaço e fixar pelo calor.
Cobrir o esfregaço com o corante verde malaquita.
Aquecer água em um béquer, até a emissão de vapores. Colocar a
lâmina sobre este béquer, mantendo o corante aquecido por 5
minutos. Alternativamente, cobrir a lâmina com verde malaquita e
aproximar de uma chama até que desprenda vapor, sem deixar que o
corante ferva. Afastar do fogo e, após 1 a 2 minutos, repetir a
operação por 3 a 4 vezes.
Lavar suavemente com água, evitando o choque térmico, que poderá
quebrar a lâmina.
Adicionar a solução de safranina por 30 segundos.
Lavar e secar.
Observar ao microscópio com objetiva de imersão.
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem
horizontal
COLORAÇÃO DE CÁPSULA
Como aprendemos, a cápsula envolve a parede celular, é produzida por
algumas espécies bactérias e representa uma estrutura muito importante
para a patogenicidade da bactéria. Isso porque, confere a ação
antifagocitária, ou seja, funciona como um mecanismo de fuga da ação da
fagocitose pelas células do sistema imunológico do indivíduo.
A cápsula é uma camada gelatinosa composta de açúcares ou polipeptídeos,
com caráter hidrossolúvel, quepode ser facilmente removida durante as
etapas de lavagem durante a coloração, o que dificulta a sua coloração.
Além disso, a fixação dos esfregaços pelo calor, amplamente utilizado para
as outras colorações, pode levar a contração da célula e a formação de um
halo ao redor do microrganismo, que pode ser facilmente confundido com a
cápsula. Entretanto, é possível visualizar bactérias produtoras de cápsula a
partir da coloração pela tinta da china. Essa coloração é conhecida como
coloração negativa, pois a cápsula rejeita as partículas do corante. Se as
bactérias apresentarem cápsula, será possível verificar microrganismos
descoradas envoltas por um halo (cápsula) sobre um fundo negro.
Vamos conhecer um pouco mais a coloração da tinta da China?
A seguir, o protocolo descrito por Teva e colaboradores (2009):
Método da tinta da China (coloração negativa)
As colônias suspeitas devem ser cultivadas em caldo rico (BHI).
Colocar 1 ou 2 gotas de cultura em uma lâmina.
Depositar na lâmina uma gota de tinta da China ao lado das gotas de
cultura.
Cobrir com uma lamínula, comprimindo-a entre folhas de papel de
filtro, para se obter uma quantidade bem tênue de corante e material.
Observar ao microscópio óptico (40X).
 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem
horizontal
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. VERIFICAMOS QUE A COLORAÇÃO DE GRAM É UMA
TÉCNICA SIMPLES, RÁPIDA E SE BASEIA NA
COMPOSIÇÃO DA PAREDE CELULAR DAS BACTÉRIAS. A
RESPEITO DESTA TÉCNICA, ASSINALE A AFIRMATIVA
CORRETA:
A) As bactérias gram-negativas após o tratamento com álcool-acetona
permanecem roxas.
B) As bactérias gram-negativas apresentam uma parede celular constituída
por uma fina camada de peptideoglicanos revestida por ácido micólico e uma
membrana externa.
C) Os bacilos álcool ácido resistentes são preferencialmente corados pela
técnica de Gram.
D) O lugol aumenta a afinidade da bactéria para o corante cristal violeta
induzindo a formação de um composto roxo nas bactérias gram-positivas.
2. ESTUDAMOS QUE A COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN É
UMA TÉCNICA QUE PERMITE A COLORAÇÃO DE UM
GRUPO DE BACTÉRIAS QUE POSSUEM PAREDE CELULAR
CONSTITUÍDA POR PEPTIDEOGLICANOS, SEGUIDA DE
UMA CAMADA FORMADA POR POLÍMEROS DE
ARABINOGALACTANO E REVESTIDA POR UMA PORÇÃO
LIPÍDICA DE ÁCIDOS MICÓLICOS. A RESPEITO DESTA
TÉCNICA, QUAL MICRORGANISMO É CORADO POR ESTE
MÉTODO DE COLORAÇÃO?
A) Streptococcus sp.
B) Treponema sp.
C) Mycobacterium tuberculosis
D) Corynebacterium diphtheria
GABARITO
1. Verificamos que a coloração de Gram é uma técnica simples, rápida e
se baseia na composição da parede celular das bactérias. A respeito
desta técnica, assinale a afirmativa CORRETA:
A alternativa "D " está correta.
 
As bactérias gram-negativas após o tratamento com álcool-acetona perdem
a cor corando com o corante de fundo (Safranina ou fucsina de Gram). As
bactérias gram-negativas apresentam parede celular constituída por uma fina
camada de peptideoglicanos, uma membrana externa e lipopolissacarídeos.
Os bacilos álcool ácido resistentes são corados pela técnica de ZIEHL-
NEELSEN.
2. Estudamos que a coloração de Ziehl-Neelsen é uma técnica que
permite a coloração de um grupo de bactérias que possuem parede
celular constituída por peptideoglicanos, seguida de uma camada
formada por polímeros de arabinogalactano e revestida por uma porção
lipídica de ácidos micólicos. A respeito desta técnica, qual
microrganismo é corado por este método de coloração?
A alternativa "C " está correta.
 
Os Bacilos-Álcool-Ácido-Resistente (BAAR) possuem a capacidade de
álcool-ácido-resistência relacionada à hidrofobicidade da parede celular,
assegurada pela presença de lipídeos como o ácido micólico e podem ser
visualizadas pela coloração de Ziehl-Neelsen. Um exemplo de BAARs são o
grupo das micobactérias, como M. tuberculosis.
CONCLUSÃO
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Ao longo desta jornada, compreendemos as características gerais das
bactérias e relacionamos a sua morfologia e estruturas celulares com as
diferentes técnicas de coloração, importantes e muito utilizadas nos
laboratórios clínicos para identificação ou distinção de grupos bacterianos.
Além disso, entendemos como os diferentes meios de cultura são úteis para
identificação e crescimento bacteriano, bem como as vantagens e
desvantagens de cada tipo de teste de sensibilidade a antimicrobianos, os
quais permitem investigar resistência a um ou mais antibióticos utilizados na
clínica.
AVALIAÇÃO DO TEMA:
REFERÊNCIAS
JORGENSEN, J. H.; FERRARO, M. J. Antimicrobial Susceptibility Testing: A
Review of General Principles and Contemporary Practices. Clinical
Infectious Diseases. 49 (11), 2009. p. 1749–1755.
MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M. & PARKER, J. Microbiologia de Brock.
10 ed. São Paulo: Pearson Education, 2008.
MURRAY, P.R; ROSENTHAL, K.S; PFALLER, M.A. Morfologia Bacteriana e
Estrutura e Síntese da Parede Celular. In: Microbiologia médica. 5. ed.
Elsevier, 2006. cap. 3, p. 11-24.
MURRAY, P.R; ROSENTHAL, K.S; PFALLER, M.A. Morfologia Bacteriana e
Estrutura e Síntese da Parede Celular. In: Microbiologia médica. 5 ed.
Elsevier, 2006. cap. 4, p. 25-34.
NCCLS. M2-A8—Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility
Tests; Approved Standard—Eighth Edition (ISBN 1-56238-485-6).
OPLUSTIL, C.P.; ZOCCOLI, C.M.; TOBOUTI, N.R.; SINTO, I.S.
Procedimentos básicos em microbiologia clínica. 2 ed. São Paulo:
Sarvier, 2004.
TEVA, A.; MORAES, A.M.L.; RIBEIRO, F.C.; et al. Bacteriologia. In:
MOLINARO, E.M.; CAPUTO, L.F.G.; AMENDOEIRA, M.R.R. (Orgs).
Conceitos e Métodos para formação de profissionais em laboratórios de
saúde: v 4. Rio de Janeiro: EPSJV; IOC, 2009. cap.3, p.221-398.
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R. & CASE, C. L. Microbiologia. 12 ed. São
Paulo: Artmed, 2017.
ROSSI, F. Cocos Gram-positivos: Staphylococcus aureus, Enterococcus spp.
e Streptococcus pneumoniae e os principais mecanismos de resistência. In:
Rossi F. & Andreazzi D.B. (Orgs). Interpretando o antibiograma. São
Paulo: Atheneu, 2005. p. 27-63.
EXPLORE+
Para saber mais sobre os assuntos explorados neste tema:
Pesquise:
Como o Dr. Alvin Fox, Professor da University of South Carolina School
of Medicine aborda as características bacterianas no artigo A célula
bacteriana.
Como Denise Spolidorio, Cristiane Duque e Helvécio Póvoa abordam
as características da morfologia e citologia bacteriana no capítulo 1 -
Morfologia microbiana, do livro Microbiologia e Imunologia Geral e
Odontológica.
Como Ana Cristina Gales, Eliete Aguiar de Miranda Frigatto e Soraya
Sgambatti de Andrade abordam os Testes de Sensibilidade aos
Antimicrobianos – módulo 5.
Visite o site do Brazilian Committee on Antimicrobial Susceptibility
Testing (BrCast) que tem como missão determinar e rever os pontos de
corte para interpretação dos testes de sensibilidades no Brasil. Além
disso, ele disponibiliza os pontos de cortes dos antimicrobianos e
manuais de forma gratuita.
Assista:
Reino Monera - O crescimento bacteriano e a função exponencial,
vídeo que aborda as fases do crescimento microbiano.
Cultivando microrganismos, vídeo que aborda condições do
crescimento bacteriano.
Exigências nutricionais – Microbiologia, vídeo que aborda os principais
meios de cultura e sua preparação em laboratório.
Coloração de Gram, animação que explica todo o passo a passo da
coloração.
Coloração de Ziehl Neelsen: Baciloscopia (Microbiologia) - Bio Aulas,
vídeo que aborda as principais características da coloração de BAAR.
Coloração de Ziehl-Neelsen, vídeo produzido pelo CONECTAMICRO
da UFF que aborda a fundamentação teórica e como realizar esta
técnica de coloração utilizada para visualização de bacilos álcool-ácido
resistentes.
Leia:
A notícia Qual a finalidade dos meios de cultura em microbiologia?
Publicado por KASVI distribuidora.
O capítulo 3 do manual da Anvisa: Descrição dos meios de cultura
empregados nos exames microbiológicos.
O artigo científico escrito por Angelo Trento