Microscopia Forense

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MICROSCOPIAS
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO
- O padrão de transparência será ampliado pelas lentes intermediária e projetora, que projeta a imagem para um anteparo fluorescente, uma chapa fotográfica ou um monitor de TV
 - A imagem é eletrodensa, (escura) quando os elétrons encontram ósmio, ferro, chumbo e ouro
 - A imagem é eletrolúcida (clara) quando os elétrons encontram hidrogênio, oxigênio, nitrogênio e carbono
 - O material é geralmente eletrolúcido, devendo ser contrastado com
 - Os elétrons são têm de interagir com o objeto para fornecerem a imagem
 - O objeto tem de ser extremamente fino, para permitir a passagem dos elétrons
Microscopia do epitélio da traquéia, com células ciliadas e microvílos
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MICROSCOPIAS
Microscopia Eletrônica
 Resolve a estrutura fina da célula
 O Microscópio Eletrônico de Transmissão é maior e invertido, 
 comparado ao de luz
 A fonte de iluminação é um FILAMENTO ou CÁTODO que 
 transmite elétrons do topo de uma coluna cilíndrica de cerca 
 de 2m de altura
 Como os elétrons são espalhados por colisões com moléculas de ar,
 o ar precisa ser primeiro bombeado para fora da coluna para criar
 vácuo
- Os elétrons são acelerados a partir do filamento por um ânodo, e
 atravessam um pequeno orifício para formar um feixe de elétrons
 que desce pela coluna
 Bobinas magnéticas colocadas em intervalos ao longo da coluna, 
 convergem o feixe de elétrons 
 A amostra e colocada no vácuo, por meio de uma câmera de compressão,
 na trajetória do feixe de elétrons
 Alguns dos elétrons que atravessam a amostra são espalhados pelas 
 estruturas coradas com material eletrodenso, o restante é focado para
 formar uma imagem tanto em uma placa fotográfica como em uma 
 tela fosforescente
 Como os elétrons dispersos são desviados do feixe, as regiões densas
 são destacadas coma áreas de fluxo reduzido de elétrons, as quais 
 aparecem escuras
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MICROSCOPIAS
Microscopia Eletrônica de Varredura
Obs.1: Microscópios menores, mais baratos
 Os elétrons são espalhados, emitidos a partir da superfície da amostra.
 A amostra é fixada, desidratada e coberta com uma camada fina de metal pesado 
 (platina). 
 Resolução não é muito alta, cerca de 10 nm. 
Obs.2: Se forem partículas pequenas, ex. vírus, o microscópio eletrônico de transmissão
Pode fornecer uma imagem tridimensional. 
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Estéreocílio que se projeta de uma célula ciliada do ouvido interno de um sapo boi. 
A) M. de Varredura B) Microscopia de contraste interferência diferencial 
C) M. de Transmissão a partir de seções finas. 
MICROSCOPIAS
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Os frutos que sofreram Compressão não apresentaram sintomas externos prontamente visíveis, ou seja, o pericarpo dos frutos mostrou-se intacto após a injúria, mas quando se fez a observação de suas estruturas em microscópio eletrônico de varredura, observou-se desarranjo, como é mostrado na Figura 1 B. Esses desarranjos, provavelmente, foram causados pelo colapso dos carboidratos após a injúria (CHINACHOTI & STEINBERG, 1984), bem como pelo rompimento das células oleaginosas. 
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MICROSCOPIAS
Microscopia Eletrônica de Transmissão
Microscopia Eletrônica de imunolocalização com ouro
Obs.: Esquema de fuso de levedura. 
 Uso de ouro coloidal de vários tamanhos. A menor 1 nm de diâmetro. 
 Tem que corar antes com ouro e depois colocar em resina para corte. 
Quatro proteínas diferentes sendo localizadas por anticorpos diferentes.
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Corantes catiônicos: hematoxilina cora DNA 
Corantes aniônicos: eosina cora protaína
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Obs.1: Glutaraldeído (aldeídos reativos) preserva as proteínas, o ósmio se liga e estabiliza as bicamadas
 lipídicas (reage com as duplas ligações C=C presentes em vários ácidos graxos)
 Cortes: o poder de penetração dos elétrons é baixo, por isto os cortes têm que ser finos (50 a 100 nm
 de espessura, ou 1/200 da espessura de uma célula única)
 Microscopia transmissão: contraste com uranila e chumbo vai marcar as membranas
 Se estiver marcando uma estrutura específica não usar uranila e chumbo, pois a marcação
 da estrutura já dará contraste. Ex.: vermelho de rutênio, fosfatase ácida (lisossomo)
 ouro coloidal (partículas maior e menor)
 Microsopia de varredura: aparelho de Ponto Crítico passagem do líquido direto para o vapor.
 A acetona é retirada para criar espaços vazios, onde ficarão a resina. Se não for bem feito o tecido
 fica torto. 
Obs.2: Aldeídos reativos formam ligações covalentes com os aminoácidos livres das proteínas, 
 produzindo ligações cruzadas com moléculas adjacentes.\ 
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Devido as aberrações de uma lente de elétrons serem mais difíceis de corrigir
Do que aquelas produzidas por uma lente de vidro, o poder de resolução da 
Maioria dos mais modernos microscópios eletrônicos é, nas melhores condições
0,1 nm (1Å) a 20 nm (20Å). Problemas:
 - apenas o centro da lente de elétrons pode se utilizado
 - a abertura numérica efetiva é minúscula
 - problemas com a preparação de amostras: contraste, danos pela radiação
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A formação final da imagem é: 
Eletrodensa (escura):
 - os elétrons encontram os elementos: ferro, ósmio,
 chumbo ou ouro
Eletrolúcida (clara):
 - os elétrons encontram elementos: nitrogênio,
 hidrogênio, carbono ou oxigênio
Obs.: O material biológico é eletrolúcido, por isto 
devemos contrastar, na maioria com material pesado. 
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MICROSCOPIAS
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
 
 Pode revelar feições topográficas de uma superfície, com grande nitidez e detalhes
Fornece imagem tridimensionais
 São utilizados os elétrons refletidos (secundários)
 Possui um sistema de geração de elétrons que varre a superfície; um local onde se deposita a amostra; um sistema captador da imagem e amplificador de sinal (monitor de vídeo)
 Utilização: observa vermes, insetos, células animais e vegetais, embriões, fragmentos geológicos (granulometria e textura de solos)
Microscopia do epitélio da traquéia, com células ciliadas e microvílos
Sedimentos geológicos: minério de Analcina
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PREPARO DAS AMOSTRAS
MICROSCOPIAS
 - O processo de fixação varia um pouco, dependendo do propósito e do equipamento a ser usado
 - O material para microscopia de luz é fixado em solução de formaldeído a 10% em solução tamponante
 - O material observado em microscopia eletrônica é fixado em Glutaraldeído a 2,5% e paraformaldeído a 4% também em solução tamponante.
 - O material é mantido nestas soluções por períodos que variavam de 1 a 24 horas à 4 0C
Fixar
Micrótomo
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Microscópio Eletrônico x Microscópio de Luz 
Luz
Canhão de elétrons
Lentes condensadoras
Amostras
Lentes objetivas
Lentes
oculares
Lentes
projetoras
Imagem
Visualizada
Diretamente
Imagem
em tela ou
filme 
fotográfico
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m.e.t. x m.e.v.
Biologia Celular Imagens Rosane Meirelles
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Técnicas citoquímicas
MICROSCOPIAS
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Técnicas citoquímicas
MICROSCOPIAS
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Colorações
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MICROSCOPIAS
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