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1 1010 10-1 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Técnicas e Técnicas e Biotecnologia Biotecnologia de Ácidos de Ácidos NucléicosNucléicos 1010 10-2 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Separação e DetecçãoSeparação e Detecção � Em 1997 � Uma ovelha foi clonada por cientistas escoceses � Dois macacos rhesus por pesquisadores de Oregon � Nesse capítulo, será tratado alguns dos métodos mais importantes usados na biotecnologia � Técnicas de separação � A carga elétrica e o tamanho são duas propriedades das moléculas que constituem a base dos processos de separação. A eletroforese em gel faz uso dessas propriedades � A poliacrilamida é utilizada para fragmentos menores � Agarose é utilizada para fragmentos maiores 2 1010 10-3 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Separação e DetecçãoSeparação e Detecção � Amostras são aplicadas ao gel em posição vertical � Devido a presença de seus grupos fosfatos, os polinucleotídios são carregados negativamente em pH neutro � Quando uma corrente elétrica é aplicada, os polinucleotídios carregados negativamente migram na direção do pólo positivo � A razão da carga para a massa permanece aproximadamente a mesma, a despeito do tamanho da molécula de polinucleotídio � A separação dos polinucleotídios acontece primordialmente em função do tamanho da molécula, determinado pela “peneira molecular” imposta pelo gel 1010 10-4 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Separação e DetecçãoSeparação e Detecção � Auto-radiografia � Baseado na detecção de 32P ou 35S � Após a separação dos polinucleotídios marcados, o gel é colocado em contato com um de filme de raio X � Após a revelação, a posição dos compostos marcados aparece como bandas escuras � Luminescência � Por um composto ligado aos fragmentos como um rótulo � Usado para detectar níveis em nanomoles � Para o DNA, são utilizados quatro tipos de compostos fluorescentes, um para cada tipo de base 3 1010 10-5 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Separação e DetecçãoSeparação e Detecção � O gel com os produtos após a separação é irradiado com uma luz laser que é capaz de ser absorvida pelos quatro compostos fluorescentes que marcam as diferentes bases � Cada um desses compostos reemite luz em um comprimento de onda próprio, mais longo, o que caracteriza o fenômeno de fluorescência � Quimioluminescência � Depende da emissão de luz como resultado de uma reação química 1010 10-6 Copyright (c) 2002 V. T. Motta NucleasesNucleases � Nuclease � Uma enzima que catalisa a hidrólise dos esqueletos fosfodiéster dos ácidos nucléicos � Endonuclease de restrição � Uma enzima que cliva o DNA em sítios específicos � Isolada principalmente das bactérias � Cerca de 1000 endonucleases de restrição foram isoladas e suas especificidades determinadas � As seqüências reconhecidas por endunucleases de restrição – seus sítios de ação – serão as mesmas se lidas da esquerda para direita, ou da direita para a esquerda (fita complementar) � As seqüências reconhecidas são palindromos 4 1010 10-7 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Restriction endonuclease Recognition and cleavage site Bam HI Eco RI Not I 5'-GGATCC-3' 3'-CCTAGG-5' 5'-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5' 5'-GCGGCCGC-3' 3'-CGCCGGCG-5' 1010 10-8 Copyright (c) 2002 V. T. Motta DNA DNA RecombinanteRecombinante � DNA Recombinante: as moléculas de DNA que contêm segmentos ligados covalentemente, derivados de duas ou mais fontes de DNA � A produção de DNA recombinante requer corte e emenda de duas fitas de DNA de maneiras muito específicas � O corte é realizado com endonucleases de restrição � A emenda dos segmentos é feito por enzimas chamadas DNA ligases � Extremidades adesivas � Eco RI reconhece e causa hidrólise da lponte fosfodiéster no fita de DNA entre os pares de bases G e A 5 1010 10-9 Copyright (c) 2002 V. T. Motta DNA DNA RecombinanteRecombinante Eco RI cleavage5'-G-A-A-T-T-C-3' 3'-C-T-T-A-A-G-5' 5'-G 5'-A-A-T-T-C-3' G-5'3'-C-T-T-A-A-5' staggered cleavage gives fragments with protruding 5' ends If a ligase reseals sticky ends from a DNA of different origin, what results is a recombinant DNA sticky ends from original DNA 1010 10-10 Copyright (c) 2002 V. T. Motta DNA DNA RecombinanteRecombinante � Quando dois tipos diferentes de DNA são combinados em laboratório, um dos DNAs é normalmente um plasmídeo �� PlasmídeoPlasmídeo: uma molécula circular de DNA que não faz parte do DNA principal do cromossomo circular da bactéria � Fitas de E. coli de várias fontes tem plasmídeos diferentes � Plasmídeos da E. coli capazes de se auto-perpetuar são fundamentais na tecnologia do DNA recombinante � O processo de produção de cópias idênticas de um DNA é chamado de clonagemclonagem 6 1010 10-11 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Engenharia GenéticaEngenharia Genética � De certo modo, a engenharia genética de organismos já era praticada pelo homem desde que se inciaram os cruzamentos seletivos entre as plantas e animais � As alterações seletivas de organismos, para propósitos agronômicos ou médicos, beneficiou-se grandemente com a metodologia do DNA recombinante � Na agricultura, genes para maior produtividade, resistência ao congelamento e a pestes foram introduzidas em morangos, tomates e milho � Em humanos, as pesquisas buscam formas de terapia gênica para alterar células para aliviar os sintomas da doença 1010 10-12 Copyright (c) 2002 V. T. Motta ClonagemClonagem �� CloneClone: uma população geneticamente idêntica � Pode ser de organismos, de células, de vírus ou moléculas de DNA � O uso de endonucleases de restrição e de DNA ligases produz relativamente poucas moléculas de um dado DNA recombinate � É necessário que as amostras de DNA existam (1) em quantidades razoáveis e (2) em estado puro para realizar a clonagem � Clonagem de bacteriófagos (vírus que infectam as bactérias) � Examina-se o vírus de DNA que contém DNA de fita dupla � Um “tapete” (lawn) de bactérias, cobrindo a superfície de uma placa de Petri, é infectado com o fago 7 1010 10-13 Copyright (c) 2002 V. T. Motta ClonagemClonagem � Cada vírus infecta uma célula bacteriana e reproduz-se � Cada descendente seu repete o ciclo, infectando e destruindo outras células � À medida que o vírus se multiplica, uma mancha clara, chamada “placa de lise” (plaqueplaque), aparece na placa de Petri, marcando a área em que as çélulas bacterianas foram destruídas � A placa consiste da progênie do primeiro vírus, clones do vírus original � Para clonar-se células individuais, um pequeno número de células é semeado em finas camadas, em um meio de cultura adequado em uma placa � Cada colônia de células que aparecer na placa será, então, um clone derivado de uma única célula 1010 10-14 Copyright (c) 2002 V. T. Motta ClonagemClonagem � Produção de DNA recombinante com fago vetor � Bactérias e bacteriófagos podem crescer em grande quantidade em pequenos intervalos de tempo em condições laboratoriais � Por exemplo, se quisermos clonar uma porção de DNA humano em um vírus � Trata-se o DNA humano e o DNA viral com a mesma endonuclease de restrição, que são então misturados, para permitir que as extremidades adesivas possam anelar-se � Trata-se, então, a mistura com uma DNA ligase � Para cloná-lo, incorporamos o DNA quimérico em partículas virais, o que se faz adicionando a proteína do capsídeo viral, para permitir que o vírus se monte em partículas 8 1010 10-15 Copyright (c) 2002 V. T. Motta ClonagemClonagem � As partículas virais são distribuídas sobre um tapete de bactérias, e os segmentos clonados em cada placa de lise são identificados � O bacteriófagofoi o vetorvetor, o carreador do DNA recombinante � Plasmídeos bacterianos � Se replica independentemente do genoma bacteriano principal e pode ser transferido de uma cepa de uma espécie de bactérias para uma outra por meio de contatos célula-célula � O gene exógeno pode ser inserido no plasmídio pela ação sucessiva de uma endoonuclease de restrição e da DNA ligase � Um exemplo é a inserção do gene para o hormônio de crescimento humano em bactérias 1010 10-16 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Engenharia genéticaEngenharia genética � Com o advento da tecnologia do DNA recombinante � É possível (dentro de certos limites) fazer-se alterações específicas nos genes � Até mesmo em seqüências específicas do DNA dentro de um gene � Com essas alterações, é possível modificar as características herdáveis de um organismo � Bactérias podem ser alteradas para produzir grandes quantidades de proteínas de importância médica � Animais podem ser tratados para curarem-se ou para amenizar suas doenças genéticas � Plantas agronomicamente importantes podem tornar-se mais produtivas ou apresentar resistência aumentada contra pragas 9 1010 10-17 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Bactérias como “Fabricas de Bactérias como “Fabricas de Proteínas”Proteínas” � Exemplo: engenharia genética para insulina humana � O gene da insulina contém exons que aparecem no mRNA maduro e um intron que deve ser eliminado no processo de edição do mRNA que comandará a síntese direta da insulina � As bactérias não possuem a maquinaria celular para a remoção dos introns dos transcritos de RNA � A solução é usar dois DNAs sintéticos, um para codificar a cadeia A, outro para a cadeia B � Esses DNAs sintéticos são produzidos em laboratório pelo uso de métodos que desenvolvidos por meio da síntese orgânica e inseridos em um plasmídeo vetor separado � As cadeias A e B produzidas, são extraídas e misturadas, produzindo, por fim, a insulina 1010 10-18 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Engenharia genéticaEngenharia genética � As plantas e animais são organismos multicelulares e apresentam diferentes tipos de tecidos �� Mudança somáticaMudança somática: alteração de um gene afetando apenas os tecidos diferenciados do organismo alterado �� Alterações germinativasAlterações germinativas: alterações nas células germinativas (óvulos e espermatozóides) são transmitidas para as gerações seguintes � Um exemplo de terapia gênica � O tratamento de imunodeficiência associada grave (SCID), ou a “síndrome do menino bolha” � O objetivo final é introduzir nelas o gene para a adenosina desaminase, usando um vírus como vetor, e, depois, reintroduzir as células no organismo dos doentes 10 1010 10-19 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Engenharia genéticaEngenharia genética � Adenosina desaminase participa do catabolismo das purinas � Quando essa enzima está ausente, o dATP acumula-se nos tecidos, inibindo a ação de outra enzima, a ribocucleotídio redutase � O resultado disso é uma deficiência nos outros três desoxirribonucleotídeos trifosfatos (dNTPs) � Esse desequilíbrio afeta particularmente a síntese de DNA em linfócitos, dos quais depende uma parte importante da resposta imune � Indivíduos afetados com SCID são muito susceptíveis a infecções em função de seus sistemas imunes comprometidos 1010 10-20 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Organismos Organismos TrangênicosTrangênicos �� Organismos Organismos transgênicostransgênicos: organismos que carregam genes herdáveis introduzidos por engenharia genética � Em mamíferos, como nos camundongos � O método envolve microinjeção do DNA contendo o gene desejado no núcleo de um ovo fertilizado � O DNA injetado integra-se ao genoma � Os ovos tratados dessa maneira são implantados em uma mãe de aluguel para desenvolverem-se � Quando os camundongos nascem, amostras de DNA são retiradas de suas caudas para verificar-se a presença de DNA incorporado 11 1010 10-21 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Organismos Organismos TrangênicosTrangênicos � Nas plantas � Um vetor amplamente utilizado é baseado no plasmídio de uma bactéria causadora de “galhas de coroa”, a Agrobacterium tumefaciens � As células dessa bactéria ligam-se a ferimentos nos tecidos de uma planta, transferindo plamídios para as células vegetais � Parte do DNA plasmidial insere-se no DNA da planta, constituindo-se, assim, no único exemplo conhecido de transferência natural de genes de um plasmídio bacteriano para um genoma eucarioto � A expressão dos genes do plasmídio na planta dá origem a um tumor chamado galha da coroa 1010 10-22 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Organismos Organismos TrangênicosTrangênicos � Plantas inteiras e saudáveis podem desenvolver-se a partir de células da galha, apesar de serem células germinativas � As plantas que crescem a partir de galhas podem produzir sementes férteis � Genes de qualquer fonte podem ser incorporados ao plasmídio do A. tumefaciens e ser, assim, transferidos para uma planta � Esse método foi usado para alterar geneticamente plantas de tomate que são mais resistentes à desfoliação por lagartas � Um gene que codifica uma proteína tóxica para as lagartas foi obtido da bactéria Bacillus thuringensis 12 1010 10-23 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Bibliotecas de DNABibliotecas de DNA � Uma vez que existem métodos que permitem: � Selecionar certas regiões do DNA do genoma � Clonar essas regiões de DNA em vetores adequados � A questão que surge é � É possível tomar-se todo o DNA de um organismo (o genoma total) e cloná-lo em quantidades razoáveis? � A resposta é sim, e o resultado é uma Biblioteca de Biblioteca de DNADNA � Desafio – para construir uma biblioteca do genoma humano � Existem 6 bilhões de pares de base em uma célula humana diplóide (conjunto de cromossomos de cada um dos pais 1010 10-24 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Bibliotecas de DNABibliotecas de DNA � Se considerarmos que 20,000 pares de bases é um tamanho razoável para um inserto clonado, seria necessário um mínimo de 300,000 diferentes tipos de DNAs recombinantes para cobrir todo o genoma � Na prática, precisaríamos de várias vezes esse mínimo para garantir uma representação abrangente, etc. � Nesse exemplo, utilizaremos um plasmídio bacteriano como vetor para construir um número adequado de moléculas de DNA recombinate � A primeira etapa é a separação por clonagem de membros individuais da população de moléculas de DNA plasmidial � Um modo de simplificar esse processo, é aproveitar o fato de que os plasmídios bacterianos mais usados carregam genes para resistência a certos antibióticos 13 1010 10-25 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Bibliotecas de DNABibliotecas de DNA � No nosso exemplo, o plasmídio possui um gene para resistência à ampicilina e um gene para uma enzima (bb - galactosidase), que transforma um derivado incolor de galactose em um produto de cor azul � O sítio de clivagem pela enzima de restrição (endonuclease) usada para construção do DNA recombinante fica dentro do gene para a bb - galactosidase � Se a recombinação ocorrer, o gene da bb -galactosidase será clivada e deixará de ser funcional � A presença ou ausência de bb -galactosidase e a presença ou não de resistência ao antibiótico serão indicadores para detectar a presença de plasmídeos e para saber se eles contêm ou não o inserto de DNA 1010 10-26 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Bibliotecas de DNABibliotecas de DNA � Contrução de uma biblioteca de DNA � Quando os plasmídeos estão prontos, são misturados com bactérias sensíveis à ampicilina e estas são colocadas para crescer em um meio que contenha um derivado de galactose� As células que não adquiriram o plasmídeo não crescem no meio que contém o antibiótico � As células que adquiriram um plasmídeo sem o inserto de DNA crescem no meio, pois agora possuem um gene de resistência à ampicilina � As células que adquiriram plasmídeos contendo o inserto serão resistentes à ampicilina e crescerão no meio que contém esse antibiótico 14 1010 10-27 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Bibliotecas de DNABibliotecas de DNA � O grupo de clones que adquiriu o plasmídeo contendo o inserto forma uma biblioteca de recombinantes � A biblioteca pode ser armazenada para uso posterior, ou um único clone pode ser selecionado para estudos � Bibliotecas de RNA � Não são construídas e clonadas como tais � O RNA de interesse (geralmente mRNA) é usado como molde para a síntese de DNA complementar (cDNA) � O cDNA é incorporado em um vetor � A partir desse ponto, a produção de uma biblioteca de cDNA é praticamente idêntica a do DNA genômico 1010 10-28 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Bibliotecas de DNABibliotecas de DNA � Encontrando um clone específico em uma biblioteca de DNA � Envolve a separação e o anelamento de fitas complementares � As colônias de bactérias ou placas de lise de fagos crescem em placa de Petri � Um carimbo é feito por contato contato (blotting) pressionando uma membrana de nitrocelulose contra a placa � A membrana de nitrocelulose é tratada com um agente desnaturante para abrir a dupla hélice de todo o DNA presente nela. � A membrana é tratada com DNA de fita simples (ou RNA). Esse DNA é chamado de sonda sonda (probe), sendo marcado com um isótopo radioativo ou com um radical fluorescente 15 1010 10-29 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Bibliotecas de DNABibliotecas de DNA � Uma sonda radioativa de fita simples é adicionada para detectar o DNA desejado � A sonda anela-se com o DNA de interesse, e apenas com ele � O clone de interesse pode ser retirado da placa de Petri e reproduzido � Se não houver sondas disponíveis � Escolher um vetor que permita ao gene clonado ser transcrito e traduzido, ou � A detecção pode ser realizada por anticorpos marcados 1010 10-30 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Reação em Cadeia da Reação em Cadeia da PolimerasePolimerase � As duas fitas do DNA de interesse são separadas por aquecimento � Pequenos segmentos oligonucleotídicos são adicionados em grande excesso e anelam-se com o DNA � Os pequenos segmentos são complementares às extremidades do DNA escolhido para amplificação e servem como iniciadores � DNA polimerase e outros fatores são adicionados para a síntese � As duas fitas complementares são sintetizadas na direção 5’ para 3’; um primeiro ciclo de PCR dobra a quantidade do DNA desejado � O processo de dissociação de duas fitas, de anelamento dos iniciadores e de cópias de fitas complementares é repetido � Mais de 20 ciclos podem ser completados em uma hora 16 1010 10-31 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Mapas GenéticosMapas Genéticos �� Mapa genéticoMapa genético: é a ordem dos genes em um cromossomo � Mapas genéticos clássicos � Algumas bactérias, entre elas a E. coli, podem transferir DNA de uma célula para outra, por um processo conhecido como conjugaçãoconjugação � As células estabelecem um contato físico enquanto tranferem DNA de uma para a outra � Os genes que estão próximos uns dos outros no genoma são transferidos juntos durante a conjugação � genes que estão distantes uns dos outros não são transferidos juntos � A quantidade de DNA transferido depende do tempo em que as bactérias permenecem em contato 1010 10-32 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Mapas GenéticosMapas Genéticos � Mapeamento dos cromossomos procarióticos � O mapa físico do genoma da E. coli foi obtido do seguinte modo � Foi escolhida uma endonuclease de restrição por gerar relativamente poucos fragmentos � Os fragmentos foram separados por eletroforese em gel � Os fragmentos de DNA do gel foram transferidos para um filtro de nitrocelulose pela técnica de SouthernSouthern blottingblotting � Uma solução com uma sonda de DNA de fita simples contendo uma determinada seqüência (um gene de interesse) foi incubada com o filtro de nitrocelulose 17 1010 10-33 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Mapas GenéticosMapas Genéticos � A sonda de DNA liga-se apenas aos fragmentos que contenham a seqüência de interesse; a detecção foi feita por auto-radiografia ou quimioluminescência � As posições dos fragmentos no genoma circular foram determinadas por comparação com o mapa genético clássico, que já continha a posição de mais de 1000 genes determinados � Mapeamento de cromossomos eucarióticos � Existem múltiplos cromossomos � genes are separated by long stretches of noncoding DNA sequences 1010 10-34 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Mapas GenéticosMapas Genéticos � Mapeamento do gene humano � Os primeiros genes mapeados foram os genes presentes no cromossomo X � As mulheres possuem dois cromossomos X, ao passo que os homens têm um cromossomo X e um Y � Alguns homens apresentam doenças provocadas por genes não-funcionais nos seus cromossomos X, ex.: cegueira para cores verde e vermelho (daltonismo), hemofilia e distrofia muscular de Duchenne � Essas observações tornaram possível localizar, no cromossomo X, os genes envolvidos com essas doenças � Os progressos foram lentos até o advento dos métodos de DNA recombinante 18 1010 10-35 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Mapas GenéticosMapas Genéticos � Genes para as globinas � São um grupo de genes em um cromossomo autossômico autossômico (não-sexual) � A família de genes que codifica a cadeia bb da hemoglobina consiste de um grupo de genes arranjados ao longo do chromosomo 11, na ordem em que são expressos durante o desenvolvimento � ee-globina, Ggg -globina, Agg-globina, dd -globina e bb -globina � O mapa também contém dois pseudogenes; o pseudogenepseudogene é uma cópia não-funcional de um gene que normalmente não pode ser expressa devido a algum tipo de mutação � Um arranjo similar aparece no cluster dos genes para a aa-globina no cromossomo 16 1010 10-36 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Mapas GenéticosMapas Genéticos � Os genes humanos de globinas estão entre os primeiros genes de mamíferos clonados usando técnicas do DNA recombinante � Houve interesse na clonagem desses genes com vistas ao desenvolvimento de terapias gênicas para doenças genéticas que resultam de hemoglobinas anormais � A maior parte do mRNA nos reticulócitos é de dois tipos, aquele para a cadeia a a ou aquele para a cadeia bb � Usando esses mRNAs, tornou-se possível construir sondas que permitiram a identificação dos genes de globinas em bibliotecas genômicas � Cada um desses genes estava presente em um clone que continha também regiões de DNA adjacentes a eles 19 1010 10-37 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Mapas GenéticosMapas Genéticos � Tais seqüências adjacentes foram então clonadas e puderam, assim, servir de sondas para a busca de seqüências de DNA localizadas em regiões ainda mais distantes naquele cromossomo � O processo é chamado rastreamento de cromossomo rastreamento de cromossomo � Esse tipo de método possibilitou a obtenção do mapa físico de todo o cluster da família de genes bb -globin Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição � Em organismos que possuem dois conjuntos de cromossomos, um certo gene presente em um cromossomo pode diferir-se ligeiramente da outra cópia desse mesmo gene, que ocorre no cromossomo correspondente � Esses genes são alelosalelos 1010 10-38 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Mapas GenéticosMapas Genéticos � Quando eles são iguais no parde cromossomos, o organismo é dito homozigotohomozigoto � Quando eles são diferentes, o organismo é dito heterozigotoheterozigoto � uma diferença entre os alelos, mesmo a troca em apenas um par de bases, pode significar que um alelo possui um sítio de reconhecimento para uma endonuclease de restrição que falta no outro � Assim, fragmentos de restrição de tamanhos diferentes podem ser obtidos após tratamento com nucleases � Esses fragmentos de restrição são denominados polimorfismo de comprimento de fragmentos de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restriçãorestrição, RFLPsRFLPs 20 1010 10-39 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Mapas GenéticosMapas Genéticos � Esses polimorfismos são analisados por eletroforese em gel para separação dos fragmentos por tamanho, seguido de transferência para um suporte e anelamento com uma sonda específica para o gene que está sendo pesquisado � RFLPs são bastante comuns, muito mais do que características como cor dos olhos e certas doenças hereditárias, que eram utilizadas antes para fazer o mapeamento genético � A análise de RFLPs foi usada na localização do gene alterado em casos de fibrose cística � O gene foi isolado, clonado, e a proteína codificada � Essa proteína está envolvida no transporte do íon cloreto através de membranas; se for defeituosa, o íon cloreto permanecerá no interior das células 1010 10-40 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Estrutura 1Estrutura 1aa dos Ácidos Nucléicosdos Ácidos Nucléicos � O método de Sanger-Coulson � Depende da interrupção seletiva da síntese do oligonucleotídio pelos ddNTPs � Cada ddNTP incorporado na cadeia em crescimento resulta na terminação prematura da cadeia H Ba s e H H H H H O - O - P- O - P - O - P - O- C H 2 O - O O - O O - O A 2',3'-dideoxyribonuceotide (ddNTP) 21 1010 10-41 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Estrutura 1Estrutura 1aa dos Ácidos Nucléicosdos Ácidos Nucléicos � Um fragmento de DNA de fita simples cuja seqüência se deseje determinar é usado como molde para a síntese de uma fita complementar � O iniciador faz pontes de hidrogênio com a extremidade 3’ do DNA a ser seqüenciado � A mistura reacional contendo o DNA complexado com o iniciador é dividida em quatro partes � Cada uma dessas partes contém os quatro dNTPs, um dos quais é marcado de modo a permitir a visualização � Além disso, cada uma das partes recebe um dos quatro ddNTPs � Em cada uma delas ocorre a terminação da cadeia de todas as posições possíveis daquele nucleotídio 1010 10-42 Copyright (c) 2002 V. T. Motta Estrutura 1Estrutura 1aa dos Ácidos Nucléicosdos Ácidos Nucléicos � Na eletroforese em gel de cada mistura, uma banda aparece correspondendo a cada posição onde a terminação da cadeia ocorreu � A seqüência da fita recém-formada, que é complementar ao DNA-molde, pode ser “lida” diretamente no gel de seqüenciamento � Uma variação desse método consiste de uma única mistura reacional com uma marcação fluorescente diferente para cada um dos quatro ddNTPs � Esse método tornou possível a automação do seqüenciamento do DNA, com todo o processo controlado por computadores
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