Aula 4 - MG Vacina de DNA

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Introdução à Terapias Gênicas
VACINAS GÊNICAS
Cap. 23 e 24 - Livro Genomica
Profa. Msc. Isadora Louise
Terapia Gênica 
Conceito:
Introdução de um gene cujo produto tem a capacidade de curar ou prevenir a progressão de uma doença.
Envolve a correção de defeitos genéticos, eliminação de células cancerosas, prevenção de doenças cardiovasculares, bloqueio de desordens neurológicas, eliminação de patógenos infecciosos… 
Terapia Gênica 
Terapia gênica # Farmacogenômica
 Tipos principais:
Utilização de células somáticas; 
Introdução de genes corretivos em células com finalidade terapêutica. Ex: Vacina de DNA.
Utilização de células germinativas;
Introdução de genes corretivos em células reprodutivas, ou ainda no zigoto => modificação presente em todas as células do adulto, inclusive reprodutivas.
Utilização de células-tronco.
Terapia Gênica 
Avanços na terapia gênica => sequenciamento do genoma humano => identificação de genes associados a doenças; desenvolvimento de marcadores moleculares associados a doenças.
Defeitos genéticos:
Presença de genes normais e defeituosos nos seres humanos => alelos
Doença=> Dominante (Huntington) ou recessiva?
Maioria => recessiva
Indivíduos portadores de alelos
Influencia do meio ambiente (identifiação de grupos de risco).
Huntington: desordem no sistema nervoso – fase adulta, 50 anos
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Terapia Gênica 
Nem todos os genes defeituosos produzem efeitos detrimentais…
Ex: Anemia falciforme (AF) e Malária
Indivíduos portadores do alelo da AF não desenvolvem a doença (recessiva), mas são capazes de resistir à infecção pelo parasita;
Cópias desse gene são comuns na população africana onde essa doença é endêmica => seleção natural. 
Objetivos da aula
Introdução
Histórico
Construção da vacina gênica
Vias de administração
Biodistribuição e tráfego intracelular do DNA plasmidial
Conversão do DNA em antigeno vacinal e ativação da resposta imune
Vantagens das vacinas de DNA
Introdução
Desenvolvimento da vacina contra varíola => pioneiro (há 2 sec) => Erradicação da varíola: Início de uma nova era para a medicina moderna
Imunoprofilaxia ou vacinação => medida mais eficiente e menos dispendiosa para evitar doenças infecciosas
Dados da OMS (Organização Mundial de Saúde): Ressurgimento de várias doenças infecciosas => necessidade de desenvolvimento de novas vacinas.
Introdução
Objetivo da vacina: Imunização prévia do indivíduo
 resposta rápida e eficiente (contato com agente infeccioso) => não desenvolvimento da doença
Estratégias vacinais
1ª geração (Início do séc XX):
microorganismos vivos atenuados (BCG – tuberculose) ou mortos e inativados (Bordetella pertussis) 
 eficácia e segurança questionadas
Introdução
2ª geração (Última década):
Novas estratégias de obtenção e produção de antígenos; otimização na administração e apresentação dos mesmos ao sistema imune
 Antígenos purificados ou recombinantes
Obtenção: cultura de agentes infecciosos ou meios sintéticos
 Vacinas mais seguras, eficazes e polivalentes
Introdução
3ª geração (Recentemente):
Vacinas gênicas
Genes ou fragmentos de genes que codificam antígenos potencialmente imunogênicos são carreados por DNA plasmidial
 Esperança no combate de doenças ainda sem prevenção segura e eficaz:
 AIDS, Malária, Tuberculose, Hepatite, Esquistossomose, Dengue...
Grande potencial de aplicação na prevenção e cura de determinados tipos de câncer 
Histórico
1990, Wolf et al: Indução da expressão de proteínas por células musculares através de vacinação intramuscular com DNA plasmidial em solução
 Ulmer e colabolarores: Demonstraram que uma vacina de DNA tinha a capacidade de estimular tanto a resposta imune humoral, quanto a celular => vários testes para desenvolvimento de vacinas
 
Vacinas gênicas 
Processo de vacinação:
Administração intramuscular do DNA
Síntese de antígeno apropriado no interior das células do indivíduo vacinado
 Fornecem ao organismo hospedeiro a informação genética necessária para a produção do antígeno com as características necessárias para a geração da resposta imune => similar à infecção natural => menos efeitos colaterais
Construção da vacina gênica
Isolamento e clonagem do gene que codifica o antígeno vacinal em plasmídeo
Características do plasmídeo:
Origem de replicação em bactérias
Genes de seleção
Sítio múltiplo de clonagem
Promotor
: Geralmente um promotor viral, que permite a transcrição do gene de interesse em células eucarióticas
Construção da vacina gênica
Introdução do gene clonado em bactéria hospedeira (transformação) => produção dos plasmídeos em larga escala => DNA em quantidade suficiente para a vacinação propriamente dita.
Vias de administração 
Intramuscular, intradérmica (gene gun, ou biobalistica) e intranasal
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Construção da vacina gênica
 Desvantagens:
 Requer elevada quantidade de plasmídeos para desencadear a resposta imune;
 Local de administração: maior dificuldade de penetrar no núcleo e desdencadear respostas/ ação de nucleases sob o DNA plasmidial;
 Tamanho da molécula e carga negativa limitam sua penetração na célula alvo
Via intramuscular:
Vantagens
Simples e de baixo custo
Construção da vacina gênica
Alternativas à via intramuscular (aumento da eficiencia do processo):
 Utilização de carreadores constituídos por microorganismos vivos (vetores virais);
 Utilização de carreadores constituídos por sistemas particulados.
Construção da vacina gênica
Carreadores constituídos por microorganismos vivos
 Microorganismos com a capacidade de invadir células da superfície de mucosas
 Carreadores e direcionadores do DNA plasmidial para célula hospedeira (direcionamento seletivo)
 Virus e bactérias modificados
 Risco: microorganismos originalmente patogênicos que sofreram alterações genéticas em suas atenuações 
=> até que ponto permaneceriam em suas formas atenuadas?
Construção da vacina gênica
Carreadores constituídos por sistemas particulados
 Constituídos por sistemas de partículas microscópicas onde o imúgeno é incorporado no interior de partículas por técnicas de encapsulamento ou associado a elas por adsorção
 Facilitam o transporte e protegem o imúgeno de degradação além de potencializar a resposta imune
Construção da vacina gênica
Carreadores constituídos por sistemas particulados
Bioibalística ou gene gun
 Consiste na transfecção das células dos indivíduos vacinados utilizando o DNA adsorvido em partículas de ouro
 Requer uma quantidade de plasmídeos 100x menor para gerar resposta equivalente à administração intramuscular
 Dirige o plasmídeo ao interior das células, evitando a degradação por nucleases
Biobalística ou gene gun
DNA é adsorvido em partículas de ouro
As partículas são colocadas em um cartucho
O cartucho é acoplado ao Gene gun e as partículas 
são aceleradas contra a pele do animal a ser imunizado
Ao atingir a célula, o DNA se desprende da partícula
 e ganha o núcleo onde dirige a síntese da proteína
Construção da vacina gênica
Carreadores constituídos por sistemas particulados
Lipossomos catiônicos
 Também conhecidos como vetores não virais
Vesículas aquosas circundadas por bicamadas de fosfolipídio => encapsulamento e veiculação de substâncias
Compostos por lipídeos com cabeça polar positiva e formam complexos com o DNA neutralizando a sua carga negativa (partícula positiva) => transporte através da membrana citoplasmática (endocitose adsortiva entre a partícula + e a superfície – das células).
Construção da vacina gênica
Carreadores constituídos por sistemas particulados
Permitem que moléculas como anticorpos, proteínas e açúcares sejam incorporados à sua superfície, levando seu direcionamento para sítios específicos 
 Modificações na composição lipídica podem aumentar a eficiência da transfecção
 Grande aplicabilidade na transfecção gênica
Construção da vacina gênica
Carreadores constituídos
por sistemas particulados
Microsferas poliméricas biodegradáveis: Nova estratégia
Encapsulação do DNA em microsferas poliméricas (poliésteres de ácidos lático e glicolítico => biodegradável, sem manifestações ulcerativas no sítio de administração)
 Ativação da resposta imune humoral
Vacina de DNA
Tipo de vacina gênica;
Administração direta do DNA no plasmídeo; não necessita de vetores como adenovirus, retrovirus e virus adenoassociados;
 Geração da resposta imune, com menos efeitos coleterais
 Vacinas são baseadas em proteínas recombinantes
Vacinas baseadas em proteínas recombinantes
Esperança de cura para doenças ainda sem vacina e tratamento eficaz:
AIDS, Malária, dengue e hepatite C.
 Desenvolvimento de novas vacinas gênicas a partir do avanço da imunologia e da engenharia de proteínas => Vacinas de subunidades protéicas
Isolamento, clonagem e expressão de genes codificantes de proteínas que possuem epítopos que são reconhecidos por anticorpos e linfócitos T do hospedeiro
Vantagem: Uma única proteína pode ter vários epítopos imunodominantes capazes de induzir imunidade protetora sem os risco s e efeitos colaterais do patógeno vivo.
Vacinas baseadas em proteínas recombinantes
Desafios:
Potencializar os efeitos da vacina em induzir resposta imune mais eficaz e aumentar sua meia vida in vivo;
 Obter uma proteção abrangente (Não só contra linhagem onde o gene foi clonado – clonar em varias linhagens diferentes!!!)
Vacinas baseadas em proteínas recombinantes
Utilização de sistemas de expressão, usando hospedeiros não –patogênicos capazes de produzir proteínas imunogênicas puras (proteínas heterólogas)
Dificuldades:
Produção em pequenas quantidades;
 Purificação e conformação da proteína;
Expressão de proteínas eucariontes em procariontes (PTM => proteína não-funcional);
 
Vacinas baseadas em proteínas recombinantes
Histórico:
1ª imunógeno a capaz de prevenir contra o vírus da hepatite B
Custo elevado
Solução: outros sistemas de produção mais baratos => S. cerevisae
Vetores para vacinas baseadas em proteínas recombinantes
 Não são necessários
 Vacinas de DNA baseiam-se na clonagem do gene desejado em plasmídeos, o qual deverá ser expresso dentro das células do hospedeiro sem posteriores manipulações.
 Construção de plasmídeos quiméricos com maior performance e complexidade => melhor resolução
Etapas da produção de uma Vacina de DNA
Sequencia para produção de proteína imunogênica
Sítios de restrição
Plasmídeo com gene de interesse
Transformação do sistema hospedeiro (bacteria, levedura) e produção do DNA
Seleção do clone recombinante
Transfecção de células de mamíferos para produção de anticorpos
Imunização do animal ou homem
Elementos presentes nos vetores que influenciam a expressão gênica
Região promotora e acentuadora forte
Íntron quimérico otimizado
Sinal de poliadenilação
Sítios únicos de clonagem 
Origem de replicação no organismo hospedeiro
=> Expressão gênica eficiente e constitutiva nas células de mamíferos
Região acentuadora e promotora
Região de controle da expressão do gene clonado
 Geralmente obtida do citomegalovírus humano (CMV)
 Capacidade de conduzir expressão forte em vários tipos de células
Natureza ”promiscua” => capacidade de controlar várias regiões gênicas
Íntron quimérico
Composto por:
Sítio doador do primeiro íntron do gene da betaglobulina humana e sítio receptor da região variável da cadeia pesada do gene da imunoglobulina
Localização:
Flanqueia os insertos de DNA, aumentando a expressão gênica (impede a utilização de sítios doadores crípticos: estes, se presentes, podem ser utilizados na excisão do gene de interesse)
Sinal de poliadenilação
Adição da cauda poli(A) e ser reconhecido no término da transcrição pela RNA polimerase II
A poliadenilação aumenta a estabilidade e a tradução da molécula de RNA
Elementos adicionais
Sítios únicos de clonagem: são desenhados para evitar estruturas presentes na região 5’ não traduzida do mRNA, que pode reduzir a tradução em eucariotos superiores
Origem de replicação em plasmídeos de expressão:	
Mais comum: ColE1 de E.coli => ALTA REPLICAÇÃO DO DNA PLASMIDIAL
Regiões imuno-estimulatórias
Outros fatores que podem influenciar no aumento da expressão:
Utilização do Codon usage: mudanças na seqüência nucleotídicas de alguns genes para melhor refletir códons preferenciais usados em mamíferos pode resultar em um aumento marcante no nível de expressão em células eucarióticas.
Inserção de uma sequência Kozak (GCCa/gCCAUGG) ao redor do códon iniciador pode ser fundamental para a ótima expressão de uma proteína em células de mamíferos
Sequencia de Kozak: Sequencia consenso em mamíferos para início da síntese de proteínas
Vias de administração 
Intramuscular, intradérmica (gene gun, ou biobalistica) e intranasal
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Biodistribuição e tráfego intracelular do DNA plasmidial
 Após a imunização o DNA plasmídial pode ser encontrado em vários tecidos, independente de onde foi administrado
 O tempo de permanência/ expressão do antígeno em diferentes tecidos é variável
Eficácia: depende da expressão do antígeno nos indivíduos vacinados (DNA plasmidial deve atingir o núcleo => transcrição e tradução)
 Há muito a ser explorado para entender o tráfego intracelular do DNA plasmidial => desenvolvimento de vetores ou formulações mais eficazes, otimizando o processo de vacinação gênica
 
Ativação da resposta imune
Células musculares (miócitos ou macrófagos)
Núcleo: transcrição e tradução
Vantagens das vacinas de DNA
Muitos genes podem ser carreados pelo plasmídeo: importante pata organismo variável. Ex: vírus.
Ativação da imunidade humoral e celular específica
 Síntese dos antígenos endógenos com características estruturais muito semelhantes à molécula nativa sintetizada pelo patógeno => epítopos conformacionais necessários para indução da resposta imune efetiva
 Imunidade adquirida duradoura
 Modificações nos plasmídeos/ genes/ carreadores => aumento da eficiencia de resposta imunológica
Menor custo em larga escala
Possíveis efeitos colaterais
Probabilidade de integração do plasmídeo no genoma da célula hospedeira => mutações ou ativação de oncogenes
 Indução de tolerância imunológica
 Indução de auto-imunidade
Indução de anticorpos contra o plasmídio administrado
Obrigada!!!
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