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Laboratório de Fitopatologia (aula 3) 
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO 
DEPARTAMENTO DE PRODUÇÃO VEGETAL 
FITOPATOLOGIA BÁSICA (DPV 05382) 
 
LABORATÓRIO DE FITOPATOLOGIA (aula 3) 
 
Prof. Celson Rodrigues 
 
PREPARAÇÕES MICROSCÓPICAS DE FUNGOS FITOPATOGÊNICOS 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
A diagnose de uma doença, assim com a identificação do seu agente etiológico, nem 
sempre pode ser feita com base no quadro sintomatológico visual exibido pelo suscetível 
enfermo. Na maioria das vezes somente um exame microscópico de cortes histológicos, 
estruturas reprodutivas do patógeno ou raspagem de superfície de lesões nos permitem uma 
diagnose segura. 
Para o preparo de lâminas empregam-se líquidos de montagem. Estes, geralmente, 
contêm em sua composição, elementos ou substâncias que conferem as propriedades de 
colorir esporos e outras estruturas do patógeno e/ou células e estruturas do tecido do 
hospedeiro, permitindo melhor clareza na visualização ao microscópio, fixar a peça ou 
estrutura a ser observada, impedir o dessecamento da preparação e preservar sua 
integridade estrutural, por tempo mais ou menos longo. 
 É importante lembrar que toda preparação de lâmina microscópica de fungos 
fitopatogênicos deve ser antecedida de um exame cuidadoso do material sob a lupa 
(microscópio estereoscópico). As lesões provocadas pelo patógeno no tecido vegetal têm 
que ser observadas em busca das estruturas do patógeno (sinais), que serão 
posteriormente transferidas para a lâmina. 
 
 
1.1. Lactofenol de Amann 
O lactofenol de Amann é o líquido de montagem de estruturas fúngicas (vegetativas e 
reprodutivas), para observação microscópica, mais utilizado em laboratórios de fitopatologia. 
Para a observação de estruturas hialinas, usualmente adiciona-se ao lactofenol de Amann, 
os corantes azul de algodão ou azul de metileno ou fucsina ácida na proporção de 0,1 a 
0,5%. Para observação de estruturas naturalmente coloridas, não é necessário o acréscimo 
de corante ao lactofenol. A composição do lactofenol de Amann é: 
 
Ácido lático p.a. ------------------------- 10 mL 
Fenol cristalizado ----------------------- 10 mL 
Glicerina ou glicerol -------------------- 10 mL 
Água destilada --------------------------- 10ml 
 
1.2. Preparações microscópicas de fungos fitopatogênicos mais utilizadas 
em fitopatologia: 
 
a) Lâmina com fita adesiva transparente; 
b) Raspagem da superfície das lesões na planta ou da superfície de culturas fúngicas; 
c) Fragmentação ou esmigalhamento das lesões com estruturas fúngicas; 
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d) Corte histopatológico à mão livre; 
e) Lâmina a partir de tecido vegetal doente mantido em câmara úmida; 
f) Método de microcultura. 
 
2. LÂMINA COM FITA ADESIVA TRANSPARENTE 
 
 Esta técnica é muito simples e rápida, sendo apropriada para exames rápidos de 
fungos que produzam estruturas superficiais como condióforos e conídios, esporangióforos e 
esporângios e pústulas de ferrugem. A técnica não se presta a preparações microscópicas 
de fungos que não esporulam na superfície de lesões e, aqueles cujos esporos são 
produzidos no interior de frutificações. 
Tais lâminas são preparadas rapidamente, mas não são passíveis de preservação. A 
marcha para o seu preparo é a seguinte: 
 
1- Material necessário: fita adesiva transparente, lâminas e lamínulas; 
2- Observe o material sob lupa para se verificar se há esporulação nas áreas lesionadas. Se 
não há esporulação torna-se necessário colocar o material vegetal em câmara úmida para 
que o fungo esporule; 
3- Havendo esporulação corte um pedaço de uma fita adesiva e cole-a sobre a lesão onde 
supostamente o fungo esteja esporulando e pressione por alguns segundos; 
4- Retire a fita adesiva da superfície da lesão e pressione-a sobre uma lâmina de 
microscopia limpa; 
5- Examine a lâmina montada sob microscópio ótico para verificar se há estruturas de fungo, 
visando identificá-lo. 
 
3. RASPAGEM DA SUPERFÍCIE DAS LESÕES NA PLANTA OU DA 
SUPERFÍCIE DE CULTURAS FÚNGICAS 
 
1) Material necessário: estilete, lâmina e lamínula, bico de Bunsen ou lamparina com álcool. 
2) Examine o material sob a lupa e localize as estruturas do fungo associadas às lesões ou 
crescidas no meio de cultivo artificial. Certifique-se de que as estruturas do fungo estão 
realmente posicionadas externamente às lesões ou sobre a superfície do meio de cultura. 
3) Flambe a extremidade do estilete ferramenta que irá utilizar visando eliminar resíduos de 
outros materiais de preparações anteriores. 
4) Sob o aumento máximo da lupa aproxime a ferramenta das estruturas e retire o material 
fúngico, transferindo-o para uma lâmina previamente preparada (limpa, seca e com uma 
pequena gota do líquido de montagem (lactofenol de Amann) posicionada no seu centro. 
Repita as transferências de material para a gota diversas vezes. É preferível repetir o 
procedimento com pequenas quantidades de material fúngico do que tentar transferir uma 
grande quantidade de uma vez só. 
5) Verifique sob a lupa se o material que você tentou transferir realmente ficou na gota (há 
uma certa tendência do mesmo ficar aderido à ponta do estilete. 
6) Cubra o material com a lamínula, posicionando, inicialmente, um dos seus lados sobre a 
lâmina e deixando a sua superfície inclinada sobre a gota do líquido de montagem (sem 
tocá-la). Segure a lamínula com dois dedos e sustentando-a em seguida com a ponta do 
estilete. Afaste gradualmente o estilete deixando a face inferior da lamínula entrar em 
contacto com a gota do líquido de montagem contendo as estruturas fúngicas. Caso 
ocorra formação de bolha de ar, aguarde sua movimentação em direção a um dos bordos 
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da lamínula, desfazendo-se. Ligeira pressão sobre a lamínula pode ser necessária para 
precipitar o movimento da bolha. 
7) Caso o líquido de montagem não tenha sido suficiente para ocupar toda a área abaixo da 
lamínula, deve ser acrescentado, por capilaridade, através de pequena gota depositada 
junto ao bordo da lamínula, em local mais próximo daquele em que faltou o 
preenchimento satisfatório. No caso de excesso de líquido de montagem, evidenciado 
pelo transbordo do mesmo junto aos bordos da lamínula, proceder a remoção utilizando 
papel absorvente (o melhor é o papel de filtro, cortado em pequenos pedaços). 
8) Observar a preparação ao microscópio ótico, seguindo todas as recomendações técnicas 
de sua utilização. Observar com calma e detalhadamente as estruturas fúngicas 
presentes no campo focal, procedendo de acordo com a orientação do instrutor. 
9) Retirar a lâmina do microscópio e proceder sua “lutagem”, ou seja, a vedação dos bordos 
da lamínula com base ou esmalte incolor para unhas. Para isto, qualquer excesso de 
líquido de montagem deve ser removido com papel de filtro, ficando bem secos os bordos 
da lamínula. Aplicar então o esmalte recobrindo todo os bordos. Após seco o esmalte ou 
base, aplicar uma segunda vez e, esperar novamente secar para depois identificar a 
lâmina com etiqueta (de acordo com as recomendações do instrutor) entregando-a, em 
seguida, ao instrutor. 
10. Observação: lâminas e lamínulas limpas são mantidas em frascos, imersas em álcool 
70%. Para utilização devem ser removidas sem a utilização de pinças ou qualquer outro 
instrumento, sob o risco de provocar arranhões ou até mesmo quebra das mesmas. 
Portanto, antes de manipulá-las, as mãos devem ser desinfetadas com álcool 70%. Após a 
remoção, lâminas e lamínulas devem ser secadas utilizando papel absorvente macio, tendo 
cuidado especial em relação às lamínulas, pela sua fragilidade. 
 
4. FRAGMENTAÇÃO OU ESMIGALHAMENTO DAS LESÕES COM 
ESTRUTURAS FÚNGICASTécnica especialmente útil para o exame de estruturas de corpos frutíferos de fungos, tais 
como apotécios, peritécios, picnídios, etc., quando de difícil remoção por raspagem 
superficial. Procede-se da forma seguinte: 
 
1. Colocar uma gota do líquido de montagem sobre uma lâmina microscópica seca. 
2. Cortar com bisturi ou lâmina de barbear, previamente flambado ou resfriado, a lesão ou 
parte dela, contendo as frutificações fúngicas que se quer observar, e depositá-la sobre o 
líquido de montagem. 
3. Dilacerar o tecido vegetal com auxílio de dois estiletes ou de uma pinça, previamente 
flambados e resfriados. Eliminar, em seguida, o excesso de material vegetal dilacerado, 
utilizando pinça. 
4. Cobrir com lamínula, observando os cuidados descritos na técnica anterior. 
5. Proceder, em seguida, conforme descrito na técnica anterior. 
 
5. CORTE HISTOPATOLÓGICO À MÃO LIVRE 
 
 Embora muito utilizada tanto para fungos que produzem estruturas externas ao 
substrato como para os que produzem apenas estruturas imersas (picnídios, acérvulos, 
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peritécios e outras) e fundamental para a observação dos últimos, é um tipo de lâmina mais 
difícil de ser feito pelos iniciantes. Cuidados especiais a serem tomados são os seguintes: 
 
a) Depois de escolher uma lesão com estruturas do fungo visíveis sob a lupa, recortar uma 
pequena tira do material, usando um bisturi ou lâmina de barbear, ou mesmo tesoura, 
previamente flambados e resfriados (mas sempre com o cuidado proteger a platina da 
lupa, cortando o material apoiado sobre uma lâmina). A tira deve conter as lesões com 
as estruturas fúngicas que se pretende cortar. 
b) Posiciona-se o material sob a lupa em seu aumento máximo. Toma-se uma metade de 
uma lâmina de barbear nova e faz-se um primeiro corte que visa apenas alcançar a área 
a ser aproveitada para a confecção da lâmina. Elimina-se o produto do primeiro corte e 
daí por diante tenta-se obter as seções mais finas que destreza manual e a visão 
permitirem. Um número de seis a dez seções é em geral o suficiente. 
c) Ainda sob a lupa selecionam-se as seções mais finas. Seja rigoroso na seleção das 
seções. O aproveitamento de uma que tenha ficado mais grossa pode estragar o que 
seria uma boa lâmina. Com o estilete devidamente flambado retiram-se as seções (3 ou 
4) selecionadas, que são então transferidas para uma lâmina previamente preparada 
como descrito nas técnicas anteriores, dispostos paralelamente um ao outro. 
d) A sequência do procedimento é de acordo com o descrito nas técnicas anteriores. 
e) Observação: Se o espécime a ser examinado está seco, cubra a área a ser cortada 
com algumas gotas de KCl (10%), por alguns minutos, antes de se proceder aos cortes 
histopatológicos à mão livre. 
6. LÁMINA OBTIDA DE TECIDOS VEGETAIS DOENTES MANTIDOS EM 
CÂMARA ÚMIDA 
Muitas vezes, amostras de plantas representativas de uma doença fúngica chegam do 
campo apresentando pouca ou nenhuma estrutura externa do fungo (conidióforos, esporos, 
micélio externo, etc...). Isto pode acontecer se as condições ambientais no período que 
antecedeu a coleta foram desfavoráveis para o fungo. 
Para fungos produtores de estruturas imersas no tecido do hospedeiro (peritécios, picnídios 
e outras) os esporos podem estar limitados à porção interna da frutificação. Fica assim difícil 
a realização do isolamento direto do fungo e também a preparação de lâminas. Uma 
alternativa para se superar o problema é submeter partes selecionadas da amostra a uma 
câmara úmida. Ou seja, o material é deixado por determinado período de tempo dentro de 
um recipiente fechado em uma atmosfera saturada de umidade. A produção de estruturas 
fúngicas pode ser estimulada desta forma. Um problema, no entanto, é que o mesmo 
tratamento estimula o rápido crescimento de organismos saprofíticos presentes na amostra. 
Uma assepsia rápida da amostra, mergulhando-a por 1 a 2 minutos em hipoclorito de sódio 
a 2%, seguida de uma rápida lavagem em água esterilizada, pode contribuir para minimizar 
o problema. É, por sua vez, necessário saber que se existirem estruturas do fungo 
fitopatogênico externas ao tecido vegetal, elas podem ser eliminadas nesta assepsia. 
O material em câmara úmida não deve ser incubado em temperaturas elevadas. Se possível 
que seja mantido em local onde receba luz (como sobre a bancada de um laboratório). O 
exame do material incubado (sob a lupa) deve ser feito em intervalos regulares para permitir 
a constatação do fungo assim que sua presença se torne evidente. Assim que surgirem as 
estruturas fúngicas, deve-se proceder a preparação microscópica através de raspagem ou 
utilização de fita adesiva transparente, conforme as técnicas descritas anteriormente. 
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7. MÉTODO DE MICROCULTURA 
A técnica de preparação de lâminas microscópicas de estruturas fúngicas, a partir de 
“microcultura”, será objeto de uma aula prática exclusiva, portanto, não é abordada no 
presente material. 
 
 
8. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA 
 
AGRIOS, G.N. Introduction. In: AGRIOS, G.N. Plant pathology. 5 ed. San Diego: Elsevier 
Academic Press, 2005. 
 
ALFENAS, A.C.; MAFIA, R.G. (edt). Métodos em fitopatologia. Viçosa: Ed. UFV, 2007. 
 
MENEZES, M.; ASSIS, S.M.P. Guia prático para fungos fitopatogênicos. Recife: UFRPE, 
Imprensa Universitária, 2004.