prova pratica microbiologia

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1 PROVA PRÁTICA DE MICROBIOLOGIA: 
ESTERILIZAÇÃO: Processo de destruição ou eliminação de TODAS as formas de vida microbiana. Método físico ou químico (esterilizante)
DESINFECÇÃO: Processo de destruição ou eliminação dos patógenos na forma VEGETATIVA. Método físico ou químico (desinfectante) 
ANTISEPSIA: Desinfecção química de pele, tecido e mucosas. Agente antisséptico. 
DEGERMEÇÃO: Remoção de micro-organismo por ação mecânica em uma área limitada da pele. 
GERMICIDA: Agente químico que mata germes (micróbios)
BACTERICIDA: mata bactérias, FUNGICIDA: mata fungos e VIRUCIDA: mata vírus. 
ASSEPSIA: ausência de microrganismos em uma área.
TECNICAS ASSEPTICAS: previnem a entrada de microrganismos. 
O controle de microorganismos se refere às diferentes formas de matar ou remover os microorganismos, reduzir o número e inibir o crescimento. O método de escolha depende do tipo de material que contém o microrganismo. Este controle pode ser feito através de métodos físicos e métodos químicos. Abaixo estão os principais métodos físicos.
Calor
Quando uma população de bactérias é submetida ao calor, suas proteínas são desnaturadas. Há fluidificação dos lípideos na presença de calor úmido. Os microorganismos são considerados mortos quando perdem a sua capacidade de se multiplicar de forma irreversível. Quando falamos de calor seco, oxidação. Porém devemos levar em consideração que cada microorganismo responde de uma forma, de acordo com sua resistência, quantidade e estágios metabólicos. O método a ser escolhido deve ser aquele mate as formas mais resistentes de microorganismos. Os três parâmetros que podem expressar essas diferenças: temperatura, tempo e grau de resistência.
Quando uma população microbiana é submetida ao calor, a redução do número de indivíduos viáveis ocorre de forma exponencial. Portanto, quanto mais tempo se passar exposto ao calor, menor a quantidade de microorganismos em determinado meio. Segundo Flavio Alterthum, um material será considerado estéril quando trabalhamos na faixa de probabilidade de encontrar um indivíduo vivo é de 1/10-6 (um para um milhão).
Calor úmido
a) Fervura
O mecanismo de ação da fervura é a desnaturação de proteínas. Não é um método de esterilização, mas após cerca de 15 minutos de fervura pode matar uma grande quantidade de microorganismos, mas não é eficaz contra endósporos bacterianos e alguns vírus. Normalmente este método é utilizado em desinfecções caseiras, preparo de alimentos, etc.
b) Autoclavação
O mecanismo de ação da autoclavação é a desnaturação de proteínas. Se os materiais a serem submetidos à autoclavação não forem deformados pelo calor ou umidade, este é o melhor método a ser empregado. A autoclave é um aparelho que trabalha com temperatura e pressão elevadas. Quando os microorganismos estão diretamente em contato com o vapor a esterilização é mais eficaz. Utiliza-se esse processo para esterilização de meios de cultura, soluções, utensílios e instrumentos.
c) Pasteurização
O mecanismo de ação da pasteurização também é a desnaturação de proteínas. Este método foi desenvolvido por Louis Pasteur em 1846. Consiste em aquecer o produto em uma determinada temperatura, por um certo tempo e logo após, resfriá-lo. Este processo reduz o número de microorganismos, mas não assegura sua esterilização. Muito utilizado na esterilização de leite, creme de leite, cerveja, vinho, etc.
Calor Seco
a) Flambagem
É um método simples, porém muito eficaz. Consiste em colocar a alça de platina diretamente sobre o fogo, oxidando todo o material até virar cinzas.
b) Incineração
Também é muito eficaz. Utilizado para incinerar diversos tipos de materiais, como papéis, materiais hospitalares, carcaças de animais, etc. Também oxida todo o material até virar cinzas.
c) Fornos
Normalmente é utilizado para esterilizar vidrarias. Deve-se atentar bem à relação tempo x temperatura.
Filtração
A passagem de soluções ou gases através de filtros retém os microorganismos, então pode ser empregada na remoção de bactérias e fungos, entretanto, passarão a maioria dos vírus.
Radiações
Dependem do comprimento de onda, da intensidade, da duração e da distância da fonte para esterilizar.
Ionizantes
Utilizam radiações gama, mas tem um custo elevado. Formam radicais superativos e destroem o DNA. Utilizado para esterilização de produtos cirúrgicos.
Não-ionizantes
A mais empregada é a luz ultravioleta, que altera o DNA através da formação de dímeros. As lâmpadas germicidas são de baixo poder de penetração.
Baixas temperaturas
Não têm efeito esterilizante, apenas interrompem o crescimento bacteriano, preservando os microorganismos.
Microondas
As radiações emitidas não afetam o microorganismo, mas geram calor, esterilizando meios de cultura e materiais. Por isso têm sido cada vez mais utilizados.
Indicadores Biológicos
Neste método, suspensões-padrão de esporos bacterianos são submetidos à esterilização juntamente com os materiais a serem esterilizados. Após o processo, os indicadores são colocados em meios de cultura adequados. Se não houver crescimento, é porque o processo de esterilização foi eficiente.
Pressão Osmótica
Quando em contato com meios hipertônicos (alta concentração de sais e açúcares) as células dos microorganismos perdem água por osmose, ficando murchas, impedindo assim o crescimento bacteriano. Método utilizado para conservar alimentos.
Dessecação
Este é um método para preservação de microorganismos. Sabe-se que na ausência de água alguns microorganismos têm o seu metabolismo reduzido e até ausente, porém permanecem viáveis. Através da liofilização a água é removida do interior das células e os microorganismos são preservados em condições especiais de armazenamento e temperatura.
MEIOS DE CULTURA: 
Para a realização de uma cultura bacteriana, são necessários um inóculo e um meio de cultura. O crescimento dos micro-organismos nos diferentes meios de cultura fornecerá as primeiras informações para a sua identificação. O potencial de crescimento de cada meio de cultura deve ser conhecido, fazendo com que seja possível adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material.
O meio de cultura consiste em substância líquida ou gelificada, simples ou complexa, que permite a nutrição, o crescimento e a multiplicação dos micro-organismos. Alguns procedimentos são fundamentais na hora de preparar cada meio de cultura, a fim de obter melhores resultados e evitar contaminações.
Os meios de cultura podem ser classificados de acordo com o seu estado físico, pela sua composição e a sua utilização. No que se refere ao seu estado físico, os meios podem ser líquidos ou gelificados; em relação à composição do meio, podem ser classificados como naturais, sintéticos e semi-sintéticos. Já em relação à sua prática laboratorial, pode-se considerar os meios de base, os meios enriquecidos e os meios seletivos.
Os meios gelificados permitem o crescimento das células formando colônias e são obtidos a partir de um meio líquido ao qual é adicionada uma substância gelificante que, no princípio, era a gelatina, mas passou a ser o ágar-ágar.
A cultura bacteriana utiliza diferentes tipos de gel ágar, sendo que cada um deles tem uma especificidade. Confira a seguir as características de alguns deles:
Ágar nutriente (AN)
Trata-se de um meio relativamente simples e muito usado nos procedimentos do laboratório de microbiologia. As suas finalidades incluem a análise de água, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas à exames bacteriológicos.
Ágar sangue (AS)
O meio oferece excelentes condições de crescimentos para a maioria dos micro-organismos. Dentre as suas finalidades estão o isolamento de micro-organismos não fastidiosos e verificação de hemólise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp.  
Ágar chocolate (CHOC)
É amplamente utilizado para o cultivo de micro-organismos exigentes.
COLORAÇÃO DE GRAM: 
É chamado de coloração de Gram o método de coloração utilizado para diferenciar espécies bacterianas em dois grupos, bactériasgram-positivas e gram-negativas. Entre os fatores que irão diferenciar gram-positivos de gram-negativos, está a coloração das bactérias, a composição e propriedades químicas e físicas das paredes celulares.
Outro método de diferenciação é a detecção de quantidade de peptídeoglicano nas bactérias gram-positivas e nas bactérias gram-negativas. As bactérias gram-positivas serão azul violeta, enquanto as gram-negativas serão vermelhas.
A estrutura que as bactérias irão apresentar é outro aspecto que pode ser levado em consideração para diferenciar as bactérias gram-positivas das gram-negativas.
O método de coloração de Gram é considerado um dos mais importantes dentro dos laboratórios de análises clínicas e microbiologia. Em laboratórios de análises clínicas, por exemplo, a técnica é essencial para obtenção de resultados. As bactérias são caracterizadas como gram-positivas ou gram-negativas em esfregaços de pus ou fluídos orgânicos, permitindo que o profissional do laboratório possa monitorar as infecções.
A técnica de coloração Gram em análises clínicas é usada principalmente para identificar preliminarmente a morfologia das bactérias ou para estabelecer se há um número significativo de bactérias nas amostras clínicas.
Apesar da resposta positiva obtida com os resultados das técnicas de coloração de Gram, outros métodos de identificação bacteriana devem ser utilizados para que o resultado seja o menos controverso possível.
Vale ressaltar que algumas bactérias não se coram ou coram-se fracamente.
Bactérias gram-positivas e gram-negativas, após a coloração de Gram. Fotos: Y_tambe / Wikimedia Commons ([1][2]) [CC-BY-SA 3.0]
Materiais
Lâminas para microscopia; óleo de imersão; lamínulas; microscópio; alça de platina; bico de Bunsen; tubo contendo solução com água esterilizada e corante: cristal de violeta.
Bactérias gram-positiva: lugol
Estafilococcus aureus - Safranina
Staphylococcus saprophyticus - Álcool 95%
Bactéria gram-negativa: gaze
Escherichia coli - Pisseta água destilada
Procedimentos
Em uma lâmina, contendo esfregaço seco, cubra-o pingando gotas de violeta-de-metila e deixe agir por 15 segundos;
Adicione água ao esfregaço, em cima do violeta-de-metila, cobrindo toda a lâmina. Deixe agir por mais 45 segundos;
Após o tempo corrido, escorra o corante e lave o esfregaço em um filete de água corrente.  Cubra a lâmina com lugol ou Iodo de Gram e deixe por 60 segundos;
Escorra todo o lugol e lave em um filete de água corrente;
Aplique álcool etílico a 95%, ou acetona, para descorar a lâmina por 10 a 20 segundos;
Lave em um filete de água corrente;
Cubra toda a lâmina com safarina e deixe corar por aproximadamente 30 segundos;
Lave a lâmina em um filete de água;
Seque a lâmina com auxílio de um papel de filtro limpo ou deixe-a secar ao ar livre;
Aplique uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço e observe no microscópico com objetiva de imersão (100 X).
A técnica que consiste na coloração das bactérias apresenta diagnóstico clínico correto em 80% dos testes realizados, levando em consideração a simplicidade e velocidade da técnica, o número é extremamente positivo. Essa técnica ainda possui baixo custo e instalações simples.
Coloração de Ziehl-Neelsen
Quando a coloração de gram não pode ser utilizada, normalmente é devido aos bacilos ácidos resistentes (BAAR), então usamos a coloração de Ziehl-Neelsen.
Na parede celular das bactérias do gênero Mycobacterium o peptidioglicano contém ácido N-glicolilmurâmico em vez de ácido N-acetilmurâmico. Além disso 60% da parede bacteriana é composta de lipídeos ramificados complexos que confere uma certa impermeabilidade ao cristal-violeta e outros compostos. Ou seja a coloração de gram não funciona esse tipo de bactéria.
Então para conseguirmos fazer com que as bactérias se corem utilizamos calor e detergentes. Essa técnica usa um corante primário, secundário e um descorante. A fucsina fenicada é utilizada como corante primário e o calor é empregado para fixar o corante na célula bacteriana. O ácido carbólico (fenol) é adicionado à fucsina básica, como um intensificador químico do corante primário. O agente descorante é uma solução de HCl à 3% em álcool 95%.Essa solução é mais forte do que a mistura de álcool-acetona utilizada na coloração de Gram. O corante secundário é o azul de metileno a 1% que proporciona o contraste para facilitar a observação das bactérias álcool-ácido resistente.
É uma coloração específica que ajuda no diagnóstico de tuberculose pulmonar e hanseníase.
Imagem 4 – Arquivo pessoal
A técnica de coloração de Ziehl-Neelsen é realizada seguindo as etapas abaixo:
Cobrir o esfregaço com uma solução de fucsina fenicada (ou fucsina de Ziehl);
Aquecer a lâmina com uma lamparina até emissão de vapores, durante cinco minutos. O corante não deve ferver e nem secar totalmente, se diminuir por evaporação, deve ser reposto de maneira que o esfregaço permaneça sempre coberto;
Remover o excesso de corante e descorar com uma solução de álcool-ácido;
Lavar em água corrente;
Cobrir o esfregaço com solução de azul de metileno. Aguardar de 15 a 30 segundos;
Lavar em água corrente;
Secar em papel filtro;
Observar a lâmina na objetiva de imersão.
MÉTODO DE ALBERT-LAYBOURN
O método de Albert-Laybourn baseia-se no fato de algumas bactérias apresentarem corpúsculos citoplasmáticos localizados nas regiões polares(corpúsculos metacromáticos ou corpúsculos de Babes Emst) da célula bacilar, que se coram pelo Lugol forte (de cor marrom), se evidenciando em contraste com o corpo bacilar, que se cora em verde-azulado pela solução de Laybourn. Tais características encontramos nas corinebactérias e difteróides, e tal metodologia descria, associada aos sintomas clínicos característicos da difteria, possibilita um diagnóstico presuntivo da doença pela microscopia ótica.
 
FONTANA TRIBONDEAU
É um método de impregnação de espiroquetas, não é um método de coloração, já que a espiroqueta não será corada, e sim, sofrerá uma impregnação na sua parede celular.
IMAGEM DO TREPONEMA PALLIDUM 
BOATOS QUE VAI CAIR LEVEDURAS: 
Levedura
- células hexagonais
- gram +
- Fungo unicelular
ALCOOL 70% PORQUE É MELHOR DESINFECTANTE? 
O álcool 70% possui concentração ótima para o efeito bactericida, porque a desnaturação das proteínas do microrganismo faz-se mais eficientemente na presença da água, pois esta facilita a entrada do álcool para dentro da bactéria e também retarda a volatilização do álcool, permitindo maior tempo de contato.
Neisseria gonorrhoeae
Staphylococcus
- Gram +
- cachos
Diplococos
- Gram +
OBS: Parecem staphylococcus, mas quando aproximamos vemos as células individualizadas, vemos que são diplococos em cachos.
Staphylococcus spp
Streptococcus spp