Baixe o app para aproveitar ainda mais
Prévia do material em texto
Ate este mes desc nção: O ma e Programa smo. Os cré critos na Bib D aterial deste de Educaçã éditos do co bliografia Con Cu DNA M módulo está ão Continuad onteúdo aqu nsultada. urso A For ÓDU á disponível da. É proibid ui contido sã de rense ULO I apenas com da qualquer ão dados a e II mo parâmetro forma de co os seus res o de estudos omercializaçã spectivos au s para ão do utores 38 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores MÓDULO II DNA Genômico X DNA Mitocondrial O conjunto completo de sequências no material genético de um organismo é denominado genoma, incluindo todos os cromossomos mais qualquer DNA presente nas organelas. O genoma nuclear humano possui cerca de 3300 Mb, distribuídos em 22 cromossomos autossômicos e 2 sexuais (Figura 30 e 31), compostos de 30 a 35 mil genes, caracterizando por 1,5% a 2% de DNA codificante de proteínas, sendo que 46% do total constitui-se de sequências de DNA repetitivas (Wiemann, 2001; Szymasky, 2005). Figura 30: Cromossomos humanos. 39 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 31: Cariótipo de um humano do sexo masculino. A finalização do sequenciamento do DNA humano (Tabela 1) trouxe alguns dados que alteraram os valores esperados pela comunidade científica, como por exemplo, a quantidade de genes. Estimava-se que o genoma humano possuía mais de 80.000 genes, mas após o Projeto Genoma, estima-se que existam de 20.000 a 25.000 genes (Figura 32). 40 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Tabela 1: Quantidade de nucleotídeos em cada cromossomo humano. 41 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 32: Resumo das características básicas do genoma humano. 42 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores O genoma mitocondrial possui particularidades que o diferenciam do genoma cromossômico, sendo sua herança materna. Sua estrutura circular de 16,5Kb lhe fornece maior resistência à digestão enzimática de uma única célula há a presença de milhares de mitocôndrias, cada qual com uma cópia de DNA mitocondrial, sendo que 93% do seu genoma é codificante, não possuindo íntrons e com poucas regiões repetitivas (Anderson et al, 1981). Dentro de uma única célula há inúmeras cópias do genoma mitocondrial, ao contrário do genoma nuclear, que possui uma cópia por célula (Budowle et al, 2003) (Figura 33, 34 e 35). Adaptado de http://www.fbi.gov/hq/lab/fsc/backissu/july1999/dnaf1.htm. Acessado em 28/09/2008 Figura 33: Diferenças básicas entre o DNA genômico ou nuclear e mitocondrial. 43 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 34: Representação esquemática do DNA genômico ou nuclear e do DNA mitocondrial (mtDNA). 44 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 35: Representação esquemática do DNA mitocondrial (mtDNA), de acordo com as suas regiões hipervariáveis. 45 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Marcadores de Variação Genética A variabilidade do DNA humano confere a diferença entre cada ser vivo, sendo que pode ser denominada por polimorfismo se a variação genética possuir frequência acima de 1% em determinada população e mutação abaixo desse valor (Beiguelman, 2006). Jeffreys et al. (1985) foi um dos primeiros a analisar as regiões de minissatélites do DNA humano, possibilitando a investigação de paternidade e a identificação em casos criminais. O polimorfismo dos minissatélites permite que ocorra a diferenciação dos indivíduos, aumentando a possibilidade de termos uma quantidade maior de alelos na população, desde que não sejam gêmeos idênticos, posto que terão o mesmo perfil genético. Para a análise do minissatélite, Jeffrey et al. desenvolveram o DNA fingerprint (impressão digital de DNA). Ao utilizar a tecnologia de Southern blot, obtiveram um padrão de bandas específico para cada indivíduo, como se fosse uma impressão digital. Os Single Sequence Length Polymorphism (SSLP) ou polimorfismo de comprimento de sequência única englobam os VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) ou repetições consecutivas de número variável (Wyman e White, 1980; Jeffreys et al,1985; Wolff et al,1989) ou minissatélites descritos no parágrafo anterior, e também os STR (Short Tandem Repeats) ou repetições consecutivas curtas ou microssatélites (Edward et al, 1991; Edward et al, 1992) (Figuras 36, 37 e 38). A diferença entre eles é o tamanho da sequência que se repete, sendo que nos microssatélites essa estrutura é menor, pois possuem repetições constituídas de 2 a 9 pares de bases, e o minissatélite, de 10 a 64 pares de bases. Esse DNA satélite na maioria das vezes não é transcrito, consequentemente não está associado com a expressão da informação genética (Nelleman et al, 1994; Hamond et al, 1994; Gill et al, 1994; Urquart et al, 1994; Chakraborty et al, 1999). 46 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 36: Representação esquemática comparando as VNTRs das STRs, segundo sua unidade de repetição. Figura 37: Representação esquemática das repetições consecutivas do STR TPOX e seus respectivos alelos. 47 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Os Single Nucleotide Polymorphism (SNP) ou polimorfismo de nucleotídeo único é uma variação na sequência de DNA que ocorre quando um nucleotídeo é alterado por outro em sequências de DNA que podem ou não codificar genes (Delahunty, 1996; Sobrino et al, 2005; Butler, 2005) (Figuras 38 e 39). Figura 38: Representação esquemática comparando os polimorfismos de sequência com os de comprimento. 48 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 39: Representação esquemática de sequências de DNA de três indivíduos distintos com a presença de um SNP (polimorfismo de sequência) e um STR (polimorfismo de comprimento), mostrando suas diferenças. Atualmente, os STRs e SNPs são empregados amplamente para a identificação humana e possuem diferenças relevantes (Gill et al, 2004; Butler, 2005) (Quadro 1). 49 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa.Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Quadro 1: Comparação entre os STRs e SNPs (adaptado de Butler, 2005). STR SNP Variam de 2 a 9 nucleotídeos que se repetem consecutivamente Troca de bases A/T, A/G, A/C, C/T, C/G, T/G. Apresentam-se em diversos alelos, normalmente mais de 5 Normalmente 2 Detectado por separação eletroforética em gel ou capilar Análise por sequenciamento ou hibridização em microchip. O FBI preconiza 13 STRs Estima-se que mais de 50 SNPs seriam necessários para a análise (Gill et al, 2004) Vantagens: • Banco de dados populacionais realizado no mundo todo • A presença de vários alelos facilita a identificação de mutações e misturas de DNA. Vantagens: • Os produtos de PCR podem ser menores, resultado em maior chance de amplificação, principalmente em amostras biológicas degradadas. • Após devidamente otimizados e estudados, pode-se analisar mais de 1000 SNPs em um mesmo microchip, mas essa tecnologia ainda não é amplamente empregada. 50 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores A análise dos SNPs também pode estar associada aos fenótipos individuais, havendo uma possibilidade futura de identificação de traços físicos como, por exemplo, a cor da íris (Frudakis et al, 2003). Sua grande aplicação na atualidade se dá nas pesquisas de farmacogenética e na indústria farmacêutica, na caracterização de doenças de origem genética e bioquímica (Wang et al, 1998). Jobim et al. (2006) relata que os melhores STRs utilizados na identificação humana são aqueles com maior polimorfismo (maior número de alelos), menor tamanho (100 a 200 pares de bases), elevado índice de discriminação e heterozigose, e baixa frequência de mutações. Para isso, há a necessidade dos laboratórios realizarem a frequência genética em pelo menos 100 indivíduos não relacionados. Análise do DNA Forense: Aspectos Gerais Para analisar uma amostra de material biológico visando caracterização de vínculo genético, seja familiar ou em casos criminais, qualquer contaminação de DNA estranho, ou mesmo a inadequação das metodologias aplicadas, pode resultar tanto na impossibilidade de estabelecer os perfis genéticos como na inutilização da amostra, posto que principalmente em casos forenses a amostra pode ser única. A primeira preocupação no estudo do perfil genético, visando à identificação humana, é avaliar o quanto as metodologias de detecção utilizadas pelos laboratórios são válidas, assim como seus princípios moleculares e genéticos. Tendo em vista assegurar uma geração de dados corretos e tecnologias adequadas, um apropriado programa de controle de qualidade é essencial para os laboratórios de análises clínicas que realizam identificação humana pelo DNA. Todas as metodologias de análise de DNA forense devem ser submetidas a um programa de validação visando assegurar a segurança, a reprodutibilidade e robustez da técnica (Klosterman, 2001). Resumidamente, a análise de DNA forense ocorre da seguinte maneira (Figura 40): 51 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 40: Esquema da sequência dos métodos a serem utilizados para o estudo do DNA forense, englobando os estudos da Biologia, da Tecnologia envolvida e da Genética aplicada. Desde 1989, a Sociedade Internacional de Hemogenética Forense (ISFG), que atualmente é denominada de Sociedade Internacional de Genética Forense (ISFG), publica recomendações envolvendo polimorfismos de DNA, demonstrando o interesse em avaliar a reprodutibilidade e exatidão das metodologias utilizadas. O FBI acrescenta alguns itens para o controle de qualidade dos laboratórios que trabalham com evidências de DNA forense, que inclui, além desses cuidados, a realização de periódicos testes de proficiência (a cada 180 dias) e auditorias anuais, para a manutenção da garantia de qualidade. O teste de proficiência é utilizado para monitorar o rendimento e identificar 52 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores tópicos que devem ser aperfeiçoados e a auditoria para averiguar a qualidade das atividades realizadas pelo laboratório (DNA Advisory Board, 2000). Os exercícios propostos para laboratórios que realizam caracterização de vínculo genético normalmente são constituídos de amostras biológicas de indivíduos mãe, filho e suposto pai, com o intuito de comparar as estratégias utilizadas, seus protocolos metodológicos, assim como os resultados obtidos entre os participantes (Bjerre et al, 1997; Hallengerb e Morling; 2001). No Brasil, tais testes de proficiência em identificação humana pelo DNA são realizados pelo Grupo Espanhol e Português da Sociedade Internacional de Genética Forense (Grupo Español Y Portugués - International Society for Forensic Genetics), não havendo um grupo específico que realize testes de proficiência no país. Esses testes consistem na análise de amostras de sangue e outro fluido biológico que simulam um caso forense para a manutenção da qualidade na análise do DNA de amostras (ISFG, 2000). As contaminações das amostras pelos investigadores e pessoas do laboratório podem resultar em uma incorreta interpretação do perfil genético. Dessa maneira, o desenvolvimento e cumprimento de normas de procedimentos e treinamentos específicos para o exame de DNA tornaram-se imprescindíveis (Neumayer, 1998; INTERPOL, 2001). Nos EUA o FBI implantou o CODIS - Combined DNA Index System, que tornou-se operacional em 1998, e combina a ciência forense com a tecnologia eletrônica, formando um banco de dados de perfis genéticos de DNA extraído de evidências biológicas coletadas na cena do crime e DNA de criminosos condenados por agressão sexual e outros tipos de violência física (Figura 41). Todos os estados americanos podem ter acesso a esse banco de DNA e, dessa maneira, há a possibilidade de comparar os perfis genéticos de um suspeito em um crime com os perfis contidos no CODIS, averiguando se o mesmo cometeu anteriormente outra infração (FBI, 2002). 53 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 41: Inspeção visual de evidência forense. O CODIS selecionou 13 STRs para a análise do perfil genético: CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, e D21S11 (Budowle & Moretti, 1999) (Figura 42 e Tabela 2). Esse conjunto de loci transformou-se uma referência para outros países do mundo, no que se refere à ciência forense (Sun et al, 2003). 54 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 42: STRs recomendados pelo Banco de DNA, vinculado ao FBI (CODIS), segundo a sua distribuição nos cromossomos humanos. Fonte: http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/fbicore.htm. 55 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Tabela 2 – Informação dos 13 STRs recomendados pelo CODIS. Nome do Lócus Localização do cromossomo Unidadede repetição Acesso GenBank http://www.n cbi.nih.gov/ Genbank/in dex.html Variação dos alelos Número de alelos observados CSF1PO 5q33.1 c-fms pronto- oncogene, 6° intron TAGA X14720 6-16 15 FGA 4q31.3 α-fibrinogênio 3° intron CTTT M64982 15-51,2 69 TH01 11p15.5 Tirosina hidroxilase 1° intron TC|AT D00269 3-14 20 TPOX 2p25.3 Tiroide peroxidade 10° intron GAAT M68651 6-13 10 VWA 12p13.31 von Willebrand factor 40° intron [TCTG] [TCTA] M25858 10-24 28 D3S1358 3q21.31 [TCTG] [TCTA] NT_005997 9-20 20 D5S818 5q23.2 AGAT G08446 7-16 10 D7S820 7q21.11 GATA G08616 6-15 22 D8S1179 8q24.13 [TCTA] [TCTG] G08710 8-19 13 D13S317 13q31.1 TATC G09017 5-15 14 D16S539 16q24.1 GATA G07925 5-15 10 D18S51 18q21.33 AGAA L18333 7-27 43 D21S11 21q21.1 [TCTA] [TCTG] complexo AP000433 24-38 70 Adaptado de Butler et al, 2005 O DNA working group of the European Network of Forensic Science Institutes (ENFSI) e Scientific Working Group on DNA Analysis Methods (SWGDAM) (Gill et al, 2004) levantam a possibilidade futura da substituição do banco de dados de DNA atualmente contendo os 13 STRs indicados pelo CODIS do FBI por um banco de dados 56 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores de DNA contendo informações de SNPs. Entretanto, os autores citam que a curto e médio prazo não haverá a substituição dos bancos de dados, inclusive das tecnologias utilizadas, e sim a incorporação dos mesmos em estudos forenses visando à padronização do seu uso assim como de sua análise. Essa normatização possibilita maior facilidade em comparar tanto as frequências alélicas populacionais como os resultados dos perfis genéticos, mesmo que seja realizada em outros países. Visando futuramente implantar um banco de perfis genéticos de criminosos como o CODIS, o governo federal brasileiro já adotou os STRs sugeridos pelo CODIS como referência em perícias criminais em seu Manual de Padronização de Exames de DNA em Perícias Criminais (Secretaria Nacional de Segurança Pública - SENASP, 2006), que está sendo utilizado como referência para os laboratórios que trabalham com identificação humana. 57 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Estudo da Metodologia Aplicada à Identificação Humana A análise do DNA em caracterização do vínculo genético engloba desde o domínio da metodologia de coleta do material biológico até a interpretação dos resultados obtidos (Butler, 2004) (Figura 43). Cada qual possui sua particularidade e cuidados inerentes à técnica que podem oferecer vantagens e desvantagens, de acordo com o objetivo almejado. Figura 43: Esquema de todos os procedimentos envolvidos em caracterização do vínculo genético. Este material de A ser empr TECHNO inclui: 1) c amostras; interpreta N eve ser utilizado a análise d regada e LOGY IN coleta de a ; 3) análi ção e anál o entanto, Re Elet apenas como parâ o DNA co do tipo d FORENS amostras; se dos lo lise compa para fins d Exam Col ação de a troforese e Inte C âmetro de estudo mpreende de amostr SIC SCIEN 2) extraçã oci; 4) vis arativa dos didáticos, o e pericial eta do ma Extraçã Quantific amplificaç e detecçã erpretação Controle d 58 deste Programa diversas ra que se NCE, 1992 o, purificaç sualização s resultados os tópicos em local aterial bio ão de DNA ação de D ão pela po o dos frag o dos resu de qualida . Os créditos dest etapas, in erá analisa 2; BONAC ção e quan dos frag s (INTERP serão divi de crime ológico A DNA olimerase gmentos d ultados ade te conteúdo são d dependent ada (COM CCORSO, ntificação d gmentos e POL, 2001) didos em: e ‐ PCR de DNA dados aos seus re te da meto MMITTEE 2005). O do DNA de e caracteri ). espectivos autores odologia a ON DNA processo e todas as ização; 5) s a A o s ) 59 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Exame Pericial no Local do Crime Em 2000, a Agência Federal de Investigação dos Estados Unidos (EUA), mais conhecida como FBI (Federal Bureau of Investigation), elaborou um guia para a investigação da cena do crime (TWGCSI – Grupo de trabalho técnico da investigação da cena do crime, 2000). Esse manual visa à padronização das práticas adotadas para a investigação da cena do crime dos policiais e peritos americanos, tornando-se referência em investigação da cena do crime, seja para o exame de DNA forense ou não. Eles elaboraram esse manual dividindo em cinco sessões distintas: chegada à cena do crime, documentação preliminar, avaliação da cena, processando a cena, finalizando a investigação da cena do crime. 1) Chegada à cena do crime: Um dos cuidados mais importantes da perícia criminal é a manutenção das evidências físicas e a preservação da cena do crime, que deve ser realizada imediatamente após sua constatação, e é realizado normalmente pela polícia local (Figura 44). a) Anotar o local, a data, o tipo de ocorrência, casas, veículos, eventos ocorridos e elementos envolvidos; b) Não permitir que pessoas, veículos ou objetos saiam da cena do crime, identificando possíveis vítimas e suspeitos; c) Aproximar-se da cena cuidadosamente e verificar a possibilidade de outros crimes ao redor; d) Realizar observações iniciais (olhar, ouvir e cheirar) o ambiente e anotá-los; e) Observar a possibilidade de perigo de explosão e contaminação por materiais perigosos ou tóxicos e, se necessário, chamar policiais especializados para analisar a cena do crime; 60 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 44: Esquema de isolamento da cena do crime. f) Não permitir que pessoas, veículos ou animais se aproximem da cena do crime, evitando contaminações e perigos como explosões; g) Após controlar as situações de perigo e isolar a área, a próxima atenção é chamar socorro médico para dar assistência médica necessária aos feridos, minimizando ao máximo a contaminação da cena do crime; h) Anotar todas as etapas dos cuidados médicos, desde sua hora de chegada até os cuidados prestados; i) Assegurar que evidências como roupas, objetos e manchas encontradas no corpo sejam preservadas pela equipe médica; j) Documentar todos os comentários e testemunhos de pessoas envolvidas ou presentes no local do crime ou ao seu redor; 61 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores k) Um oficial da polícia deve sempre que possível acompanhar a vítima para o hospital para garantir a preservação das evidências ou mesmo documentar comentários feitos pelo paciente; l) Lacrar a cena do crime com faixas e adesivos; m) Controlar o fluxo de pessoas, inclusive peritos e outros policiais; n) Se possível, efetuar mensurações e tirar fotografias com escalas, para preservar asevidências – como pegadas, marcas de pneu no chão, etc –, presentes na cena do crime, caso chova, neve ou derreta (se for gelo); o) Não permitir que qualquer pessoa fume, masque chiclete, use o telefone ou banheiro, coma ou beba qualquer coisa, mexa nos vidros e janelas, mude os móveis de lugar, etc. Ou seja, não permitir que mexam em qualquer objeto presente na cena do crime ou ao seu redor; p) Toda a documentação e anotações feitas pelo policial devem ser entregues ao investigador de polícia para posterior estudo e análise. 2) Documentação preliminar e avaliação da cena: a) O investigador de polícia deverá documentar todas as informações recolhidas pelo policial, organizá-las e identificá-las com os dados da região do crime (delegacia, responsável, cidade, estado, etc); b) Continuar a manutenção da cena do crime descrita anteriormente, documentando todas as pessoas que estiverem participando da investigação; c) Definir estratégias para a análise fotográfica e recuperação dos vestígios encontrados na cena do crime. 3) Processando a cena: a) O investigador deverá avaliar e posteriormente solicitar a presença de peritos criminais, de acordo com a especialidade envolvida; b) O controle da contaminação deve ser extremamente rígido, evitando-se o contágio dos profissionais, das vítimas, da cena do crime, dos objetos, etc.; 62 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores c) Utilizar equipamentos de proteção individual (EPI), como luvas (obrigatório), gorros e protetores de sapato (se necessário); d) Todo material utilizado para coleta das evidências deve estar devidamente limpo ou até esterilizado, caso seja para coleta de material biológico, e deve ser corretamente acondicionado (Figura 45); Figura 45: Envelopes e sacos de papel para coleta de evidências e objetos encontrados na cena do crime como roupas, celulares, documentos, etc. e) Toda evidência deve ser corretamente documentada, citando-se a localização, identificação e condições que se encontravam, fotografada com escalas de referência e/ou filmadas antes de ser removida da cena do crime; f) Analisar e verificar a metodologia utilizada para a coleta da evidência. Por exemplo, cada método requer equipamentos e materiais diferenciados para a sua realização. Sendo assim, para fazer a análise de impressões digitais não se utiliza o mesmo equipamento para exame de marcas de mordidas, e assim por diante; 63 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores g) Documentar qualquer intercorrência ou dificuldade havida durante a coleta do material; h) Preservar adequadamente o material coletado com a finalidade de minimizar sua degradação: refrigerado, congelado, local seco, local úmido, etc.; i) Encaminhar para os respectivos laboratórios periciais. 4) Finalizando a investigação da cena do crime: a) Determinar quais evidências foram coletadas; b) Discutir com toda a equipe envolvida na cena do crime as intercorrências e evidências. ------------------FIM DO MÓDULO II-----------------
Compartilhar