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Curso de Genética Forense 04

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MÓDULO IV 
 
Estudo da metodologia aplicada à identificação humana (cont.) 
 
Eletroforese e detecção dos fragmentos de DNA 
 
Os fragmentos de DNA amplificados por PCR são identificados após a 
eletroforese em gel de poliacrilamida, seguido da coloracão com prata, ou pela detecção 
de sinal fluorescente, na qual os iniciadores utilizados no PCR são marcados com 
fluorocromos, possibilitando a análise por sequenciador automático (Gill, 1992; Sullivan et 
al, 1992; Frégeau e Fourney, 1993). 
A eletroforese é uma metodologia amplamente empregada para a separação, 
isolamento, análise e manipulação dos ácidos nucléicos. Os ácidos nucléicos possuem 
uma carga geral total negativa, devido aos seus grupamentos fosfato do arcabouço, 
consequentemente, quando aplicados em um gel de agarose ou poliacrilamida, eles 
migrarão em direção ao ânodo em um campo elétrico (Aaji e Borst, 1972; Southern, 
1979). Em condições apropriadas de tampão, voltagem e miliamperagem, os fragmentos 
pequenos migrarão mais facilmente do que os maiores (Figura 64 e 65). 
 
 
 
 
 
97 
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 Figura 64: Fragmentos de DNA carregados negativamente migram ao pólo positivo mediante a 
presença de um campo elétrico específico. 
 
 
 
 
 
 
98 
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 Figura 65: Esquema da corrida de eletroforese com visualização dos fragmentos de DNA e das 
partículas de gel e dos poros, seguida de imagem dos fragmentos de DNA corados com brometo de etídeo 
exposto a luz ultravioleta. 
 
 
 A variação do tipo e concentração do gel propicia diferentes características de 
separação, permitindo distintas resoluções e análises. Em caracterização de vínculo 
genético utiliza-se eletroforese em gel de poliacrilamida ou eletroforese capilar para a 
análise das imagens. Em inclusão ou exclusão de paternidade, compara-se os alelos 
presentes no filho com o do suposto pai, sendo que um seria o alelo obrigatório materno e 
o outro paterno (Figura 66). O mesmo acontece em inclusão de suspeitos de um crime, no 
qual compara-se o DNA encontrado na vítima, como ocorre com marcas de mordida ou 
presença de sêmen, ou na cena de um crime. Pode ocorrer uma mistura de amostras 
biológicas contendo DNA da vítima e do agressor. Dessa maneira, confronta-se o DNA da 
vítima com o dos suspeitos e, sucessivamente, com o DNA das amostras presentes na 
cena do crime (Figura 67). Tais análises são realizadas em pelo menos 13 STRs distintos 
 
 
 
 
 
99 
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(Jobim et al, 2006; Budowle & Moretti, 1999; INTERPOL, 2001; Secretaria Nacional de 
Segurança Pública - SENASP, 2006). 
 
 Figura 66: Esquema representativo da análise de uma eletroforese em gel de poliacrilamida 
corado com prata contendo DNA de amostras biológicas da mãe, do filho e do suposto pai, de um STR 
amplificado pela PCR analisados juntamente com marcadores alélicos. 
 
 Figura 67: Esquema representativo da análise de uma eletroforese em gel de poliacrilamida 
corado com prata contendo DNA de amostras biológicas da vítima, do material biológico coletado de uma 
marca de mordida, e de três suspeitos distintos de um STR amplificado pela PCR, analisados juntamente 
com marcadores alélicos. 
 
 
 
 
 
 
100 
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Diversos tipos de equipamentos podem ser utilizados para a sua realização, 
podendo ser horizontais e verticais, grande e pequenos, sendo sua indicação própria para 
cada tipo de procedimento que queira realizar. Generaliza-se da seguinte maneira: 
 
- Cubas horizontais: gel de agarose 
- Cubas verticais: gel de poliacrilamida 
 
Géis de agarose e poliacrilamida podem ser feitos de uma variedade de formas, 
tamanhos e porosidades e podem ser corridos em um número diferente de configurações. 
As escolhas desses parâmetros dependem primeiramente no tamanho dos fragmentos a 
ser separados. Géis de poliacrilamida são mais eficientes em separações de pequenos 
fragmentos de DNA (5-500pb), que é o caso da análise do DNA forense. O poder de 
resolução é extremamente alto, e fragmentos de DNA que diferem em tamanho por pouco 
tão pouco quanto 1pb (par de base) em comprimento ou 0,1% de sua massa podem ser 
separados uns dos outros. Apesar de serem corridos rapidamente e acomodarem 
comparativamente grandes quantidades de DNA, géis de poliacrilamida possuem a 
desvantagem de serem mais difíceis de preparar e manusear do que eletroforese capilar. 
Géis de poliacrilamida são corridos em uma configuração vertical de uma corrente elétrica 
constante (Sambrook et al, 2001). 
 
Gel de Agarose 
 
Géis de agarose possuem menor poder de resolução do que géis de 
poliacrilamida, mas possuem maior alcance de separação. DNAs de 50pb até alguns 
megabases em extensão podem ser separados em géis de agarose de diferentes 
concentrações e configurações. Pequenos fragmentos de DNA (50-20000pb) são 
melhores resolvidos em géis de agarose corridos em conformação horizontal em um 
campo elétrico de força e direção constantes. Os fragmentos de DNA são comparados 
com marcadores de tamanho ou ladders ou padrões (Figura 68) (Sambrook, 2001). 
 
 
 
 
 
 
101 
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 Figura 68: Diferentes marcadores de tamanho molecular ou Ladders utilizados em eletroforese 
em gel de agarose ou até mesmo de poliacrilamida. 
 
 
No entanto, atualmente, os géis de agarose só são utilizados em DNA forense 
para a checagem do produto amplificado antes da sua eletroforese por capilar (Figura 69). 
 
 
 
 
 
102 
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 Figura 69: Gel de agarose a 2% corado por Brometo de Etídeo, fotografado durante exposição 
à luz ultravioleta, contendo um marcador de 100 pares de bases (primeira coluna: cada banda equivale ao 
peso molecular de 100 em 100 pares de bases). Os produtos de PCR de aproximadamente 220 pares de 
bases são visualizados em todas as outras colunas. Na quarta coluna, verifica-se que não existe banda, 
caracterizado pela não-amplificação do controle negativo da PCR (que não possui DNA). 
 
 
De forma generalizada, cubas horizontais são utilizadas em gel de agarose e as 
verticais em gel de poliacrilamida. Sistemas para eletroforeseem gel horizontal (Figura 
70) consistem de uma caixa que é dividida em dois compartimentos e contém uma 
plataforma no meio, que servirá de suporte para o gel, que ficará totalmente submergido 
em tampão. Os eletrodos presentes em cada compartimento fornecerão os campos 
elétricos. A corrente resultante atravessará o gel e o tampão que circunda o gel. Com 
isso, a espessura do gel e a quantidade de tampão a ser colocada deverá ser controlada 
para a obtenção de resultados reprodutíveis. O resfriamento é promovido pelo tampão 
que circunda o gel, que fica recirculando para prevenir o desenvolvimento de gradiente de 
pH e também mantém a temperatura controlada e uniforme (Sambrook et al, 2001). 
 
 
 
 
 
 
103 
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Figura 70: Cubas de eletroforese horizontal de diferentes tamanhos. 
 
 
Para cada sistema de cubas e plataformas há diferentes tipos de pentes para a 
formação de poços no gel de agarose com capacidade volumétrica diferenciada para a 
deposição das amostras. De acordo com a quantidade de agarose colocada na 
plataforma, altera-se a sua altura, possibilitando uma maior capacidade de volume do 
poço (tabela 6). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
104 
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Tabela 6: Capacidade de amostragem para Cuba Horizon 58 relativa à espessura do gel 
(Biometra. Instruction Manual - Horizon ® 58 Horizontal Gel Electrophoresis) 
 
 
 
Os cuidados para o preparo do gel de agarose estão dispostos a seguir: 
Protocolo de preparo do gel de agarose em cuba Horizon ® 58 (Biometra. 
Instruction Manual - Horizon ® 58 Horizontal Gel Electrophoresis) 
 
1) Montar as peças do equipamento de acordo com a figura abaixo: 
 
 
Disposição dos componentes da cuba de eletroforese horizontal (Biometra. Instruction 
Manual -Horizon ® 58 Horizontal Gel Electrophoresis Apparatus) 
 
 
 
 
 
 
105 
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2) Preparar o gel de agarose: 
 
a) Escolha a porcentagem do gel de agarose, a quantidade de solução que 
colocará na plataforma (Tabela ABAIXO); 
b) O gel de agarose 1% equivale a 1g de agarose para cada 100mL. Calcular a 
quantidade de agarose a ser pesada e volume total de tampão a ser utilizado. 
Coloque a agarose e o tampão 1x ou 0,5x em um Erlenmeyer; 
c) Pese o frasco contendo a solução e anote o valor; 
d) Dissolva a agarose em TBE por aquecimento em forno microondas ou banho 
de água quente, misturando ocasionalmente. Os cristais de agarose devem 
estar totalmente dissolvidos; 
e) Pesar o frasco novamente e acrescentar água deionizada para compensar a 
evaporação; 
f) Pipetar ou verter a quantidade desejada de solução na plataforma; 
g) Assegure que agarose foi distribuída por toda superfície e, se necessário, 
remova as bolhas; 
h) Espere que a solução esfrie até sua total solidificação. 
 
3) Eletroforese do gel de agarose: 
 
a) Adicione de 100 a 150 mL de tampão na cuba sobre o gel polimerizado; 
b) Remova cuidadosamente o pente e o vedador; 
c) Remova as bolhas que eventualmente estejam entre o tampão e o gel; 
d) Pipete as amostras cuidadosamente na parede do casulo. As amostras devem 
conter quantidade suficiente de glicerol ou sucrose para serem mais densos 
que o tampão; 
e) Feche a tampa da cuba de eletroforese; 
f) Conecte a cuba em uma fonte para eletroforese; 
g) Ligue a fonte e selecione a voltagem desejada. Pequenas bolhas formarão 
perto dos eletrodos quando a cuba está corretamente conectada; 
h) A voltagem e o tempo requeridos de acordo com o tampão utilizados estão 
dispostos na tabela abaixo. A corrente e o tempo de eletroforese variam de 
acordo com o volume de tampão, espessura do gel e voltagem aplicada. Para 
voltagens acima de 175V ocorre suficiente aquecimento do gel levando a 
desnaturar o gel de agarose. É necessário o resfriamento a 4°C da unidade 
durante a eletroforese. Géis contendo menos que 0,5 de agarose também 
devem ser resfriados durante a eletroforese por serem muito fracos. 
 
 
 
 
 
 
106 
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Tabela: Tempo de eletroforese para géis de agarose 1% a voltagem constante. As 
mensurações foram realizadas com gel submergido de 1 a 2 mm e com corrente 
variando de 5 a 125mA. O tempo requerido para um tampão de corrida migrar 6,5cm 
da origem. Para o gel de 1%, o tampão utilizado pelo fabricante migra 
concomitantemente com fragmentos de DNA de aproximadamente 200bp em TBE 1X 
e 400bp em TAE 1X. 
 
4) Pós-eletroforese: 
 
a) Após desconectar os cabos da fonte de eletroforese, desconecte os cabos da 
cuba, aba a tampa e retire a plataforma contendo gel do tampão; 
b) Remova o gel com cuidado para a coloração; 
c) Remova o tampão da cuba e descarte-o apropriadamente, não reutilizando. 
Enxágue com água destilada; 
d) Remova qualquer tipo de resíduo de agarose das peças utilizadas e enxágue 
com água destilada. 
 
5) Coloração do gel de agarose: brometo de étídeo (Vide a seguir). 
 
Voltagem (V) Tampão (1x) Tempo de eletroforese (a)
25 TBE 5h
TAE 5h
50 TBE 2,25h
TAE 2,25h
75 TBE 1,5h
TAE 1,4h
100 TBE 1h
TAE 56min
125 TBE 45min
TAE 42min
150 TBE 36min
TAE 34min
175 TBE 29min
TAE 27min
200 TBE 24min
TAE 22min
 
 
 
 
 
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Ácidos nucléicos submetidos à eletroforese através de géis de agarose podem ser 
visualizados por coloração e com luz UV a 300nm. Dois métodos são utilizados para essa 
finalidade: a coloração por brometo de etídio e por SYBR gold: 
O brometo de etídio é preparado como uma solução estoque de 10mg/ml em H2O e 
estocado à temperatura ambiente em frascos âmbar ou enrolados em papel alumínio. O 
corante é geralmente incorporado ao gel de agarose e tampões eletroforéticos em 
concentrações de 0,5μg/ml. A vantagem de se acrescentar o brometo de etídio na 
preparação do gel é que pode-se examinar os fragmentos de DNA durante a corrida ou ao 
final dela. A desvantagem é a redução da mobilidade eletroforética em ~15%, além da 
maior contaminação do equipamento pelo brometo. Quando efetua-se a corrida na 
ausência do corante, DNAs com formas de platôs finos são conseguidos (Sharp et al. 
1973; Sambrook et al, 2001). 
O brometo de etídio (Figura 71) contém grupos planares tricíclicos que intercalam 
entre as bases do DNA, com pequena ou nenhuma preferência sequencial. Em soluções 
saturadas de alta força iônica, aproximadamente uma molécula de etídio intercala a cada 
2.5pb (Waring 1965). Após inserção na hélice, o corante fica perpendicular ao eixo 
helicoidal e faz ligações de Van der Waals com as bases acima e abaixo (Figura 72) 
(Lepecq, 1966). A UV é absorvida pelo DNA em 254nm e transmitida para o corante; 
radiação a 302nm e 366nm é absorvida pela própria ligação ao corante. Em ambos os 
casos, a energia é retransmitida a 590nm. O brometo de etídio pode ser usado para 
detecção de RNA e DNA, mas a afinidade é maior para o DNA (Sambrook et al, 2001). 
 
Figura 71: Estrutura molecular do brometo de etídeo com seu respectivo número de registro - RN. 
 
 
 
 
 
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Figura 72: Estrutura molecular do DNA após intercalação do brometo de etídeo. 
 
 
O brometo de etídeo é um potente mutagênico, pode ser absorvido pela pele, 
irritante para os olhos, boca e trato respiratório superior. Deve ser estocado longe de 
agentes oxidantes em um local resfriado, seco e em recipiente indestrutível e fechado. 
Inúmeras precauções para manuseio e descarte devem ser realizadas para reduzir a 
contaminação tanto do pesquisador como ambiental: 
 
 
 
 
 
 
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Cuidados para a manipulação e descarte do Brometo de Etídeo 
 
Equipamentos de Proteção Individual 
 
Luvas: Utilizar luvas de nitrila para prevenir contaminação das mãos. Luvas 
descartáveis (como 4, 6 ou 8 mil azul luvas de nitrila) usadas em operações de 
laboratório suprem apenas uma barreira de contato e devem ser descartadas 
imediatamente quando há suspeitas de contaminação. Luvas descartáveis não podem 
ser usadas para proteção de materiais químicos perigosos sem utilização de duas 
luvas devido ao potencial de formar buracos mínimos. Luvas de látex descartáveis 
são passíveis de apresentar defeitos e buracos mínimos e não são recomendadas. 
 
Óculos: Utilize óculos de proteção aos químicos com escudo lateral. 
 
Trajes de laboratório: Sempre use calças compridas, sapatos fechados e 
aventais quando manusear materiais perigosos. 
 
Procedimentos de Emergência e Primeiros Socorros: Providencie ajuda de 
primeiros socorros até que auxílio apropriado chegue ao local. 
 
Ingestão: Se a pessoa estiver consciente, lave a boca com água. Não induza 
vômito. Mantenha a pessoa afetada aquecida e descansada até que auxílio médico 
chegue. 
 
Inalação: Remova a vítima do local de exposição a um local arejado 
imediatamente. Se a respiração cessar, tenha uma pessoa qualificada que possa 
fazer respiração artificial. Mantenha a pessoa afetada aquecida e descansada até que 
auxílio médico chegue. 
 
Contato com a pele: Remova roupas contaminadas (incluindo os sapatos) 
imediatamente. Lave o local afetado com sabão e detergente suave com grande 
quantidade de água até que nenhuma evidência de químico esteja presente (pelo 
menos 10 a 20 minutos). Chame um médico se você notar irritação nos olhos ou no 
trato respiratório. 
 
Contato com os olhos: Lave os olhos imediatamente com grande quantidade 
de água ocasionalmente levantando as pálpebras inferiores e superiores até que não 
haja evidências de remanescentes químicos (no mínimo 15 a 20 minutos). Remova 
lentes de contato. Chame um médico imediatamente. Se você notar irritação de uma 
exposição excessiva, vá imediatamente à avaliação de um oftalmologista. 
 
 
 
 
 
 
110 
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Descontaminação de substâncias tóxicas: brometo de etídio 
 
A prática de processos referentes à biossegurança é essencial para a 
manutenção da saúde das pessoas que lidam diretamente com organismos vivos e 
substâncias tóxicas para o ser humano. No caso dos microorganismos é fundamental 
o uso de fluxos laminares ou outras técnicas de contenção (como o do bico de 
Bunsen) que impeçam a sua dispersão durante a manipulação. Outra prática muito 
importante é que todos os materiais derivados de cultivos de microorganismos devem 
ser submetidos à esterilização (por exemplo, autoclavagem) antes de serem 
descartados. Por outro lado, é também importante eliminar ou minimizar os riscos de 
contaminação do ambiente, soluções, bancadas, equipamentos, utensílios (pinças, 
espátulas, etc.) ou vidrarias por substâncias tóxicas para o organismo humano. 
 
O processamento de substâncias com alto potencial tóxico ou mutagênico, 
como o Brometo de Etídio (EtBr), tem sido um dos grandes problemas da maioria dos 
laboratórios. O Brometo de Etídio (EtBr) é comumente utilizado nos laboratórios para 
corar ácidos nucléicos submetidos à eletroforese em gel de agarose ou a gradiente de 
Cloreto de césio. A ação do EtBr como corante se deve a sua capacidade de 
intercalar entre as bases dos ácidos nucléicos e fluorescer sob luz ultravioleta. Este 
caráter intercalante do EtBr também é responsável pelo seu alto potencial 
mutagênico, pois pode gerar alterações na estrutura do DNA as quais poderão ser 
permutadas durante o processo de duplicação. Dessa forma, a leitura errada das 
sequências de bases do DNA pode resultar em mutação. 
 
 
 
 
 
111 
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Tratamento de soluções concentradas de EtBr (até 10mg/ml) 
 
Existem várias técnicas para o tratamento de descontaminação do EtBr. A mais 
simples e fácil de ser aplicada na rotina é baseada no tratamento de soluções de EtBr 
com Permanganato de Potássio em condições de acidez. Durante esse tratamento 
haverá oxidação do EtBr pelo Permanganato resultando na formação de um 
precipitado marrom escuro. Posteriormente, esta mistura é neutralizada com NaOH e 
descartada (Sambrook et al., 1989). O protocolo, como descrito em Sambrook et al. 
(1989) é o seguinte: adicionar, se necessário, água na solução concentrada até diluir 
a concentração de EtBr para 0,5mg/ml. 
Em seguida adicionar KMnO4 0,5M equivalente a 1 volume da solução que será 
descontaminada. Misturar cuidadosamente e, em seguida, adicionar 1 volume de HCl 
2,5M. Misturar com atenção e deixar descansando por várias horas à temperatura 
ambiente. Para finalizar, neutralizar essa mistura adicionando 1 volume de NaOH 
2,5N. Novamente misturar e a solução poderá ser descartada na pia sob água 
corrente. 
Este método de descontaminação de soluções concentradas de EtBr (10mg/ml) 
é capaz de reduzir a atividade mutagênica em até 3.000 vezes como foi descrito por 
Quillardet & Hofnung (1988). 
Obs.: No caso da água utilizada no descoramento de géis, onde existe uma 
baixa concentração de EtBr, utilizar Hipoclorito de sódio (água sanitária comercial) na 
proporção de 1:2, antes de descartar na pia. Os resíduos sólidos (géis e papéis) são 
secos à temperatura ambiente e posteriormente incinerados em forno de alta 
temperatura. 
 
Referências Bibliográficas: 
QUILLARDET, P.; HOFNUNG, M. Ethidium bromide and safety – readers 
suggest alternative solutions. Letter to editors. Trends in Genetics, Amsterdam, v.4, 
p.89, 1988. 
SAMBROOK, J.; FRITSCH, E.F.; MANIATIS, T. Molecular Cloning: a 
laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor, 1989. 3v. 
 
 
 
 
 
 
112 
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Atualmente, existem outros tipos de alternativas que estão sendo incorporadas ao 
mercado, como o SYBR gold, que é o nome comercial para um corante ultrassensível 
com alta afinidade pelo DNA e uma grande ligação fluorescente com o ácido nucléico. 
Esta ligação fluorescente é >1000 vezes maior do que para o complexo do DNA com o 
Brometo de Etídio (figura 73). Assim, <20pg de DNA de dupla hélice pode ser detectada 
no gel de agarose e a coloração de géis de poliacrilamida com este corante pode captar 
100pg de DNA de fita única ou 300pg de RNA. SYBR gold apresenta máximo de 
excitação em 495nm e possui um pico secundário em 300nm. A emissão fluorescente 
ocorre em 537nm (Tuma et al, 1999). 
Géis corados com SYBR gold não deixambackground na hora da revelação e 
podem ser fotografados diretamente sem descoloração prévia. O SYBR gold não pode ser 
acrescido ao gel antes da eletroforese, pois sua presença no gel endurecido pode causar 
distorção das bandas de DNA e RNA (Sambrook et al, 2001). 
 
 
Figura 73: A sensibilidade do SYBR® Gold é maior do que a do brometo de etídeo, sendo que a 
ligação fluorescente é >1000 vezes maior do que para o complexo do DNA com o Brometo de Etídio. 
 
 
 
 
 
 
113 
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Gel de Poliacrilamida 
 
Os géis de poliacrilamida foram muito utilizados para a análise de regiões 
polimórficas do DNA para o exame do perfil genético em identificação humana. No 
entanto, atualmente os laboratórios utilizam a eletroforese capilar, como será depois 
apresentado e estudado. Mas para que haja melhor compreensão da eletroforese capilar 
existe a necessidade de estudarmos a eletroforese em gel de poliacrilamida, pois foi 
primordial para a sua realização em equipamentos contendo capilares. 
Géis de poliacrilamida são mais eficientes em separações de pequenos 
fragmentos de DNA (5-500pb). O poder de resolução é extremamente alto e fragmentos 
de DNA que diferem em tamanho por tão pouco quanto 1pb em comprimento ou 0,1% de 
sua massa podem ser separados uns dos outros (por exemplo, 1pb em 1000pb). 
Comparado com o gel de agarose (Figura 68), a separação dos fragmentos menores, 
como de 100 em 100 pares de bases, é maior (Figura 74), melhorando a análise do 
fragmento, principalmente se possuem variação de poucas bases. Outras vantagens em 
relação aos géis de agarose é que eles aceitam maiores quantidades de amostra sem 
que haja perda na resolução e o DNA recuperado dos géis de poliacrilamida são 
extremamente puros e podem ser utilizados para muitas finalidades. Géis de 
poliacrilamida possuem a desvantagem de serem mais difíceis de preparar e manusear 
do que géis de agarose (Sambrook et al, 2001). 
 
 
 
 
 
 
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Figura 74: Gel de poliacrilamida a 8% corado com prata contendo produto de PCR, cujo tamanho 
varia de 270 a 280 pares de bases. 
 
 
Monômeros de acrilamida são polimerizados em longas cadeias de uma reação 
iniciada por radicais livres (Raymond et al, 1959). Na presença de N-N’-
metilenobisacrilamida, essas cadeias formam ligações cruzadas (figura 75). A porosidade 
do gel resultante é determinado pelo tamanho das cadeias e graus de ligações cruzadas 
que ocorrem durante a reação de polimerização. A porcentagem de monômeros de 
acrilamida utilizados na preparação do gel são determinadas pelo tamanho dos 
fragmentos de DNA a serem analisados (Chramback e Rodbard, 1971; Luney et al, 1971; 
Holmes et al, 1991; Sambrook et al, 2001). 
 
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115 
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Tabela 7: Utilização do gel de poliacrilamida de acordo com a sua porcentagem de 
monômeros de acrilamida e da razão acrilamida e bis-acrilamida (modificado de 
http://nationaldiagnostics.com/article_info.php/articles_id/6). 
 
 
 
 
Há diferentes tipos de gel de poliacrilamida e cada um com suas indicações. Géis 
de poliacrilamida desnaturantes são utilizados para separação e purificação de 
fragmentos de DNA de fita única. São polimerizados na presença de um agente 
(formamida ou uréia) que suprime o pareamento de bases em ácidos nucléicos, saturando 
as pontes de hidrogênio. DNAs desnaturados migram através desses géis em uma razão 
que é praticamente independente da composição de bases e sequência. Entre os usos da 
poliacrilamida desnaturante estão o isolamento e análise de cada fita de DNA, análise de 
produtos de digestão por nuclease S1 e análise de produtos de reações de 
sequenciamento de DNA (Sambrook et al, 2001). 
 Géis de poliacrilamida não desnaturantes são utilizados na separação e 
purificação de fragmentos de DNA de dupla-fita, não sendo utilizados, atualmente, para a 
análise do perfil genético. Entretanto, a mobilidade eletroforética também é afetada pela 
composição de bases e sequência, de modo que os dúplices de DNA de mesmo tamanho 
podem diferir na mobilidade em mais do que 10%. Os géis de poliacrilamida não 
desnaturantes são usados frequentemente para preparar fragmentos de DNA altamente 
purificados e para detecção de complexos de proteína-DNA (Sambrook et al, 2001). 
Razão Acrilamida: Bis Gel % DNA / RNA 
nativo (bp) 
DNA / RNA 
desnaturado 
(bp) 
Proteína (kd) 
19: 1 4 100-1500 70-500 100-200 
 6 60-600 40-400 40-150 
 8 40-500 20-200 20-100 
 10 30-300 15-150 15-70 
 12 20-150 10-100 8-60 
20:1 5 200-2000 70-800 >150 
 6 80-800 50-500 50-200 
 8 60-400 30-300 30-125 
 10 50-300 20-200 20-100 
 12 40-200 15-125 10-70 
 20 < 40 < 40 <30 
 
 
 
 
 
 
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São utilizados os mesmos tampões descritos para o gel de agarose. A 
porcentagem de monômero de acrilamida a ser escolhida para utilização estará 
relacionada com a faixa de separação dos ácidos nucléicos a serem analisados. (Tabela 
8). 
 
Tabela 8: Faixa efetiva de separação da eletroforese em gel de poliacrilamida e o valor 
em bp correspondente à migração da coloração xileno cianol e azul de bromofenol 
(Sambrook et al, 2001). 
 
 
 
O equipamento utilizado para a eletroforese em gel de poliacrilamida é composto 
por duas placas de vidro separadas por espaçadores de até 2 mm, devidamente 
montadas em um sistema composto de uma caixa para tampão que entrará em contato 
com a parte inferior, e outra parte com a superior. A única conexão entre o tampão da 
caixa superior e inferior é o gel (Figura 76 e 77). Quanto mais alta a voltagem para a 
eletroforese,a menor espessura do gel e/ou maior porcentagem de poliacrilamida, há um 
aumento da resistência do gel, aumento demasiadamente a temperatura. Com isso, 
recomenda-se a utilização de placas com sistema de resfriamento ou aquecimento em 
eletroforese desnaturante em poliacrilamida, contendo uma placa de metal para dissipar o 
calor ou para seu aquecimento (Wartell et al, 1990; Sambrook et al, 2001). 
Concentração de 
monômero de 
acrilamida (%) 
Faixa efetiva de 
separação (bp) Xyleno cianol FF Azul de Bromofenol 
3.5 1000-2000 460 100 
5.0 80-500 260 65 
8.0 60-400 160 45 
12.0 40-200 70 20 
15.0 25-150 60 15 
20.0 6-100 45 12 
 
 
 
 
 
 
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Figura 76: Equipamento para eletroforese em gel vertical. Permite voltagens acima de 1500V. 
Fonte: http://nationaldiagnostics.com/article_info.php/articles_id/13 
 
 
 
 
 
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Figura 77: Equipamento para eletroforese em gel vertical para voltagens até 250V e 50mA. 
(Biometra. Instruction Manual - Model V-16 and V-16-2 Vertical Gel Electrophoresis Apparatus). Fonte: 
http://www.biometra.de/electrophoresis-native.0.html 
 
 
Existem diferentes tipos de tampões de corrida, como aqueles que contêm Tris-
acetato e EDTA (pH8,0; TAE), Tris-borato (TBE) ou Tris-fosfato (TPE) em concentrações 
de ~50mM (pH7.5-7.8). Segundo Sambrook et al (2001), TAE possui a menor capacidade 
tamponante e TBE e TPE são mais caros do que o TAE, mas possuem maior capacidade 
tamponante. Para fragmentos de baixo peso molecular, entretanto, a resolução é melhor 
nos tampões TBE ou TPE (tabela 9). 
 
Tabela 9: Tampões para eletroforese (Sambrook et al, 2001) 
 
Tampão Solução de trabalho Solução estoque/litro
1X 50X
40mM Tris-acetato 242gTris-base
1mM EDTA 57,1ml ácido acético glacial
100ml EDTA 0,5M (pH8.0)
1X 10X
90mM Tris-fosfato 108g Tris-base
2mM EDTA 15,5ml ácido fosfórico (85%, 1,679g/ml)
40ml de EDTA 0,5M (pH8.0)
0,5X 5X
45mM Tris-borato 54g Tris-base
1mM EDTA 27,5g ácido-bórico
20ml de EDTA 0,5M (pH8.0)
TAE
TPE
TBE
 
 
 
 
 
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Os tampões de corrida ou “loading buffers” (Tabela 10) possuem 3 finalidades: 
? aumentar a densidade das amostras, assegurando que ela afunde no 
pocinho; 
? colorir as amostras, facilitando sua visualização; 
? contém corantes que movem para o ânodo em um campo elétrico em taxas 
previsíveis. 
Azul de Bromofenol migra através do gel de agarose ~2.2 vezes mais rápido do 
que o Xileno Cianol e, corridos em tampão TBE 0,5X, cruza aproximadamente na mesma 
velocidade de DNA de dupla-fita de 300pb em comprimento, enquanto o xileno cianol 
percorre aproximadamente na mesma velocidade do DNA de dupla-fita de 4kb em 
extensão. Esta relação não muda muito para géis de agarose de porcentagem entre 0.5% 
a 1.4% (Sambrook et al, 2001). 
 
Tabela 10: Tipos de tampão de corrida para eletroforese (Sambrook et al, 2001) 
 
 
 
A eletroforese capilar é amplamente utilizada em análise de DNA forense, por 
permitir que grandes quantidades de amostras sejam analisadas de maneira 
automatizada, além de necessitar de poucas quantidades de amostra para o processo de 
injeção e podem ser facilmente reinjetadas, se necessário. Separação eletroforética em 
capilar é realizada em menos de 1 hora, se comparado com as muitas horas necessárias 
para àquela realizada em géis de poliacrilamida para identificação humana. Além do 
Tipo do Tampão Tampão 6X Temperatura de Estocagem
0,25% azul de bromofenol
0,25% xileno cianol FF
40%(p/v) sucrose em água
0,25% azul de bromofenol
0,25% xileno cianol FF
15% Ficoll (tipo 400; Pharmacia) em água
0,25% azul de bromofenol
0,25% xileno cianol FF
30% glicerol em água
0,25% azul de bromofenol
40%(p/v) sucrose em águaIV
4° C
temperatura ambiente
4°C
4° C
I
II
III
 
 
 
 
 
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tempo, a quantidade de passos para a elaboração do gel de acrilamida fazem com que 
possa haver uma chance maior de erro durante a manipulação. A desvantagem é o custo 
inicial para a compra dos equipamentos, sendo bem mais alta do que aqueles 
empregados na eletroforese em gel de poliacrilamida. No entanto, a eletroforese capilar é 
a mais empregada nos laboratórios de DNA forense (Butler, 2005) (Figura 78 e 79). 
 
 
 Figura 78: Esquema representativo de eletroforese capilar: o capilar é um tubo de fibra de vidro 
com aproximadamente 50 μm em diâmetro e é completado com uma solução de polímero viscoso 
específico para tal finalidade, que funciona como o gel das eletroforeses descritas anteriormente. As 
amostras são colocadas em uma bandeja e injetadas para o capilar aplicando-se uma voltagem de cerca de 
15000 volts, que separará o DNA em poucos minutos. Os fragmentos de PCR com fluoróforos são 
analisados assim que passam pela janela de detecção e são excitados por um laser específico. Os dados 
são automaticamente computadorizados e permitem um armazenamento e rápida análise. 
 
 
 
 
 
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Figura 79: Manipulação do sequenciador automático, que possui o sistema de eletroforese capilar. 
 
 
 
 
 
 
-----------FIM DO MÓDULO IV-----------

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