Slides aula 18

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SINOPSE
* Assunto: DNA mitocondrial.
* Pré-requisito: Noções básicas de ácidos nucléicos e 
Citologia.
* Objetivo: Reconhecer a aplicação do DNA mitocondrial 
em procedimentos de identificação por DNA.
* Bibliografia:
1 – MYR. Genômica.
2 – PIERCE. Genética. Um enfoque conceitual.
3 – WATSON. Biologia Molecular do gene.
4 – ALBERTS. Biologia Molecular da Célula.
Paulo Roberto Queiroz.
Dr. Biologia Animal – UnB.
DNA mitocondrial
Análise de DNA
Consiste...
...gerar e interpretar padrões alélicos para:
1 – Identificar:
- Um indivíduo;
- Uma forma representativa de um grupo ou
espécie.
2 – Determinar:
- Procedência de um material biológico (células ou
ou espécimens);
- Evidência de valor forense.
Como são estudadas as diferenças genéticas???
São usadas várias estratégias de obtenção de
padrões de DNA.
Cada estratégia � Utiliza um método de
detecção de polimorfismo.
Exemplos:
* DNAmt:
� iniciadores de PCR específicos;
� Sequenciamento;
� PCR-RFLP � enzima de restrição.
Como são estudadas as diferenças genéticas???
Os padrões polimórficos podem se representados por:
- Código de barras;
- Picos;
- Traços;
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MARCADOR
Representa todo e qualquer fenótipo de um gene
expresso (isoenzimas),
ou de um segmento do DNA que corresponde a
regiões (expressas ou não) do genoma.
O que se estuda???
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Quando se usam as técnicas de biologia molecular?
Existência de vestígios tais como:
1. Exúvia ou pupário;
2. Insetos incompletos ou danificados;
3. Precário estado de conservação;
4. Estágio de vida (ovos ou larvas);
5. Proximidade morfológica;
6. Insetos em fase imatura.
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PCR
Polymerase Chain Reaction
Reação em Cadeia de Polimerase
Mullis, K. B. and Faloona, F. A. (1987).
Specific synthesis of DNA in vitro via a 
polymerase-catalyzed chain reaction. 
Methods in Enzymology, 155, 335-350.
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Vantagens do PCR
Permite analisar um nº elevado de organismos ao
mesmo tempo.
* Facilidade;
* Versatilidade;
* Rapidez;
* Sensibilidade
* Usar quantidades reduzidas de DNA.
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Termociclador
Eletroforese
Técnica de PCR - mtDNA
Vantagens do mtDNA
1 - Facilidade de isolamento e amplificação;
2 - Elevado número de cópias;
3 - Isolamento de tecidos mal conservados;
4 - Seqüências muito conservadas.
5 - Baixa taxa de recombinação;
6 - Seqüências muito conservadas;
7 - Organização gênica uniforme.
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Propriedades do DNAmt
* Encontra-se entre as menores moléculas de DNA;
* Circular com um tamanho de 16.569 pares de bases;
* Genes codificando 13 proteínas, 2 rRNAs e 22 genes
tRNA;
* As fitas de DNA mitocondrial tem uma distribuição
assimétrica de guaninas e citosinas, o que gera uma cadeia
pesada (H) e outra leve (L).
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Propriedades do DNAmt
* Cada fita é transcrita a partir de um promotor PL e PH1,
localizados na região controle, na qual se inclui o D-Loop;
* D-Loop � é uma região gerada pela síntese de um
segmento curto da cadeia pesada H denominado 7S DNA,
onde se encontra a origem da replicação da cadeia H.
Propriedades do DNAmt
* D-Loop � Esta região é muito importante do ponto de
vista forense, devido ser uma região hipervariável e
suficientemente pequena para ser abordada por meio de
seqüenciamento por PCR.
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Duplicação do mtDNA, formando alça D-Loop na cadeia pesada.
Propriedades do DNAmt
* Devido sua grande variabilidade, a região controle é a que
normalmente se analisa.
* Mede aproximadamente 1.100 pares de base e se subdivide em duas
regiões maiores:
- a região hipervariável 1 (HVI), que compreende as posições
16.024 a 16.035;
- a região hipervariável II (HVII), que compreende as
posições 73 a 340;
- e uma região hipervariável menor (HVIII) .
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Propriedades do DNAmt
A região controle é responsável pela regulação da
replicação e da transcrição de todo o mtDNA.
A replicação tendo início nesta região é realizada
por deslocamento de uma fita em relação à outra,
formando uma alça, denominada D-Loop.
Na região controle, são verificados os
polimorfismos do DNAmt.
Propriedades do DNAmt
A grande variação desta região é devida a vários
fatores:
i) o mtDNA é muito sensível ao dano oxidativo causado
principalmente por um grande número de radicais livres
proporcionado um ambiente favorável a mutação do DNA.
ii) o mtDNA não possui histonas, que exerce um papel
protetor no DNA;
Propriedades do DNAmt
A grande variação desta região é devida a vários
fatores:
iii) a mtDNA polimerase possui uma pobre atividade
reparadora se comparada a polimerase nuclear.
iv) a reparação do DNA dependente de excisão de
nucleotídeos não está presente em mitocôndrias.
Diferenças entre o DNA Nuclear e o DNA Mitocondrial.
PARÂMETRO DNA NUCLEAR DNA MITOCONDRIAL
Localização No núcleo da célula, protegido pela 
membrana nuclear
Nas mitocôndrias, protegidas pela 
membrana mitocondrial – influência 
de radicais livres
Conformação Dupla hélice Dupla fita circular
Mecanismo de proteção Protegido por histonas Desprovido de histonas
N de Genes 100.000 genes 37 genes
Funcionamento Autônomo Necesita da cooperação do DNA 
nuclear
Composição Regiões codificantes (éxons) e não 
codificantes (íntrons) 90% DNA codificante
Característica do genoma Genoma diploide (materno/ paterno) 
– sofre recombinação
Genoma haploide (herança materna) 
– não sofre recombinação
Formação momentânea de fita 
simples
N de pares de bases Bilhões de pares de bases 16.569 pares de bases
Atividade da Polimerase Grande Fraca
Sistema de reparo Presente Ausente
Taxa de evolução Pequena 5 a 10 x maior que a nuclear
N de DNA por célula 1 1.000 a 10.000
Ancestralidade humana
DNAmt � Herança materna. Fêmea
ancestral viveu na África a 100.000
anos. “Eva mitocondrial”.
Haplogrupos do DNAmt
* O DNAmt tem 26 clados (classificados de A a Z).
* Cada haplogrupos � divisão de subclados (L1A1,
L1A2…)
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Em evolução molecular � haplogrupo � é um
grupo grande de haplótipos, que são séries de alelos em
lugares específicos de um cromossomo.
� Em genética humana, os haplogrupos mais
comumente estudados são:
� Haplogrupos do cromossomo Y (DNA-Y);
� Haplogrupos de DNA mitocondrial (DNAmt).
Obs. podem ser usados para definir populações
genéticas.
Fatos da Vida…
�Haplogrupo não é o mesmo que haplótipo;
� Todas as pessoas estão ligadas a um dos 18 clados da
linhagem patrilínea ancestral ou dos 26 clados da
linhagem matrilínea;
�Sabendo o seu haplogrupo � conhecer a rota
migratória a partir da África – não é preciso!!!!;
�Todas as pessoas pertencem a um certo haplogrupo
que é único para a sua ancestralidade.
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Mitochondrial DNA cytochrome oxidase I gene:
potential for distinction between stages of some
forensically important fly species (Diptera) in western
Australia
Michele L. Harvey, Ian R. Dadour, Silvana
Gaudieri
Forensic Science International 131 (2003) 134-139
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DNAmtDNAmt ChrysomyaChrysomya albicepsalbiceps
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C. dubia
L. sericata
L. sericata
The Mitochondrial Control Region of Blowflies
(Diptera: Calliphoridae): A Hot Spot
for Mitochondrial Genome Rearrangements
Gustavo Turqueto Duarte, Ana Maria L. De
Azeredo-espin, Ana Carolina M. Junqueira
J. Med. Entomol. 45(4) (2008) 667-676
Entomological Society of America
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Técnica de PCR-RFLP
1 - Obtenção dos insetos;
2 - Extração de DNA;
3 - PCR de uma região específica do mtDNA;
4 - Digestão com enzima de restrição;
5 - Eletroforese em agarose;
6 - Comparação dos perfis moleculares.
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Metodologia do PCR-RFLP
mtDNA
DNAtyping for identification of some species of
Calliphoridae: An interest in forensic entomology
Yvan Malgorn, Raphael Coquoz
Forensic Science International 102 (1999) 111–119
Perito Químico Forense – área: Biologia - RS - 2008 - IGP/RS. Considerando os
marcadores genéticos uniparentais, assinale a afirmativa INCORRETA.
a) A herança do DNA mitocondrial é do tipo matrilinear, ou seja, uma característica
mitocondrial só poderá ser herdada através da mãe.
b) Na herança mitocondrial nenhum descendente de um homem afetado será afetado.
c) DYS29 é a nomenclatura utilizada para denominar segmento de DNA único,
número 29, do cromossomo Y.
d) O DNA mitocondrial está presente em todas as células eucarióticas.
e) Para os marcadores genéticos patrilineares, que se localizam na região não
recombinante, os homens são hemizigotos.