Crescimento Microbiano -Jaque

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ
CENTRO DE ENGENHARIAS E CIÊNCIAS EXATAS
CURSO DE ENGENHARIA QUÍMICA
DISCIPLINA: LABORATÓRIO DE ENGENHARIA QUÍMICA I
ALCIDES TONHATO JÚNIOR
JACQUELINE FERANDIN HONORIO
THALLES DA SILVA
WILIAN ADRIEL LEICHTWEIS
CRESCIMENTO MICROBIANO
TOLEDO
2008
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ALCIDES TONHATO JÚNIOR
JACQUELINE FERANDIN HONORIO
THALLES DA SILVA
WILIAN ADRIEL LEICHTWEIS
CRESCIMENTO MICROBIANO
Trabalho acadêmico apresentado a disciplina de Microbiologia Industrial, do curso de Engenharia Química. Universidade Estadual do Oeste do Paraná - UNIOESTE, campus de Toledo.
Prof: Sergio Lucena
TOLEDO
2008�
SUMÁRIO 
INTRODUÇÃO	VI
1 CLASSIFICAÇÃO NUTRICIONAL DOS MICROORGANISMOS	7
2 NUTRIENTES	9
2.1 ELEMENTOS QUÍMICOS COMO NUTRIENTES	10
2.1.1 Principais Macronutrientes	10
2.1.2Principais Micronutrientes	11
3 O PROCESSO DE NUTRIÇÃO EM PROCARIOTOS	12
3.1 PAPEL DA PAREDE CELULAR EM GRAM NEGATIVAS	12
3.2 PAPEL DAS PROTEÍNAS PERIPLASMÁTICAS EM BACTÉRIAS GRAM 
NEGATIVAS	12
3.3 PAPEL DA MEMBRANA CITOPLASMÁTICA NA NUTRIÇÃO DE GRAM 
POSITIVOS E NEGATIVOS	13
4 PROCESSOS DE TRANSPORTE ATRAVÉS DA MEMBRANA	14
4.1 TIPOS DE TRANSPORTE MEDIADO POR PROTEÍNAS	14
5 FATORES QUE AFETAM O CRESCIMENTO MICROBIANO	16
5.1 TEMPERATURA	16
5.2 O2 	18
5.3 pH - POTENCIAL HIDROGENIÔNICO	20
5.4 ÁGUA E ATIVIDADE AQUOSA	21
5.4.1 Vida bacteriana em meios com baixa atividade aquosa:	22
5.5 RADIAÇÕES	22
5.6 PRESSÃO	23
5.6.1 Efeito da alta pressão hidrostática sobre os microrganismos	23
5.7 POPULAÇÃO	24
5.8 PRESENÇA DE AGENTES ANTIMICROBIANOS	25
6 MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO	25
6.1 CONTAGEM TOTAL DE CÉLULAS	25
6.2 CONTAGEM DE VIÁVEIS	26
6.3 MASSA DE CÉLULAS	28
6.4 TURBIDIMETRIA	28
6.5 ANÁLISES QUÍMICAS	29
6.6 NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP)	29
7 CRESCIMENTO MICROBIANO	30
7.1 CURVA DE CRESCIMENTO 	31
7.1.1 Fase de latência (ou "LAG")	32
7.1.2 Fase exponencial (ou "EXP")	33
7.1.3 Fase de desaceleração	33
7.1.4 Fase estacionária	34
7.1.5 Fase de morte	34
7.2 TEMPO DE GERAÇÃO OU DUPICAÇÃO	34
7.3 CRESCIMENTO EM CULTURAS CONTÍNUAS	36
7.4 CRESCIMENTO EXPONENCIAL	36
7.4.1 Cinética do crescimento exponencial	36
7.4.2 Cálculo da taxa específica de crescimento	37
7.5 APLICAÇÕES DO CONHECIMENTO DA CURVA	39
CONCLUSÃO	40
BIBLIOGRAFIA	41
ANEXO1	42
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LISTA DE FIGURAS 
FIGURA 1: Nitrosomonas	8
FIGURA 2: Chromatium	9
FIGURA 3: Chloroflexus	9
FIGURA 4: Temperaturas cardeais dos microrganismos 	17
FIGURA 5: Tipos de bactérias em relação à temperatura 	17
FIGURA 6: Caracterização de microorganismos quanto ao metabolismo de O2	20
FIGURA 7: Exemplo ilustrando o procedimento de contagem direta 	26
FIGURA 8: Técnica de contagem de viáveis 	28
FIGURA 9: Fases de crescimento microbiano.	31
FIGURA 10: Tempo de geração ou duplicação de um microrganismo	34
FIGURA 11: Esquema de um quimiostato	36
FIGURA 12: Representação da função exponencial aritmética.	38
FIGURA 13: Representação da curva de crescimento	39
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LISTA DE TABELAS
TABELA 1: Classificação nutricional e exemplos	8
TABELA 2: Faixa de pH ótimo para microrganismos	20
TABELA 3: Exemplos de pH mínimo, ótimo e máximo de alguns microrganismos	21
TABELA 4: Fases do carecimento, a taxa de crescimento e as características 
básicas	32
TABELA 5: Tempo de geração de algumas bactérias em condições ótimas de 
crescimento	35
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INTRODUÇÃO
Todo ser vivo tem suas necessidades e características. Para crescer, todos os organismos necessitam de uma variedade de elementos químicos como nutrientes. Estes elementos são necessários tanto para a síntese como para as funções normais dos componentes celulares. Assim os microorganismos tem características próprias quanto a necessidade de nutrientes e substancias orgânicas e não orgânicas. Fatores externos também influenciam no desenvolvimento de culturas celulares.
O crescimento dos microrganismos é grandemente afetado pelas condições físicas e químicas do ambiente onde se encontram, sendo que estas podem influir positivamente ou negativamente de acordo com o microrganismo em questão. Os microorganismos possuem fases de suas vidas divididas em parte, onde cada uma tem características intrínsecas, possuindo necessidades diferentes de nutrientes para seu ótimo desenvolvimento.
Para seu controle, é indispensável utilizar-se métodos para qualificação e quantificação de microorganismo. O crescimento dos microrganismos pode ser mensurado por diferentes técnicas. Essas técnicas podem ser direta ou indiretamente aplicadas aos organismo em questão.
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1 CLASSIFICAÇÃO NUTRICIONAL DOS MICROORGANISMOS
Os microrganismos necessitam de uma fonte de carbono (gás carbônico (CO2) ou carbono orgânico) e de uma fonte de energia (luz ou energia derivada da oxidação de compostos orgânicos ou inorgânicos). Os microrganismos que usam a luz como fonte de energia podem ser:
Fotoautotróficos: são organismos que usam a luz como fonte de energia e o carbono inorgânico (CO2) como fonte de carbono. São representados pelas bactérias fotossintetizantes (cianobactérias), bactérias sulfurosas púrpura (exemplo: Chromatium) e bactérias sulfurosas verdes (exemplo: Chlorobium), algas e plantas verdes. Existem cerca de 60 espécies de bactérias fotoautotróficas.
Fotoheterotróficos: usam luz como fonte de energia e compostos orgânicos (álcool, carboidratos, ácidos orgânicos, etc.) como fonte de carbono. São as bactérias verdes não sulfurosas (exemplo: Chloroflexus) e as bactérias púrpuras não sulfurosas (exemplo: Rhodopseudomonas ).
Os microrganismos que obtêm energia através da oxidação de compostos orgânicos ou inorgânicos podem ser classificados em:
Quimioautotróficos: usam os compostos químicos (gás sulfídrico (H2S), enxofre elementar (S), amônia (NH3), gás hidrogênio (H2), nitrato (NO3-), nitrito (NO2-) e ferro (Fe2+) como fonte de energia e usam o CO2 como fonte de carbono.
Quimioheterotróficos: são organismos que usam compostos orgânicos como fonte de energia e de carbono. Este grupo inclui a maioria das bactérias, fungos e protozoários.
Na tabela 1, são citados alguns exemplos de microorganismos e suas respectivas características nutricionais.
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TABELA 1: Classificação nutricional e exemplos
	Grupo nutricional 
	Fonte de carbono
	Fonte de energia
	Exemplos
	
	Quimioautotróficos 
	Dióxido de carbono
	Compostos inorgânicos
	Bactérias nitrificantes, do ferro, hidrogênio e enxofre
	Nitrossomonas
Thiobacillus neapolitanus
	Quimioheterotróficos
	Compostos orgânicos
	Compostos orgânicos
	Muitas bactérias, fungos, protozoários e animais
	Maioria das bacterias
	Fotoautotróficos 
	Dióxido de carbono
	Luz
	Bactérias do enxofre verdes e púrpura, algas, plantas e cianofíceas
	Chromatium
Chlorobium
	Fotoheterotróficos
	Compostos orgânicos
	Luz
	Bactérias púrpuras e verdes não-enxofradas
	Chloroflexus
Rhodopseudomonas
Fonte:Pelczar, Michael J. et. al. Microbiologia conceitos e aplicações, tabela 5.1 p. 149
FIGURA 1: Nitrosomonas
FIGURA 2: Chromatium
FIGURA 3: Chloroflexus
2 NUTRIENTES
Anabolismo é a parte do metabolismo que se refere à complexação de substâncias em um organismo, ou seja, a partir de moléculas mais simples, são criadas moléculas mais complexas. O anabolismo só ocorre em alta energética, caso esteja em baixa energética, acontece o catabolismo.
Chama-se catabolismo à parte do metabolismo que se refere à assimilação ou processamento da matéria adquirida para fins de obtenção de energia.
Os nutrientes são definidos como as substâncias encontradas no ambiente, que participam do anabolismo e catabolismo celular, podendo ser divididos em dois grandes grupos: macronutrientes, que são necessários em grandes quantidades e micronutrientes, necessários em pequenas quantidades. Alguns nutrientes são utilizados como fonte de material paraa biossíntese das moléculas, enquanto outros correspondem a fontes de energia, necessária aos processos biossintéticos e de manutenção dos organismos. Muitas vezes, diferentes nutrientes podem apresentar os dois papéis descritos acima.
2.1 ELEMENTOS QUÍMICOS COMO NUTRIENTES
Para crescer, todos os organismos necessitam de uma variedade de elementos químicos como nutrientes. Estes elementos são necessários tanto para a síntese como para as funções normais dos componentes celulares. Eles existem na natureza em uma grande variedade de compostos, que são orgânicos ou inorgânicos. Os elementos químicos principais para o crescimento da célula incluem carbono, nitrogênio, oxigênio, enxofre e fósforo. 
2.1.1 Principais Macronutrientes
Carbono: È um dos elementos químicos mais importantes necessários para o crescimento microbiano. Todos os organismos requerem de carbono de alguma forma. O carbono forma o esqueleto das três maiores classes de nutrientes orgânicos: carboidratos, lipídeos e proteínas. Tais compostos fornecem energia para o crescimento da célula e servem como unidade básica do material celular. Entre os procariotos melhor estudados até o momento, a maioria requer algum tipo de composto orgânico como fonte de carbono, o qual pode ser de diferentes variedades (aminoácidos, ácidos orgânicos,	açúcares, bases nitrogenadas, etc).
Nitrogênio: Corresponde ao segundo elemento mais abundante nas células, compondo proteínas, ácidos nucléicos e peptideoglicano. Podemos encontrar o nitrogênio sob a forma de compostos orgânicos ou inorgânicos, sendo ambas as formas prontamente utilizadas por um grande número de procariotos. Assim, a partir da degradação de proteínas e ácidos nucléicos, bem como a partir de amônia e nitrato, os organismos utilizam o nitrogênio presente na natureza. Embora o nitrogênio esteja em grandes concentrações na atmosfera, este não é amplamente utilizado, exceto por aqueles organismos denominados fixadores de N2.
Hidrogênio: elemento presente em proteínas, açúcares e demais moléculas orgânicas.
Fósforo: encontrado em compostos orgânicos (ácidos nucléicos) ou inorgânicos (fosfatos), sendo importante na composição de ácidos nucléicos e fosfolipídeos. Em sua maioria, os microrganismos utilizam o fósforo sob a forma de compostos inorgânicos.
Enxofre: compondo a cisteína e metionina, estando presente também em várias vitaminas (tiamina, biotina). Na natureza, o enxofre sofre uma série de transformações, as quais são exclusivamente realizadas por microrganismos. A principal fonte de enxofre para os microrganismos corresponde aos sulfatos inorgânicos ou H2S.
Potássio: necessário para todos os microrganismos, devido ao seu papel ativador de várias enzimas, tais como aquelas envolvidas na tradução.
Magnésio: necessário geralmente em grandes quantidades, uma vez que tem papel na estabilização de ribossomos, membranas e ácidos nucléicos, sendo também importante para o funcionamento de diferentes enzimas, especialmente aquelas envolvidas na transferência de fosfato.
Cálcio: embora não seja essencial ao crescimento da maioria dos microrganismos, tem papel de estabilização da parede celular e de termorresistência nos esporos.
Sódio: importante, especialmente para microrganismos marinhos e certas archaea halófilas.
Ferro: presente em um grande número de proteínas, especialmente aquelas envolvidas na respiração.
2.1.2 Principais Micronutrientes
Embora necessários em pequenas quantidades, têm papel tão importante quanto os macronutrientes.
Cobalto: necessário apenas para a formação da vitamina B12.
Zinco: tem papel estrutural em várias enzimas (DNA e RNA polimerases) e outras proteínas de ligação ao DNA.
Molibdênio: presente em certas enzimas como a nitrato redutase assimilativa.
Cobre: importante para enzimas respiratórias.
Manganês: ativador de muitas enzimas.
Níquel: presente em hidrogenases (As hidrogenases são enzimas que catalisam a reação de conversão de hidrogênio molecular em prótons e elétrons).
3 O PROCESSO DE NUTRIÇÃO EM PROCARIOTOS
Nos procariotos contendo parede celular os processos de nutrição ocorrem através da absorção dos nutrientes, a partir do ambiente externo. Entretanto, devido às características diferenciais na composição e estrutura da parede celular dos organismos Gram positivos e Gram negativos, este processo apresenta algumas diferenças nestes dois grupos de organismos.
3.1 PAPEL DA PAREDE CELULAR EM GRAM NEGATIVAS
A parede celular das bactérias Gram positivas é composta por várias camadas de peptídeoglicano, enquanto nas Gram negativas observa-se uma maior complexidade química e estrutural da parede, decorrente da presença de camadas lipoprotéica e lipopolissacarídica, localizadas externamente à camada de peptídeoglicano, originando a membrana externa. Estas diferenças, por si só, contribuem em grande parte às diferenças observadas na forma de captação dos nutrientes.
Devido à presença	 de uma membrana externa de caráter hidrofóbico (LPS), as bactérias Gram negativas apresentam um grande número de porinas associadas à camada lipopolissacarídica. As porinas correspondem a proteínas, formadas por três subunidades idênticas, que originam um canal de cerca de 1 nm de diâmetro, cujo mecanismo de abertura e fechamento permanece ainda desconhecido. Desta forma, as porinas permitem a passagem de moléculas hidrofílicas, de baixa massa molecular. Estas proteínas podem atuar de forma inespecífica, formando canais aquosos, ou específica, exibindo sítios de ligação para substratos de até 5 kDa, ou ainda, acopladas a proteínas transportadoras.
3.2 PAPEL DAS PROTEÍNAS PERIPLASMÁTICAS EM BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS
O periplasma corresponde à porção celular localizada entre a membrana plasmática e a membrana externa, geralmente exibindo constituição gelatinosa, provavelmente devido ao grande número de enzimas e proteínas presentes, assim como pela própria presença do peptídeoglicano e lipoproteínas.
De forma geral, são encontrados três tipos de proteínas no periplasma de células Gram negativas: hidrolases, que atuam na degradação inicial dos nutrientes; proteínas de ligação, que iniciam os processos de transporte e os quimioreceptores, envolvidos em processos de quimiotaxia. O transporte inicial das moléculas para o citoplasma, a partir do periplasma, é um processo que requer gasto energia, por meio da utilização de ATP.
3.3 PAPEL DA MEMBRANA CITOPLASMÁTICA NA NUTRIÇÃO DE GRAM POSITIVOS E NEGATIVOS
A membrana citoplasmática, estrutura vital para qualquer tipo de célula, é uma barreira que separa o conteúdo celular do meio externo. A membrana corresponde a uma barreira altamente seletiva, permitindo que as células concentrem metabólitos específicos em seu interior. No domínio Bacteria, a membrana apresenta-se como uma bicamada fosfolipídica, contendo proteínas dispersas por toda sua superfície. A estutura global da membrana é estabilizada através de interações do tipo pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas e pela presença de íons Ca++ e Mg++, os quais se combinam com as cargas negativas dos fosfolípides. Embora em archaea, a membrana apresente estrutura totalmente distinta, podendo ser do tipo bicamada ou monocamada, muitas vezes desprovida de fosfolipídeos, tal estrutura desempenha os mesmo papéis fisológicos descritos para as membranas de qualquer ser vivo.
Assim, a membrana tem papel essencial nos processos de nutrição procariótica, uma vez que todos os nutrientes e produtos de degradação devem atravessá-la. Devido à sua permeabilidade seletiva, a maioria das moléculas são incapazes de simplesmente atravessar a membrana de forma passiva. Ao contrário, estas devem ser ativamente transportadas através da membrana.
O interior de uma célula procariótica consiste em uma solução aquosa hipertônica em relação à maioria dos hábitats onde os procariotos são geralmente encontrados. Assim, a água tem a capacidade de passar livremente para o citoplasma, pelo processo de osmose. Outros compostos,tais como pequenas substâncias apolares e lipossolúveis (ácidos graxos, álcoois, benzeno) são capazes de solubilizar-se na membrana e entrar na célula. Moléculas carregadas como íons, aminoácidos, compostos polares, devem ser transportados especificamente uma vez que, devido à sua natureza, não são capazes de atravessar a membrana.
4 PROCESSOS DE TRANSPORTE ATRAVÉS DA MEMBRANA
A presença de proteínas transportadoras na membrana permite que a célula capte compostos que naturalmente não penetrariam na célula, devido à natureza semi-permeável da membrana. Estas proteínas podem ser agrupadas em três classes: uniportadoras, simportadoras e antiportadoras.
As proteínas uniportadoras são aquelas que transportam uma única substância de um lado para outro da membrana. As duas outras classes são descritas como cotransportadoras, uma vez que para transportar uma substância qualquer, necessitam transportar outra, concomitantemente. As simportadoras são aquelas que carreiam ambos os compostos em uma mesma direção enquanto nas antiportadoras o transporte se dá em direções opostas.
Este tipo de transporte, mediado por proteínas, permite à célula apresentar concentrações internas de determinados compostos superiores àquelas encontradas no meio externo.
Uma das principais características do processo de transporte mediado por proteínas reside na sua elevada especificidade, assim, determinados transportadores carreiam apenas um único tipo de molécula, embora a maioria apresente afinidade por uma classe de moléculas
4.1 TIPOS DE TRANSPORTE MEDIADO POR PROTEÍNAS
Difusão facilitada: Neste tipo de processo, a ligação do nutriente à proteína transportadora induz uma mudança de conformação na proteína, formando um canal pelo qual o nutriente tem acesso ao citoplasma. Embora haja a participação de transportadores neste processo, a ação das leis das massas impede que ocorra a formação de um gradiente de concentração, mantendo assim as concentrações intra e extracelular semelhantes.
Este processo de difusão mediada por transportadores é denominado difusão facilitada, o qual não envolve gasto de energia.		
Os mecanismos descritos a seguir caracterizam-se por requererem um gasto de energia, uma vez que estes permitem um acúmulo dos compostos transportados no interior da célula. Desta forma, estes mecanismos envolvem o transporte contra um gradiente de concentração, sendo a energia necessária para o bombeamento dos compostos para o interior da célula. Nestes casos, a energia pode advir da clivagem de ATP ou pela dissipação de gradientes de prótons ou íons Na+ através da membrana. Este gradiente iônico é estabelecido durante reações que liberam energia e podem ser utilizados como fonte potencial de energia para a captação de nutrientes contra um gradiente de concentração.
Translocação de grupo: Neste tipo de transporte, o nutriente sofre uma alteração química durante sua passagem através da membrana. Uma vez que o produto translocado para o interior da célula é agora diferente daquele presente no meio externo, não há a formação de um gradiente de concentração.
Moléculas de açúcares tais como glicose, frutose, N-acetilglicosamina, purinas e pirimidinas são exemplos de translocação de grupo, sendo fosforiladas durante o processo pelo sistema fosfotransferase.
Em E. coli, o sistema fosfotransferase é composto por 24 proteínas, sendo 4 necessárias para o transporte de um dado açúcar.
O sistema fosfotransferase tem também papel na regulação do transporte dos açúcares, uma vez que na presença de glicose e outro açúcar, o sistema fosforila preferencialmente as moléculas de glicose.
Transporte ativo: Alguns açúcares, a maioria dos aminoácidos, vários íons inorgânicos e ácidos orgânicos são transportados através deste tipo de mecanismo. A energia necessária para efetuar os processos advém ou do ATP ou, mais comumente, da formação de um gradiente de prótons (íons hidrogênio) por toda a membrana, denominado força próton motiva. Como resultado, a membrana fica energizada e este potencial eletroquímico é responsável pela captação dos nutrientes.
Cada transportador tem sítios específicos tanto para o substrato como para os prótons. Com a entrada do nutriente, o próton também atravessa e membrana e com isso vai diminuindo o gradiente e a força motiva.
Cátions tipo K+ podem ser transportados ativamente por uniportadores, em resposta à diferença de cargas, uma vez que o interior da célula fica carregado negativamente. Os ânions provavelmente são transportados juntamente com prótons, por simportadores. Moléculas não carregadas, como aminoácidos ou açúcares, são transportadas também por simportadores, juntamente com um ou mais prótons.
Além da força motora resultante do gradiente de prótons, o transporte ativo também pode ser executado utilizando a energia liberada pela hidrólise de ATP, como no caso do transporte de maltose em E. coli.
5 FATORES QUE AFETAM O CRESCIMENTO MICROBIANO
O crescimento dos microrganismos é grandemente afetado pelas condições físicas e químicas do ambiente onde se encontram, sendo que estas podem influir positivamente ou negativamente de acordo com o microrganismo em questão.
5.1 TEMPERATURA
Corresponde a um dos principais fatores ambientais que influenciam o desenvolvimento bacteriano. À medida que há um aumento da temperatura, as reações químicas e enzimáticas na célula tendem a tornar-se mais rápidas, acelerando a taxa de crescimento. Entretanto, em determinadas temperaturas inicia-se o processo de desnaturação de proteínas e ácidos nucléicos, inviabilizando a sobrevivência celular.
Assim, todos os microrganismos apresentam uma faixa de temperatura onde desenvolvem-se plenamente. Nesta faixa de temperatura podemos determinar as temperaturas mínima, ótima e máxima (temperaturas cardeais), para cada microrganismo. A temperatura máxima provavelmente reflete os processos de desnaturação mencionados acima, enquanto os fatores que determinam a temperatura mínima ainda não são bem conhecidos, embora certamente a fluidez da membrana seja um dos fatores determinantes destes níveis térmicos baixos.
FIGURA 4: Temperaturas cardeais dos microrganismos (Fonte: Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)
Dentre os diferentes microrganismos observa-se uma ampla variedade de faixas de temperatura, onde para alguns o ótimo encontra-se entre 5 e 10°C, enquanto para outros é de 90 a 100°C. Assim, os microrganismos podem ser classificados em quatro grupos, de acordo com os ótimos de temperatura: psicrófilos (0 a 20°C, ótimo de ≈ 15°C - Flavobacterium), mesófilos (12 a 45°C, 37°C - E. coli), termófilos (42 a 68°C, 62°C - Thermococcus), e hipertermófilos (80 a 113°C, 105°C - Pyrodictium brockii).
FIGURA 5: Tipos de bactérias em relação à temperatura(Fonte: Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)
Psicrófilos: os ambientes frios são predominantes na Terra (oceanos, polos, solos) entretanto este grupo (bactérias, fungos e algas) é muito pouco estudado. Destes, os mais conhecidos são as algas que crescem sob o gelo ou em geleiras (Chlamydomonas nivalis), dando coloração vermelha. Há os microrganismos psicrotolerantes que são aqueles cujo ótimo encontra-se entre 20 e 40°C e que sobrevivem a 0°C. São um grupo amplo (bactérias, fungos, algas e protozoários) que podem contaminar alimentos e outros substratos refrigerados.
Mesófilos: crescem numa faixa de 20 a 40°C, com um ótimo em torno de 37°C, sendo os principais microrganismos encontrados em animais de sangue quente.
Termófilos e Hipertermófilos: ótimos de 45 e ≥ 80°C, respectivamente. São encontrados nos solos, silagem, fontes termais e no fundo oceânico, em fontes. Geralmente são procariotos, sendo as Archaea as mais resistentes, apresentando enzimas e proteínas termoestáveis, provavelmente devido à substituição de aminoácidos, conferindo um novo folding. Têm também uma maior concentração de ácidos graxos saturados na MC. As Archaea não têm ácidos graxos na MC, mas sim hidrocarbonetosde cadeias com diferentes comprimentos, compostas por unidades repetitivas de 5 C (fitano), ligadas a glicerol fosfato, por ligação éter.Os termófilos e hipertermófilos tem grande interesse biotecnológico porque tendem a fazer os processo mais rapidamente, com menor contaminação por outros microrganismos e possuem enzimas mais termoestáveis.
5.2 O2
Aeróbios - requerem oxigênio para o crescimento (padrão: 21% de O2)Alguns aeróbios podem crescer mais lentamente quando o O2 é limitado. Se os microrganismos crescem em meio líquido podem rapidamente utilizar o O2 dissolvido na camada superficial do meio. Para evitar este problema, as culturas líquidas de microrganismos aeróbios são algumas vezes agitadas (shaker) para aumentar o suprimento de O2 dissolvido e produzir um estoque celular maior num tempo de incubação menor. Existem alguns grupos de microrganismos que requerem níveis elevados de CO2 - Neisseria gonorrhoea - 5 a 10% de CO2. Neste caso pode-se colocar a placa com meio semeado com o microrganismos dentro de uma jarra hermeticamente fechada, contendo uma vela acessa, a qual queimará enquanto tiver O2 suficiente para manter esta combustão (C + O2 --- CO2), assim a atmosfera dentro da jarra vai conter uma quantidade de O2 reduzida e uma concentração de CO2 aumentada. 
Facultativos: crescem na presença de O2 ou podem também crescer em anaerobiose. Quando em condições de anaerobiose, obtém energia pelo processo metabólico chamado fermentação. Ex. genêros da família bacteriana Enterobacteriacea (Escherichia coli), leveduras (Saccharomyces cerevisae) 
Anaeróbios: aqueles que podem ser mortos pelo oxigênio. Não utilizam o O2 para reações de produção de energia. Alguns até toleram baixas concentrações de oxigênio : Clostridium perfringens - altamente tolerantes ao O2; Clostridium tetani - moderadamente tolerantes ao O2; Methanobacterium - anaeróbios estritos A toxicidade do oxigênio para os anaeróbios : O2 + e-→O2 - (radical superóxido): podem causar danos às células; 2O2 - + 2H+→O2 + H2O2 (peróxido de hidrogênio): podem destruir os componentes vitais da célula; O2 - + H2 O→O2 + OH-2 + OH (hidroxila): pode danificar quase todo tipo de molécula encontrada em uma célula viva, inclusive o DNA.
Os microrganismos aeróbios e facultativos, que crescem em aerobiose, e até alguns microrganismos anaeróbios, desenvolveram vários mecanismos protetores contra estas formas tóxicas de O2: produção da enzima superóxido dismutase - que elimina os radicais superóxidos convertendo-os rapidamente em peróxido de hidrogênio; metabolização do peróxido de hidrogênio por mais duas enzimas - catalase, que converte o H2O2 em O2 e H2O; e a peroxidase que converte o H2O2 em H2O. Assim a reação (3) não mais ocorre e os radicais OH não mais são formados
Microaerófilos - podem utilizar oxigênio nas reações químicas para a produção de energia (1 a 15% de O2). Não suportam níveis de O2 de 21% presentes na atmosfera, como requerem os aeróbios, mais podem utilizar o O2 em níveis mais baixos. A tolerância moderada ao oxigênio deve-se à alta susceptibilade aos radicais peróxidos e o peróxido de hidrogênio que são formados nas culturas incubadas sob condições de anaerobiose. Exemplo : Campylobacter jejuni (provoca diarréia em humanos)
FIGURA 6: Caracterização de microorganismos quanto ao metabolismo de O2
5.3 pH - POTENCIAL HIDROGENIÔNICO
Os ambientes naturais tem uma faixa de pH de 5 a 9, o que comporta o crescimento de diferentes tipos de microrganismos. Bactérias - faixa entre 7, com algumas acidófilas (Thiobacillus de 0,5 a 6,0 com ótimo entre 2 e 3,5) e outras alcalifílicas (Bacillus e Archaea).
O pH ótimo é normalmente bem definido para cada espécie, encontra-se no valor mediano de variação de pH sobre o qual o crescimento acontece.
Para o melhor crescimento do microrganismo num meio ácido ou básico, ele deve ser capaz de manter o seu pH intracelular em torno de 7.5, não importando qual o valor do pH externo. A maneira de obter o pH da célula viva nessa faixa, é expulsando ou absorvendo íons hidrogênio (até um certo limite)
As variações de pH podem ser mortal ao cultivo de microrganismo, isto pode ser prevenido pela adição de um tampão ao meio.
TABELA 2: Faixa de pH ótimo para microrganismos
	Microrganismos
	pH ótimo
	Bactérias
	4 a 9
	Fungos
	5 a 6
	Protozoários
	6.7 e 7.7
	Algas
	4 a 8.5
TABELA 3: Exemplos de pH mínimo, ótimo e máximo de alguns microrganismos:
	Organismo
	pH mínimo
	pH ótimo
	pH máximo
	Thiobacillus thiooxidans
	0.5
	2.0-2.8
	4.0-6.0
	Sulfolobus acidocaldarius
	1.0
	2.0-3.0
	5.0
	Bacillus acidocaldarius
	2.0
	4.0
	6.0
	Zymomonas lindneri
	3.5
	5.5-6.0
	7.5
	Lactobacillus acidophilus
	4.0-4.6
	5.8-6.6
	6.8
	Staphylococcus aureus
	4.2
	7.0-7.5
	9.3
	Escherichia coli
	4.4
	6.0-7.0
	9.0
	Clostridium sporogenes
	5.0-5.8
	6.0-7.6
	8.5-9.0
	Erwinia caratovora
	5.6
	7.1
	9.3
	Pseudomonas aeruginosa
	5.6
	6.6-7.0
	8.0
	Thiobacillus novellus
	5.7
	7.0
	9.0
	Streptococcus pneumoniae
	6.5
	7.8
	8.3
	Nitrobacter sp
	6.6
	7.6-8.6
	10.0
5.4 ÁGUA E ATIVIDADE AQUOSA
Devido à permeabilidade seletiva da membrana citoplasmática os microrganismos podem ser afetados por alterações na concentração osmótica dos seus habitats.
A atividade aquosa é uma medida da quantidade de água disponível num habitat de um microrganismo para sua utilização. O seu valor máximo é 1 (100%) e decresce à medida que a pressão osmótica sobe por dissolução de solutos.
Em geral, os microrganismos requerem atividade aquosa próximos de 1 para se multiplicarem. Contudo,os microrganismos exibem diferente capacidade para se adaptarem a habitats com baixa atividade aquosa. Por exemplo, algumas bactérias halofílicas e fungos xerofílicos podem multiplicar-se em atividade aquosa da ordem dos 0.7.
As bactérias vivem, em geral, em meios com elevada atividade aquosa (meios hipotónicos) em que a água entra na célula e poderia levar à lise osmótica se não existisse uma parede celular rígida.
Para que não ocorra choque osmótico por excesso de diluição do citoplasma, a bactéria pode excretar ativamente a água através das aquaporinas.
5.4.1 Vida bacteriana em meios com baixa atividade aquosa:
Em habitats com baixa atividade aquosa (meios hipertónicos), o microrganismo deve manter uma alta concentração interna de solutos que retenham a água, caso contrário, a saída excessiva de água levaria à plasmólise e paragem do crescimento.
Para evitar a saída de água, os microrganismos que vivem em habitats hipertónicos mantém a concentração osmótica do protoplasma sempre acima da concentração osmótica do seu meio ambiente recorrendo aos solutos compatíveis.
Os solutos compatíveis são substâncias que permitem o crescimento e metabolismo celular mesmo em concentrações intracelulares elevadas.
5.5 RADIAÇÕES
Radiação Não-Ionizante: A radiação ultravioleta (de 4 a 400 nm - sendo 260 nm o comprimento mais eficiente) é bastante letal, mas exibe baixa penetrabilidade, não atravessando vidros, filmes sujos e outro materiais. Assim, a radiação UV é extremamente eficiente na eliminação de microrganismos presentes em superfícies. Como sua maior eficiência se dá a 260 nm, que corresponde ao comprimento de onda onde se dá a maior absorção pelo DNA, a radiação UV afeta primariamente este tipo de molécula. Sua ação é principalmente decorrente da formação de dímeros de pirimidinas (timina), efeito este que pode ser revertido por sistemas de fotorreativação (enzima de reparo ativada pela luz) ou por sistema de reativação independente da luz (polimerase). Por outro lado, não podem ser descartados outros efeitos deletérios do UV, uma vez que quando a 340 nm, observa-se dano celular, sem estar primariamente relacionado às mutações, uma vez que neste comprimento de onda os ácidos nucléicos não têm mais uma grande capacidade de absorver este tipo de radiação.
Radiação Ionizante: Radiações de pequeno comprimento de onda, portanto,de altíssima energia e penetrabilidade. Os dois principais tipos são a radiação gama e os Raios X. Estas, são bastante eficientes, uma vez que promovem a ionização de átomos, fazendo-os perderem elétrons. Como consequência são gerados radicais livres extremamente reativos, que podem destruir pontes de hidrogênio, duplas ligações, estruturas em anel. Quando na presença de oxigênio, geram radicais hidroxila livres, absolutamente tóxicos para as células. A radiação gama é originada geralmente a partir de fontes de 60Co ou 137Ce. 	Estas radiações vêm sendo amplamente utilizadas em produtos termolábeis, tais como plásticos e alguns tipos de alimentos (frutas, vegetais, alimentos marinhos). Nos alimentos seu uso é interessante, uma vez que inativam enzimas autocatalíticas que participam do processo de degradação natural.
5.6 PRESSÃO
A maior parte dos organismos vive com uma pressão de 1 atmosfera. No fundo do mar oceano (profundidade de 1000m) a pressão hidrostática pode atingir 600 a 1100 atmosferas. Assim temos:
• Bactérias barotolerantes – resistem a pressões bastante altas.
• Bactérias barofílicas – precisam de pressões elevadas para crescer ( 400 – 500 atmosferas). Ex. M. jannaschii .
5.6.1 Efeito da alta pressão hidrostática sobre os microrganismos
A APH(Alta pressão hidrostática) produz alterações morfológicas, bioquímicas e genéticas que ocorrem na membrana e na parede celular dos microrganismos (SANGRONIS et al., 1997). Além disso, aumenta a permeabilidade da célula, inibe reações energéticas e desnatura enzimas essenciais ao crescimento e à reprodução de microrganismos (CALDERÓN-MIRANDA et al., 1998). Embora muitos estudos abordem o efeito da APH sobre os microrganismos, as causas da inativação microbiana são ainda pouco compreendidas (CHEFTEL, 1995). Várias mudanças morfológicas são observadas com o aumento da pressão como compressão de vacúolos gasosos, alongamento da célula, separação da membrana da parede celular, contração da parede celular com formação de poros, modificações no citoesqueleto, modificações no núcleo e em organelas intracelulares, coagulação de proteínas citoplasmáticas e liberação dos constituintes intracelulares para o meio extracelular, entre outros (CAMPOS, DOUSUALDO e CRISTIANINI, 2003).
Uma hipótese para inativação microbiana por APH está ligada à redução da atividade da ATPase, dependente de sódio e potássio, localizada na capa de fosfolipídios da membrana celular e envolvida no transporte ativo através da membrana. Desta forma, a ATPase torna-se incapaz de manter o efluxo de prótons provocando redução do pH interno e causando a morte celular (CHEFTEL, 1995). As moléculas de DNA são mais estáveis à APH do que as proteínas devido ao fato da alta pressão favorecer as pontes de hidrogênio, principal responsável pela estrutura dos ácidos nucléicos.
Contudo, o processo de replicação e transcrição do DNA é inibido quando as células são submetidas à APH pela inativação das enzimas envolvidas nesses processos (BARBOSA-CÁNOVAS et al., 1999).
5.7 POPULAÇÃO
O tamanho da população afeta o número de novas células que serão formadas. Se a população aumenta, a taxa de crescimento também aumenta, resultando em crescimento exponencial, desde que haja disponibilidade de nutrientes e espaço.
O crescimento bacteriano exige a disponibilidade de nutrientes essenciais, tais como fontes de carbono, nitrogênio, fósforo, enxofre, ferro e outros minerais com os quais as bactérias podem sintetizar precursores de macromoléculas orgânicas e vitaminas, ou quando incapazes da síntese de um precursor essencial este deve estar presente no meio de crescimento. As bactérias são grandemente diversificadas em relação aos seus requerimentos nutricionais, sendo que, para praticamente qualquer substância há um microrganismo capaz de metabolizá-la como nutriente. A disponibilidade de nutrientes diminui à medida que a população aumenta de tamanho; enquanto houver um mínimo de nutrientes a população continuará a crescer.
À medida que a população aumenta de tamanho aumenta o consumo de nutrientes com conseqüente aumento da produção de produtos secundários do metabolismo. Esses metabólitos, quando em baixos níveis têm pouco efeito nas taxas de divisões celulares, mas em altas concentrações podem inibir a divisão celular ou mesmo matar as células, conseqüentemente, diminuindo a taxa de crescimento da população. Metabólitos tóxicos se acumulam rapidamente em grandes populações bacterianas.
O metabolismo de todos os organismos gera produtos secundários tóxicos a partir do oxigênio. Tais metabólitos são altamente reativos podendo destruir componentes celulares essenciais tais como proteínas, ácidos nucléicos e lipídios. Com exceção das bactérias anaeróbias estritas, todos os organismos sintetizam enzimas que detoxicam esses compostos, como por exemplo, as enzimas superóxido dismutase, catalase e peroxidase.
5.8 PRESENÇA DE AGENTES ANTIMICROBIANOS
Populações bacterianas têm suas taxas de crescimento afetadas quando houver a presença de agentes antimicrobianos produzidos por outras populações de microrganismos em ambientes naturais, tais como as bacteriocinas e antibióticos ou por antimicrobianos utilizados na antibioticoterapia para o tratamento de infecções bacterianas.
6 MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO
O crescimento dos microrganismos pode ser mensurado por diferentes técnicas, tais como pelo acompanhamento da variação no número ou peso de células, por exemplo. Dentre as diferentes técnicas utilizadas, descreve-se alguns.
6.1 CONTAGEM TOTAL DE CÉLULAS
Esta metodologia envolve a contagem direta das células em um microscópio, seja de amostras fixadas (e coradas) ou analisadas a fresco, (sendo aplicados cerca de 10 µl da suspensão, na maioria dos casos), utilizando-se câmaras de contagem. A contagem direta é uma técnica rápida, mas tem como principais limitações a impossibilidade de distinção entre células vivas e mortas (o que pode ser contornado pelo uso de corantes vitais, para leveduras) e contagens errôneas, devido às pequenas dimensões de algumas células, ou pela formação de agregados celulares.
Em preparações não coradas, deve-se utilizar microscópio de contraste de fase, o qual deve ser empregado apenas quando as células não estão muito diluídas (<106 células/ml).
FIGURA 7: Exemplo ilustrando o procedimento de contagem direta (Fonte: Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)
Há também os contadores eletrônicos (do tipo Coulter) usados em hematologia, que podem ser empregados na contagem de células microbianas. Em determinadas situações, por exemplo quando se requer apenas uma estimativa da quantidade de microrganismos, pode-se empregar a contagem proporcional, que corresponde a uma análise comparativa das culturas com suspensões padrão. Como exemplo de uma suspensão padrão podemos citar a escala de MacFarland, que corresponde a uma série de tubos contendo uma solução de BaSO4 em diferentes concentrações, apresentando assim, graus de turvação distintos. Desta forma, comparando-se a turvação da cultura em estudo com os tubos de MacFarland, pode-se obter uma estimativa do número de células presentes na amostra.
6.2 CONTAGEM DE VIÁVEIS
Procedimento também conhecido como contagem em placa, que estima o número de células viáveis (isto é, capazes de se reproduzir) em uma amostra. Esta metodologia envolve a coleta de alíquotas de uma cultura microbiana em diferentes tempos de crescimento, as quais são então inoculadas em meio sólido. Após a incubação dos meios, geralmente por uma noite, o número de colônias é contado. Como uma colônia normalmente é originada a partir de um organismo, o total de colônias que se desenvolvem no meio corresponde ao número de células viáveis presentes na alíquota analisada. Esta técnica deve sempre realizada empregando-se várias diluções (100 a 104 células) das amostras. A contagem de viáveis pode ser feita pela semeadura em superfície ou em profundidade ("pour plate"). Geralmente o volumea ser inoculado não deve ultrapassar 0,1 ml, para evitar a confluência das colônias. Se a técnica de semeadura em profundidade for utilizada, pode-se inocular de 0,1 a 1,0 ml de células. Esta técnica é precisa quando o número de colônias (ou placas de lise, no caso de partículas virais ) contadas situa-se entre 30 e 300 e quando as condições culturais e ambientais estão adequadas para os microrganismos analisados. Este tipo de contagem está sujeito a grandes erros (agregados, duas células próximas, originando uma colônia), que podem ser minimizados pela realização de triplicatas para cada diluição. Esta metodologia é amplamente utilizada, exibindo elevada sensibilidade, detectando baixos números de células e permitindo também a contagem de diferentes tipos de microrganismos, pelo emprego de meios seletivos (meios que favorecem o crescimento de um determinado tipo ou grupo de organismo) e/ou seletivos e diferenciais (meios que além de favorecerem o desenvolvimento de um tipo ou grupo de organismo, também permite sua distinção, a partir de alguma característica fenotípica).
Também podem ser usadas membranas filtrantes, onde os líquidos são filtrados e as membranas colocadas diretamente sobre os meios de cultura.
FIGURA 8: Técnica de contagem de viáveis (Fonte: Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)
6.3 MASSA DE CÉLULAS
Pode ser determinada a partir da estimativa do peso seco ou do peso úmido de uma cultura. Este tipo de procedimento é realizado quando não é necessário determinar o número preciso de microrganismos presentes. 
Peso seco: Muito utilizado na quantificação de fungos, onde o micélio é retirado da cultura, lavado e transferido para um frasco e submetido à secagem. Realizam-se então sucessivas pesagens, até o momento onde não observa-se mais variações. Este procedimento pode também ser realizado centrifugando-se a cultura e pesando o sedimento, ou então secando-o (100 - 150°C/16 horas) e depois pesando-o.
6.4 TURBIDIMETRIA
Quantificação em espectrofotômetro ou colorímetro a 660 nm, uma vez que neste comprimento de onda, a cor geralmente parda dos meios de cultura não interfere com os resultados. Nestes comprimentos, a absorção de luz por componentes celulares corados é desprezível mas, se necessário, outros comprimentos de onda podem ser usados. Tal metodologia requer a confecção de uma curva padrão. Embora a análise turbidimétrica seja menos sensível, é de rápida e fácil execução, não destruindo a amostra. Entretanto, não permite a determinação de células viáveis.
6.5 ANÁLISES QUÍMICAS
A partir da quantificação de proteínas ou de nitrogênio, ou por meio da análise de diferentes atividades metabólicas.
6.6 NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP)
Amplamente utilizado em laboratórios de microbiologia de alimentos ou ambiental, na quantificação de microrganismos em água, leite e outros produtos. Esta metodologia é basicamente utilizada para a pesquisa de coliformes totais e coliformes fecais, que são microrganismos indicadores de poluição fecal, o que pode ter como consequência a presença de outros organismos, tais como protozoários e vírus. Esta técnica foi desenvolvida após análises estatísticas complexas. A determinação do NMP é realizada inoculando-se 3 séries de 5 tubos, com 10, 1 e 0,1 ml da água ou do produto homogeneizado em solução salina, em meios seletivos para coliformes totais contendo tubos de Durham invertidos em seu interior. Estes são incubados por 48 hs/37°C sendo então analisados quanto ao crescimento e à presença de gás no interior dos tubos de Durham. Tal resultado é considerado como positivo para a presença de coliformes totais. Amostras dos tubos positivos são então repicados para caldos seletivos para coliforme fecais, também contendo tubos de Durham, os quais são incubados por mais 24 ou 48 hs a 42°C. De todos os tubos positivos faz-se uma semeadura em placa com meio seletivo e posterior identificação bioquímica. De acordo com o número de tubos que apresentam gás determina-se o NMP, pela consulta de uma tabela desenvolvida por Hoskins (1934). Este é um teste apenas presuntivo para a presença de coliformes.
7 CRESCIMENTO MICROBIANO
O crescimento celular é definido como o aumento coordenado de todos os constituintes celulares. Este aumento pode estar associado ao aumento do tamanho de uma célula ou do número de células, em conseqüência da multiplicação celular, ou a ambos.
Para o microrganismo o crescimento é a sua resposta principal ao ambiente e suas condições físico-químicas. O crescimento microbiano é normalmente associado ao crescimento de uma população de células de um dado microrganismo, ou seja, com o aumento do número de células da população.
 Em condições nutricionais e ambientais adequadas, às quais o microrganismo está adaptado, a população celular encontra-se numa fase de crescimento equilibrado, a fase de crescimento exponencial, pois parte desse nutriente é utilizada para produção de energia.
Grande parte dos microrganismos multiplica-se por fissão binária (Neste processo, o crescimento de uma célula individual continua até que esta se divide em duas novas células idênticas) ou por gemulação, em resultado do que uma célula dará origem a duas ao fim de um certo tempo, tempo de geração ou de duplicação.
Em geral temos a seguinte equação para o crescimento microbiano:
SUBSTRATO + CELULAS → PRODUTOS EXTRACELULARES + NOVAS CÉLULAS
 + X → + nX
A velocidade de crescimento dos microorganismos Está relacionada de forma direta com concentração celular. A velocidade especifica de crescimento é definida como:
Onde X é a concentração mássica da célula
µx é a velocidade especifica de crescimento das células. (h-1)
7.1 CURVA DE CRESCIMENTO 
O crescimento microbiano é frequentemente acompanhado com base na curva que representa o crescimento de uma população de um determinado microrganismo.
Se acompanharmos o crescimento da população de células ao longo do tempo e representarmos graficamente o logaritmo do nº de células por unidade de volume (ou, da Densidade Óptica da cultura, D.O, ou da concentração da Biomassa Microbiana, X) em função do tempo, obter-se-á uma curva característica, como ilustrado na Figura (9), que exibe as várias fases do crescimento microbiano.
FIGURA 9: Fases de crescimento microbiano.
A Tabela a seguir caracteriza resumidamente as fases do carecimento, a taxa de crescimento e as características básicas.
TABELA 4: Fases do carecimento, a taxa de crescimento e as características básicas
7.1.1 Fase de latência (ou "LAG")
Durante o período de tempo que se segue à inoculação do meio de cultura, as células do microrganismo têm normalmente que se adaptar ao novo meio. Durante este período inicial, pode, pois, não ocorrer multiplicação celular, pelo menos em condições de equílibrio. Durante este período verifica-se, por exemplo, a síntese de novas enzimas. Estas podem ser necessárias à síntese de compostos essenciais ao crescimento e que não se encontrem presentes no meio de cultura  ou para a hidrólise ou metabolização dos compostos presentes e que são as únicas fontes de carbono, azoto, etc, a que o organismo não se encontra adaptado. Esta fase dita de latência pode ter uma duração mais ou menos extensa consoante o estado fisiológico da cultura usada como inóculo e as condições de crescimento. Por exemplo, a presença de uma porcentagem elevada de células não-viáveis no inóculo, um meio de cultura contendo um nutriente essencial difícil de metabolizar ou a incubação em condições ambientais de estresse a que o organismo não se encontra adaptado, conduzem normalmente a fases de latência extensas.
7.1.2 Fase exponencial (ou "EXP")
Após um curto período de aceleração, a taxa de crescimento da população microbiana torna-se constante, isto é, as células sofrem divisão e o seu número duplica após um determinado intervalo de tempo. Durante esta fase, em que todos os nutrientes estão presentes em excesso, os microrganismos dividem-see a população cresce com uma taxa específica de crescimento máxima que depende do potencial genético do microrganismo, da composição do meio de cultura e das condições de crescimento (temperatura, pH, disponibilidade de água, etc.). Essa fase é típica de primeira ordem.
Onde x(0)=X0
Integrando:
ln(x) – ln(x0) = µx (t - 0)
ln(x/x0) = µx.t
Pode-se observar, portanto, uma equação característica exponencial.
7.1.3 Fase de desaceleração
Durante esta fase ocorre um declínio da taxa específica máxima de crescimento, em resultado da diminuição para valores limitantes do crescimento da concentração de um (ou mais) nutrientes essenciais ao metabolismo celular e/ou do aumento da concentração de produtos do metabolismo tóxicos para as células. 
7.1.4 Fase estacionária
Na fase estacionária o esgotamento de um nutriente essencial e/ou acumulação de produtos inibidores do metabolismo leva a que divisão da população pare. No entanto, em carência de nutrientes, as células podem manter-se viáveis durante períodos de tempo mais ou menos longos, à custa das reservas endógenas, que usam em processos de manutenção. Contudo, mais cedo ou mais tarde, verifica-se um declínio da concentração de células viáveis durante a fase de morte celular.
7.1.5 Fase de morte
Durante a fase de morte ocorre a perda irreversível da capacidade de divisão celular (morte celular). Tal origina um decréscimo da concentração de células viáveis na população microbiana ao longo do tempo. 
7.2 TEMPO DE GERAÇÃO OU DUPICAÇÃO
O tempo de geração ou duplicação de um microrganismo é definido como o tempo necessário para que ocorra uma geração, isto é, para a formação de 2 células a partir de uma. Entre os microrganismos procariotas (bactérias), esta ocorre principalmente por fissão binária.
FIGURA 10: Tempo de geração ou duplicação de um microrganismo
O tempo de geração ou duplicação varia grandemente entre microrganismos. Por exemplo, em condições nutricionais e ambientais ótimas, a bactéria Escherichia coli pode ter um tempo de duplicação de somente 30 minutos. Algumas bactérias podem sofrer divisão celular mais rapidamente, mas a maior parte divide-se com tempos de duplicação de 1-3 horas. Além disso, o tempo de geração/duplicação de um dado microrganismo depende da composição do meio de crescimento e de condições ambientais, como a temperatura, pH, disponibilidade de água, etc.. 
Pode-se encontrar o tempo de duplicação da seguinte forma:
Para
X será = 2X0
Onde:
ln(2) = µx g
Sendo g o templo de geração.
A Tabela abaixo demonstra algumas bactérias em diferentes meios de cultura e seu determinado tempo de geração.
TABELA 5: Tempo de geração de algumas bactérias em condições ótimas de crescimento
7.3 CRESCIMENTO EM CULTURAS CONTÍNUAS
Técnica muito usada nos processos industriais de obtenção de produtos microbiológicos.Nestes casos, tem-se o interesse em manter as células em fase log ou estacionária. 
Utilizam-se fermentadores ou quimiostatos como na Figura (11), que permitem um crescimento em equilíbrio dinâmico, havendo assim um controle da densidade populacional e da taxa de crescimento. Estes são respectivamente controlados pela concentração do nutriente limitante (fonte de C ou N) e pela taxa de fluxo (taxa de diluição).
FIGURA 11: Esquema de um quimiostato
7.4 CRESCIMENTO EXPONENCIAL
O crescimento exponencial de uma população microbiana em suspensão em meio líquido é caracterizado pela duplicação do número de células e, por conseguinte, da massa (biomassa).
7.4.1 Cinética do crescimento exponencial
Durante o crescimento exponencial, o número de células aumenta de acordo com uma exponencial de base 2. De fato, a duplicação de 2 células em 4 pode ser expressa como 21 -> 22, a de 4 em 8 é expressa como 22 -> 23, e por aí adiante. Existe pois  uma relação entre o número de células presentes no início (tempo zero) do crescimento exponencial e o número de células presente após um período t desse crescimento exponencial, dada pela seguinte equação : 
	 
células presentes no início do crescimento exponencial e n é o número de gerações que ocorreram durante o período t de crescimento exponencial. É possível exprimir o parâmetro n em função de Nt e N0, numa população em crescimento exponencial, com base na equação:
	 
O tempo de duplicação ou geração, g, pode ser calculado como t/n, onde t é o tempo de duração (horas ou minutos) do crescimento exponencial e n o número de gerações ocorridas durante essa fase do crescimento exponencial.
7.4.2 Cálculo da taxa específica de crescimento
Para uma população de células em crescimento exponencial, se representarmos graficamente os valores do número de células em função do tempo de crescimento, obtém-se uma função exponencial representado aritmética na Figura 12 . Esta é representada pela equação: 
	 
Esta traduz o caráter exponencial do crescimento microbiano, e onde Nt é a concentração de células no tempo e N0 é a concentração de células no inicio do crescimento exponencial.
Se aplicarmos logaritmos naturais de um e do outro lado da equação que acabamos de apresentar, obtém-se:
	 
Onde μ é a taxa específica de crescimento do microrganismo em causa, nas condições de crescimento testadas (as suas unidades são o  inverso do tempo; por exemplo h-1, min-1). Este parâmetro do crescimento, que reflete a sua cinética, corresponde ao declive da reta que resulta da representação gráfica do logaritmo natural do número de células em função do tempo. 
FIGURA 12: Representação da função exponencial aritmética.
A taxa específica de crescimento está relacionada com o número de gerações (ou o tempo de cada geração) que ocorrem por unidade de tempo numa cultura em crescimento exponencial. De fato, quanto maior for à taxa específica de crescimento, mais rapidamente se divide a população, maior é o número de gerações que ocorrem no mesmo período de tempo e menor é o tempo de cada geração. A partir dos resultados de uma experiência de crescimento como os apresentados, é possível calcular o valor da taxa específica de crescimento da população microbiana.
A taxa específica de crescimento pode ser relacionada com o número, a massa ou a concentração de componentes celulares em função do tempo.
Onde :	
N = número células/mL
 X = massa células / mL
Z = concentração qualquer componente celular/mL
t = tempo m = taxa específica de crescimento
7.5 APLICAÇÕES DO CONHECIMENTO DA CURVA
A fase lag e a exponencial são as de maior interesse para os microbiologistas de alimentos, pois para a maioria dos alimentos, a deterioração ocorre antes dos microrganismos chegarem à fase estacionária.
No caso de um estudo de shelf life de produto, quanto maior a fase lag, maior o shelf life, assim como quanto maior a velocidade de crescimento na fase exponencial, menor o shelf life. Esta averiguação é feita como no caso da Figura (5).
FIGURA 13: Representação da curva de crescimento
Os modelos probabilísticos correspondem a modelos para prever a probabilidade de algum evento,como por exemplo, a germinação de esporos ou a formação de uma quantidade de toxina detectável, em um determinado período de tempo. Amostras em replicata de um inóculo conhecido são incubadas por um período fixode tempo, sob condições ambientais definidas e a proporção de replicatas positivas para o crescimento/produção de toxina é então analisada.
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CONCLUSÃO
Inúmeros fatores que afetam o crescimento microbiológico estão diretamente relacionados com os meios, meios de cultura, onde esses microorganismos se encontram. Isso possibilita que tais fatores possam ser controlados artificialmente. Esses fatores aliados a uma nutrição favorável promovem uma eficiente ferramenta no uso industrial de tecnologias vivas. Possibilitam a otimização de todas as etapas da curva de crescimento. 
Fatores como pH, quantidade de nutrientes e oxigênio, temperatura,são diretamente controlados nos meios de cultura, sendo usados inclusive para criar meios seletivos. Cada um dos fatores afeta diretamente o formato da curva de crescimento, já que essa é baseada em condições ótimas.
O crescimento dos microrganismos pode ser mensurado por diferentes técnicas, diretas e indiretas, tais como pelo acompanhamento da variação no número ou peso de células por exemplo. Isso permite controlar a população presente ou detectar microorganismos presentes ou não em determinado meio.
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SHULER, M. L.; KARGI, F. – Bioprocess Engineering – Basic Concepts, Prentice Hall Int., NJ, 1992
Utilização de curvas de crescimento. www.e-escola.pt/site/topico.asp?topico=234. Acesso em 06 de ago de 2008.
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ANEXO 1
Questões relativas ao trabalho e respectivas respostas:
Descreva a classificação nutricional dos microorganismos.
Resposta:
Fotoautotróficos: são organismos que usam a luz como fonte de energia e o carbono inorgânico (CO2) como fonte de carbono. 
Fotoheterotróficos: usam luz como fonte de energia e compostos orgânicos (álcool, carboidratos, ácidos orgânicos, etc.) como fonte de carbono. 
Os microrganismos que obtêm energia através da oxidação de compostos orgânicos ou inorgânicos podem ser classificados em:
Quimioautotróficos: usam os compostos químicos (gás sulfídrico (H2S), enxofre elementar (S), amônia (NH3), gás hidrogênio (H2), nitrato (NO3-), nitrito (NO2-) e ferro (Fe2+) como fonte de energia e usam o CO2 como fonte de carbono.
Quimioheterotróficos: são organismos que usam compostos orgânicos como fonte de energia e de carbono. Este grupo inclui a maioria das bactérias, fungos e protozoários.
Qual a função e classificação dos nutrientes? Exemplifique.
Resposta:
Os nutrientes são definidos como as substâncias encontradas no ambiente, que participam do anabolismo e catabolismo celular, podendo ser divididos em dois grandes grupos: macronutrientes, que são necessários em grandes quantidades e micronutrientes, necessários em pequenas quantidades. Alguns nutrientes são utilizados como fonte de material para a biossíntese das moléculas, enquanto outros correspondem a fontes de energia, necessária aos processos biossintéticos e de manutenção dos organismos. 
Para crescer, todos organismos necessitam de uma variedade de elementos químicos como nutrientes. Estes elementos são necessários tanto para a síntese como para as funções normais dos componentes celulares. Eles existem na natureza em uma grande variedade de compostos, que são orgânicos ou inorgânicos. Os elementos químicos principais para o crescimento da célula incluem carbono, nitrogênio, oxigênio, enxofre e fósforo. 
Quais são os 4 grupos de temperaturas ótimas de crescimento, para os microrganismos?
Resposta:
Psicrófilos (0 a 20°C, ótimo de ≈ 15°C - Flavobacterium), mesófilos (12 a 45°C, 37°C - E. coli), termófilos (42 a 68°C, 62°C - Thermococcus), e hipertermófilos (80 a 113°C, 105°C - Pyrodictium brockii).
O que ocorre com os microrganismos quando está em um ambiente de elevada pressão hidrostática?
Resposta:
A APH produz alterações morfológicas, bioquímicas e genéticas que ocorrem na membrana e na parede celular dos microrganismos. Além disso, aumenta a permeabilidade da célula, inibe reações energéticas e desnatura enzimas essenciais ao crescimento e à reprodução de microrganismos.
Qual o efeito da toxidade gerada a partir do metabolismo dos microrganismos
Resposta:
O metabolismo de todos os organismos gera produtos secundários tóxicos a partir do oxigênio. Tais metabólitos são altamente reativos podendo destruir componentes celulares essenciais tais como proteínas, ácidos nucléicos e lipídios
Cite um método de contagem direta de microorganismos. Explique-o.
Resposta:
Contagem total de células. Esta metodologia envolve a contagem direta das células em um microscópio, seja de amostras fixadas (e coradas) ou analisadas a fresco, (sendo aplicados cerca de 10 µl da suspensão, na maioria dos casos), utilizando-se câmaras de contagem. A contagem direta é uma técnica rápida, mas tem como principais limitações a impossibilidade de distinção entre células vivas e mortas (o que pode ser contornado pelo uso de corantes vitais, para leveduras) e contagens errôneas, devido às pequenas dimensões de algumas células, ou pela formação de agregados celulares
Cite um método de contagem indireto de microorganismos. Explique-o.
Resposta:
Análises químicas: A partir da quantificação de proteínas ou de nitrogênio, ou por meio da análise de diferentes atividades metabólicas.
Calcular o tempo de geração de uma cultura cuja população celular passa de 103 para 108 após 5 horas de cultivo.
Resposta:
N= No x 2n
 onde:
N= número final de células
No= número inicial de células
n= número de gerações
Aplicando logaritmo (log):
log (N) = log (No) + n log(2)
n = log (N) – log(No / log 2)
n = log (N) - log (No / 0,301)
n = 3,3 (log N-log No)
n = 3,3 (log 108 - log 103)
n = 3,3 (8-3) = 16,5 gerações
g = 5 / 16,5 = 0,3 horas
Tempo para duplicar a população celular foi de 0,3 horas.
Após um curto período de aceleração, a taxa de crescimento da população microbiana torna-se constante, as células sofrem divisão e o seu número duplica após um determinado intervalo de tempo. 
Que fase do crescimento microbiano caracteriza o trexo acima? Como podemos provar o ocorrido matematicamente?
Partir da equação:	 
Resposta:
Fase exponencial (ou "EXP"). Essa fase é típica de primeira ordem.
Onde x(0)=X0
Integrando:
ln(x) – ln(x0) = µx (t - 0)
ln(x/x0) = µx.t
Pode-se observar, portanto, uma equação característica exponencial.
Cite as fases decorrentes da curva de crescimento microbiano. Exemplifique uma das fases a partir de uma aplicação do seu conceito.
Resposta:
Fase de latência (ou "LAG")
Fase exponencial (ou "EXP")
Fase de desaceleração
Fase estacionária
Fase de morte
A fase lag e a exponencial são as de maior interesse para os microbiologistas de alimentos, pois para a maioria dos alimentos, a deterioração ocorre antes dos microrganismos chegarem à fase estacionária.
Quanto maior a fase lag, maior o o prazo de validade, assim como quanto maior a velocidade de crescimento na fase exponencial, menor o prazo. 
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