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Ate este mes desc nção: O ma e Programa smo. Os cré critos na Ref D aterial deste de Educaçã éditos do co ferência Con Cu DNA MÓ módulo está ão Continuad onteúdo aqu nsultada. urso A For ÓDU á disponível da. É proibid ui contido sã de rense LO IV apenas com da qualquer ão dados a e V mo parâmetro forma de co os seus res o de estudos omercializaçã spectivos au s para ão do utores 96 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores MÓDULO IV Estudo da metodologia aplicada à identificação humana (cont.) Eletroforese e detecção dos fragmentos de DNA Os fragmentos de DNA amplificados por PCR são identificados após a eletroforese em gel de poliacrilamida, seguido da coloracão com prata, ou pela detecção de sinal fluorescente, na qual os iniciadores utilizados no PCR são marcados com fluorocromos, possibilitando a análise por sequenciador automático (Gill, 1992; Sullivan et al, 1992; Frégeau e Fourney, 1993). A eletroforese é uma metodologia amplamente empregada para a separação, isolamento, análise e manipulação dos ácidos nucléicos. Os ácidos nucléicos possuem uma carga geral total negativa, devido aos seus grupamentos fosfato do arcabouço, consequentemente, quando aplicados em um gel de agarose ou poliacrilamida, eles migrarão em direção ao ânodo em um campo elétrico (Aaji e Borst, 1972; Southern, 1979). Em condições apropriadas de tampão, voltagem e miliamperagem, os fragmentos pequenos migrarão mais facilmente do que os maiores (Figura 64 e 65). 97 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 64: Fragmentos de DNA carregados negativamente migram ao pólo positivo mediante a presença de um campo elétrico específico. 98 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 65: Esquema da corrida de eletroforese com visualização dos fragmentos de DNA e das partículas de gel e dos poros, seguida de imagem dos fragmentos de DNA corados com brometo de etídeo exposto a luz ultravioleta. A variação do tipo e concentração do gel propicia diferentes características de separação, permitindo distintas resoluções e análises. Em caracterização de vínculo genético utiliza-se eletroforese em gel de poliacrilamida ou eletroforese capilar para a análise das imagens. Em inclusão ou exclusão de paternidade, compara-se os alelos presentes no filho com o do suposto pai, sendo que um seria o alelo obrigatório materno e o outro paterno (Figura 66). O mesmo acontece em inclusão de suspeitos de um crime, no qual compara-se o DNA encontrado na vítima, como ocorre com marcas de mordida ou presença de sêmen, ou na cena de um crime. Pode ocorrer uma mistura de amostras biológicas contendo DNA da vítima e do agressor. Dessa maneira, confronta-se o DNA da vítima com o dos suspeitos e, sucessivamente, com o DNA das amostras presentes na cena do crime (Figura 67). Tais análises são realizadas em pelo menos 13 STRs distintos 99 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores (Jobim et al, 2006; Budowle & Moretti, 1999; INTERPOL, 2001; Secretaria Nacional de Segurança Pública - SENASP, 2006). Figura 66: Esquema representativo da análise de uma eletroforese em gel de poliacrilamida corado com prata contendo DNA de amostras biológicas da mãe, do filho e do suposto pai, de um STR amplificado pela PCR analisados juntamente com marcadores alélicos. Figura 67: Esquema representativo da análise de uma eletroforese em gel de poliacrilamida corado com prata contendo DNA de amostras biológicas da vítima, do material biológico coletado de uma marca de mordida, e de três suspeitos distintos de um STR amplificado pela PCR, analisados juntamente com marcadores alélicos. 100 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Diversos tipos de equipamentos podem ser utilizados para a sua realização, podendo ser horizontais e verticais, grande e pequenos, sendo sua indicação própria para cada tipo de procedimento que queira realizar. Generaliza-se da seguinte maneira: - Cubas horizontais: gel de agarose - Cubas verticais: gel de poliacrilamida Géis de agarose e poliacrilamida podem ser feitos de uma variedade de formas, tamanhos e porosidades e podem ser corridos em um número diferente de configurações. As escolhas desses parâmetros dependem primeiramente no tamanho dos fragmentos a ser separados. Géis de poliacrilamida são mais eficientes em separações de pequenos fragmentos de DNA (5-500pb), que é o caso da análise do DNA forense. O poder de resolução é extremamente alto, e fragmentos de DNA que diferem em tamanho por pouco tão pouco quanto 1pb (par de base) em comprimento ou 0,1% de sua massa podem ser separados uns dos outros. Apesar de serem corridos rapidamente e acomodarem comparativamente grandes quantidades de DNA, géis de poliacrilamida possuem a desvantagem de serem mais difíceis de preparar e manusear do que eletroforese capilar. Géis de poliacrilamida são corridos em uma configuração vertical de uma corrente elétrica constante (Sambrook et al, 2001). Gel de Agarose Géis de agarose possuem menor poder de resolução do que géis de poliacrilamida, mas possuem maior alcance de separação. DNAs de 50pb até alguns megabases em extensão podem ser separados em géis de agarose de diferentes concentrações e configurações. Pequenos fragmentos de DNA (50-20000pb) são melhores resolvidos em géis de agarose corridos em conformação horizontal em um campo elétrico de força e direção constantes. Os fragmentos de DNA são comparados com marcadores de tamanho ou ladders ou padrões (Figura 68) (Sambrook, 2001). 101 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 68: Diferentes marcadores de tamanho molecular ou Ladders utilizados em eletroforese em gel de agarose ou até mesmo de poliacrilamida. No entanto, atualmente, os géis de agarose só são utilizados em DNA forense para a checagem do produto amplificado antes da sua eletroforese por capilar (Figura 69). 102 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 69: Gel de agarose a 2% corado por Brometo de Etídeo, fotografado durante exposição à luz ultravioleta, contendo um marcador de 100 pares de bases (primeira coluna: cada banda equivale ao peso molecular de 100 em 100 pares de bases). Os produtos de PCR de aproximadamente 220 pares de bases são visualizados em todas as outras colunas. Na quarta coluna, verifica-se que não existe banda, caracterizado pela não-amplificação do controle negativo da PCR (que não possui DNA). De forma generalizada, cubas horizontais são utilizadas em gel de agarose e as verticais em gel de poliacrilamida. Sistemas para eletroforeseem gel horizontal (Figura 70) consistem de uma caixa que é dividida em dois compartimentos e contém uma plataforma no meio, que servirá de suporte para o gel, que ficará totalmente submergido em tampão. Os eletrodos presentes em cada compartimento fornecerão os campos elétricos. A corrente resultante atravessará o gel e o tampão que circunda o gel. Com isso, a espessura do gel e a quantidade de tampão a ser colocada deverá ser controlada para a obtenção de resultados reprodutíveis. O resfriamento é promovido pelo tampão que circunda o gel, que fica recirculando para prevenir o desenvolvimento de gradiente de pH e também mantém a temperatura controlada e uniforme (Sambrook et al, 2001). 103 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 70: Cubas de eletroforese horizontal de diferentes tamanhos. Para cada sistema de cubas e plataformas há diferentes tipos de pentes para a formação de poços no gel de agarose com capacidade volumétrica diferenciada para a deposição das amostras. De acordo com a quantidade de agarose colocada na plataforma, altera-se a sua altura, possibilitando uma maior capacidade de volume do poço (tabela 6). 104 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Tabela 6: Capacidade de amostragem para Cuba Horizon 58 relativa à espessura do gel (Biometra. Instruction Manual - Horizon ® 58 Horizontal Gel Electrophoresis) Os cuidados para o preparo do gel de agarose estão dispostos a seguir: Protocolo de preparo do gel de agarose em cuba Horizon ® 58 (Biometra. Instruction Manual - Horizon ® 58 Horizontal Gel Electrophoresis) 1) Montar as peças do equipamento de acordo com a figura abaixo: Disposição dos componentes da cuba de eletroforese horizontal (Biometra. Instruction Manual -Horizon ® 58 Horizontal Gel Electrophoresis Apparatus) 105 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores 2) Preparar o gel de agarose: a) Escolha a porcentagem do gel de agarose, a quantidade de solução que colocará na plataforma (Tabela ABAIXO); b) O gel de agarose 1% equivale a 1g de agarose para cada 100mL. Calcular a quantidade de agarose a ser pesada e volume total de tampão a ser utilizado. Coloque a agarose e o tampão 1x ou 0,5x em um Erlenmeyer; c) Pese o frasco contendo a solução e anote o valor; d) Dissolva a agarose em TBE por aquecimento em forno microondas ou banho de água quente, misturando ocasionalmente. Os cristais de agarose devem estar totalmente dissolvidos; e) Pesar o frasco novamente e acrescentar água deionizada para compensar a evaporação; f) Pipetar ou verter a quantidade desejada de solução na plataforma; g) Assegure que agarose foi distribuída por toda superfície e, se necessário, remova as bolhas; h) Espere que a solução esfrie até sua total solidificação. 3) Eletroforese do gel de agarose: a) Adicione de 100 a 150 mL de tampão na cuba sobre o gel polimerizado; b) Remova cuidadosamente o pente e o vedador; c) Remova as bolhas que eventualmente estejam entre o tampão e o gel; d) Pipete as amostras cuidadosamente na parede do casulo. As amostras devem conter quantidade suficiente de glicerol ou sucrose para serem mais densos que o tampão; e) Feche a tampa da cuba de eletroforese; f) Conecte a cuba em uma fonte para eletroforese; g) Ligue a fonte e selecione a voltagem desejada. Pequenas bolhas formarão perto dos eletrodos quando a cuba está corretamente conectada; h) A voltagem e o tempo requeridos de acordo com o tampão utilizados estão dispostos na tabela abaixo. A corrente e o tempo de eletroforese variam de acordo com o volume de tampão, espessura do gel e voltagem aplicada. Para voltagens acima de 175V ocorre suficiente aquecimento do gel levando a desnaturar o gel de agarose. É necessário o resfriamento a 4°C da unidade durante a eletroforese. Géis contendo menos que 0,5 de agarose também devem ser resfriados durante a eletroforese por serem muito fracos. 106 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Tabela: Tempo de eletroforese para géis de agarose 1% a voltagem constante. As mensurações foram realizadas com gel submergido de 1 a 2 mm e com corrente variando de 5 a 125mA. O tempo requerido para um tampão de corrida migrar 6,5cm da origem. Para o gel de 1%, o tampão utilizado pelo fabricante migra concomitantemente com fragmentos de DNA de aproximadamente 200bp em TBE 1X e 400bp em TAE 1X. 4) Pós-eletroforese: a) Após desconectar os cabos da fonte de eletroforese, desconecte os cabos da cuba, aba a tampa e retire a plataforma contendo gel do tampão; b) Remova o gel com cuidado para a coloração; c) Remova o tampão da cuba e descarte-o apropriadamente, não reutilizando. Enxágue com água destilada; d) Remova qualquer tipo de resíduo de agarose das peças utilizadas e enxágue com água destilada. 5) Coloração do gel de agarose: brometo de étídeo (Vide a seguir). Voltagem (V) Tampão (1x) Tempo de eletroforese (a) 25 TBE 5h TAE 5h 50 TBE 2,25h TAE 2,25h 75 TBE 1,5h TAE 1,4h 100 TBE 1h TAE 56min 125 TBE 45min TAE 42min 150 TBE 36min TAE 34min 175 TBE 29min TAE 27min 200 TBE 24min TAE 22min 107 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Ácidos nucléicos submetidos à eletroforese através de géis de agarose podem ser visualizados por coloração e com luz UV a 300nm. Dois métodos são utilizados para essa finalidade: a coloração por brometo de etídio e por SYBR gold: O brometo de etídio é preparado como uma solução estoque de 10mg/ml em H2O e estocado à temperatura ambiente em frascos âmbar ou enrolados em papel alumínio. O corante é geralmente incorporado ao gel de agarose e tampões eletroforéticos em concentrações de 0,5μg/ml. A vantagem de se acrescentar o brometo de etídio na preparação do gel é que pode-se examinar os fragmentos de DNA durante a corrida ou ao final dela. A desvantagem é a redução da mobilidade eletroforética em ~15%, além da maior contaminação do equipamento pelo brometo. Quando efetua-se a corrida na ausência do corante, DNAs com formas de platôs finos são conseguidos (Sharp et al. 1973; Sambrook et al, 2001). O brometo de etídio (Figura 71) contém grupos planares tricíclicos que intercalam entre as bases do DNA, com pequena ou nenhuma preferência sequencial. Em soluções saturadas de alta força iônica, aproximadamente uma molécula de etídio intercala a cada 2.5pb (Waring 1965). Após inserção na hélice, o corante fica perpendicular ao eixo helicoidal e faz ligações de Van der Waals com as bases acima e abaixo (Figura 72) (Lepecq, 1966). A UV é absorvida pelo DNA em 254nm e transmitida para o corante; radiação a 302nm e 366nm é absorvida pela própria ligação ao corante. Em ambos os casos, a energia é retransmitida a 590nm. O brometo de etídio pode ser usado para detecção de RNA e DNA, mas a afinidade é maior para o DNA (Sambrook et al, 2001). Figura 71: Estrutura molecular do brometo de etídeo com seu respectivo número de registro - RN. 108 Este material deve ser utilizado apenascomo parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 72: Estrutura molecular do DNA após intercalação do brometo de etídeo. O brometo de etídeo é um potente mutagênico, pode ser absorvido pela pele, irritante para os olhos, boca e trato respiratório superior. Deve ser estocado longe de agentes oxidantes em um local resfriado, seco e em recipiente indestrutível e fechado. Inúmeras precauções para manuseio e descarte devem ser realizadas para reduzir a contaminação tanto do pesquisador como ambiental: 109 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Cuidados para a manipulação e descarte do Brometo de Etídeo Equipamentos de Proteção Individual Luvas: Utilizar luvas de nitrila para prevenir contaminação das mãos. Luvas descartáveis (como 4, 6 ou 8 mil azul luvas de nitrila) usadas em operações de laboratório suprem apenas uma barreira de contato e devem ser descartadas imediatamente quando há suspeitas de contaminação. Luvas descartáveis não podem ser usadas para proteção de materiais químicos perigosos sem utilização de duas luvas devido ao potencial de formar buracos mínimos. Luvas de látex descartáveis são passíveis de apresentar defeitos e buracos mínimos e não são recomendadas. Óculos: Utilize óculos de proteção aos químicos com escudo lateral. Trajes de laboratório: Sempre use calças compridas, sapatos fechados e aventais quando manusear materiais perigosos. Procedimentos de Emergência e Primeiros Socorros: Providencie ajuda de primeiros socorros até que auxílio apropriado chegue ao local. Ingestão: Se a pessoa estiver consciente, lave a boca com água. Não induza vômito. Mantenha a pessoa afetada aquecida e descansada até que auxílio médico chegue. Inalação: Remova a vítima do local de exposição a um local arejado imediatamente. Se a respiração cessar, tenha uma pessoa qualificada que possa fazer respiração artificial. Mantenha a pessoa afetada aquecida e descansada até que auxílio médico chegue. Contato com a pele: Remova roupas contaminadas (incluindo os sapatos) imediatamente. Lave o local afetado com sabão e detergente suave com grande quantidade de água até que nenhuma evidência de químico esteja presente (pelo menos 10 a 20 minutos). Chame um médico se você notar irritação nos olhos ou no trato respiratório. Contato com os olhos: Lave os olhos imediatamente com grande quantidade de água ocasionalmente levantando as pálpebras inferiores e superiores até que não haja evidências de remanescentes químicos (no mínimo 15 a 20 minutos). Remova lentes de contato. Chame um médico imediatamente. Se você notar irritação de uma exposição excessiva, vá imediatamente à avaliação de um oftalmologista. 110 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Descontaminação de substâncias tóxicas: brometo de etídio A prática de processos referentes à biossegurança é essencial para a manutenção da saúde das pessoas que lidam diretamente com organismos vivos e substâncias tóxicas para o ser humano. No caso dos microorganismos é fundamental o uso de fluxos laminares ou outras técnicas de contenção (como o do bico de Bunsen) que impeçam a sua dispersão durante a manipulação. Outra prática muito importante é que todos os materiais derivados de cultivos de microorganismos devem ser submetidos à esterilização (por exemplo, autoclavagem) antes de serem descartados. Por outro lado, é também importante eliminar ou minimizar os riscos de contaminação do ambiente, soluções, bancadas, equipamentos, utensílios (pinças, espátulas, etc.) ou vidrarias por substâncias tóxicas para o organismo humano. O processamento de substâncias com alto potencial tóxico ou mutagênico, como o Brometo de Etídio (EtBr), tem sido um dos grandes problemas da maioria dos laboratórios. O Brometo de Etídio (EtBr) é comumente utilizado nos laboratórios para corar ácidos nucléicos submetidos à eletroforese em gel de agarose ou a gradiente de Cloreto de césio. A ação do EtBr como corante se deve a sua capacidade de intercalar entre as bases dos ácidos nucléicos e fluorescer sob luz ultravioleta. Este caráter intercalante do EtBr também é responsável pelo seu alto potencial mutagênico, pois pode gerar alterações na estrutura do DNA as quais poderão ser permutadas durante o processo de duplicação. Dessa forma, a leitura errada das sequências de bases do DNA pode resultar em mutação. 111 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Tratamento de soluções concentradas de EtBr (até 10mg/ml) Existem várias técnicas para o tratamento de descontaminação do EtBr. A mais simples e fácil de ser aplicada na rotina é baseada no tratamento de soluções de EtBr com Permanganato de Potássio em condições de acidez. Durante esse tratamento haverá oxidação do EtBr pelo Permanganato resultando na formação de um precipitado marrom escuro. Posteriormente, esta mistura é neutralizada com NaOH e descartada (Sambrook et al., 1989). O protocolo, como descrito em Sambrook et al. (1989) é o seguinte: adicionar, se necessário, água na solução concentrada até diluir a concentração de EtBr para 0,5mg/ml. Em seguida adicionar KMnO4 0,5M equivalente a 1 volume da solução que será descontaminada. Misturar cuidadosamente e, em seguida, adicionar 1 volume de HCl 2,5M. Misturar com atenção e deixar descansando por várias horas à temperatura ambiente. Para finalizar, neutralizar essa mistura adicionando 1 volume de NaOH 2,5N. Novamente misturar e a solução poderá ser descartada na pia sob água corrente. Este método de descontaminação de soluções concentradas de EtBr (10mg/ml) é capaz de reduzir a atividade mutagênica em até 3.000 vezes como foi descrito por Quillardet & Hofnung (1988). Obs.: No caso da água utilizada no descoramento de géis, onde existe uma baixa concentração de EtBr, utilizar Hipoclorito de sódio (água sanitária comercial) na proporção de 1:2, antes de descartar na pia. Os resíduos sólidos (géis e papéis) são secos à temperatura ambiente e posteriormente incinerados em forno de alta temperatura. Referências Bibliográficas: QUILLARDET, P.; HOFNUNG, M. Ethidium bromide and safety – readers suggest alternative solutions. Letter to editors. Trends in Genetics, Amsterdam, v.4, p.89, 1988. SAMBROOK, J.; FRITSCH, E.F.; MANIATIS, T. Molecular Cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor, 1989. 3v. 112 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Atualmente, existem outros tipos de alternativas que estão sendo incorporadas ao mercado, como o SYBR gold, que é o nome comercial para um corante ultrassensível com alta afinidade pelo DNA e uma grande ligação fluorescente com o ácido nucléico. Esta ligação fluorescente é >1000 vezes maior do que para o complexo do DNA com o Brometo de Etídio (figura 73). Assim, <20pg de DNA de dupla hélice pode ser detectada no gel de agarose e a coloração de géis de poliacrilamida com este corante pode captar 100pg de DNA de fita única ou 300pg de RNA. SYBR gold apresenta máximo de excitação em 495nm e possui um pico secundário em 300nm. A emissão fluorescente ocorre em 537nm (Tuma et al, 1999). Géis corados com SYBR gold não deixambackground na hora da revelação e podem ser fotografados diretamente sem descoloração prévia. O SYBR gold não pode ser acrescido ao gel antes da eletroforese, pois sua presença no gel endurecido pode causar distorção das bandas de DNA e RNA (Sambrook et al, 2001). Figura 73: A sensibilidade do SYBR® Gold é maior do que a do brometo de etídeo, sendo que a ligação fluorescente é >1000 vezes maior do que para o complexo do DNA com o Brometo de Etídio. 113 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Gel de Poliacrilamida Os géis de poliacrilamida foram muito utilizados para a análise de regiões polimórficas do DNA para o exame do perfil genético em identificação humana. No entanto, atualmente os laboratórios utilizam a eletroforese capilar, como será depois apresentado e estudado. Mas para que haja melhor compreensão da eletroforese capilar existe a necessidade de estudarmos a eletroforese em gel de poliacrilamida, pois foi primordial para a sua realização em equipamentos contendo capilares. Géis de poliacrilamida são mais eficientes em separações de pequenos fragmentos de DNA (5-500pb). O poder de resolução é extremamente alto e fragmentos de DNA que diferem em tamanho por tão pouco quanto 1pb em comprimento ou 0,1% de sua massa podem ser separados uns dos outros (por exemplo, 1pb em 1000pb). Comparado com o gel de agarose (Figura 68), a separação dos fragmentos menores, como de 100 em 100 pares de bases, é maior (Figura 74), melhorando a análise do fragmento, principalmente se possuem variação de poucas bases. Outras vantagens em relação aos géis de agarose é que eles aceitam maiores quantidades de amostra sem que haja perda na resolução e o DNA recuperado dos géis de poliacrilamida são extremamente puros e podem ser utilizados para muitas finalidades. Géis de poliacrilamida possuem a desvantagem de serem mais difíceis de preparar e manusear do que géis de agarose (Sambrook et al, 2001). 114 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 74: Gel de poliacrilamida a 8% corado com prata contendo produto de PCR, cujo tamanho varia de 270 a 280 pares de bases. Monômeros de acrilamida são polimerizados em longas cadeias de uma reação iniciada por radicais livres (Raymond et al, 1959). Na presença de N-N’- metilenobisacrilamida, essas cadeias formam ligações cruzadas (figura 75). A porosidade do gel resultante é determinado pelo tamanho das cadeias e graus de ligações cruzadas que ocorrem durante a reação de polimerização. A porcentagem de monômeros de acrilamida utilizados na preparação do gel são determinadas pelo tamanho dos fragmentos de DNA a serem analisados (Chramback e Rodbard, 1971; Luney et al, 1971; Holmes et al, 1991; Sambrook et al, 2001). Este material de Figur cadeias cru N,N,N',N'-te A definida p (Stellwage poliacrilam Geralmen como se Diminuind de ligaçõe eve ser utilizado a ra 75: Polim uzadas em u etramethylethy porcenta por T% e en, 1997). mida. A re nte o valor dá em u do o valor d es cruzada apenas como parâ merização do uma reação ylenediamine gem da c porcentage . O aumen elação do mínimo do um gel co de C há u as (Tabela âmetro de estudo os monômer iniciada por (TEMED). Fo concentraç em de liga nto do val valor de o tamanho om porcen m aumento 7). 115 deste Programa ros de acrila r radicais liv onte: http://nat ção total d ações cruz or de T d C com o do poro o ntagens de o da estru . Os créditos dest amida e N-N res pelo per tionaldiagnost de acrilam zadas dev diminui o ta o tamanho corre quan e 19:1 de tura do po te conteúdo são d N’-metilenob rsulfato de a tics.com/articl mida mais idas a bis amanho d o do poro ndo C é ap e acrilamid oro porque dados aos seus re isacrilamida, amônia, na p le_info.php/ar a bis-acr -acrilamida dos poros o é mais proximadam da e bis-a ocorre a d espectivos autores , em longas presença de rticles_id/6 rilamida é a, por C% do gel de complexa. mente 5%, acrilamida. diminuição s s e é % e . o 116 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Tabela 7: Utilização do gel de poliacrilamida de acordo com a sua porcentagem de monômeros de acrilamida e da razão acrilamida e bis-acrilamida (modificado de http://nationaldiagnostics.com/article_info.php/articles_id/6). Há diferentes tipos de gel de poliacrilamida e cada um com suas indicações. Géis de poliacrilamida desnaturantes são utilizados para separação e purificação de fragmentos de DNA de fita única. São polimerizados na presença de um agente (formamida ou uréia) que suprime o pareamento de bases em ácidos nucléicos, saturando as pontes de hidrogênio. DNAs desnaturados migram através desses géis em uma razão que é praticamente independente da composição de bases e sequência. Entre os usos da poliacrilamida desnaturante estão o isolamento e análise de cada fita de DNA, análise de produtos de digestão por nuclease S1 e análise de produtos de reações de sequenciamento de DNA (Sambrook et al, 2001). Géis de poliacrilamida não desnaturantes são utilizados na separação e purificação de fragmentos de DNA de dupla-fita, não sendo utilizados, atualmente, para a análise do perfil genético. Entretanto, a mobilidade eletroforética também é afetada pela composição de bases e sequência, de modo que os dúplices de DNA de mesmo tamanho podem diferir na mobilidade em mais do que 10%. Os géis de poliacrilamida não desnaturantes são usados frequentemente para preparar fragmentos de DNA altamente purificados e para detecção de complexos de proteína-DNA (Sambrook et al, 2001). Razão Acrilamida: Bis Gel % DNA / RNA nativo (bp) DNA / RNA desnaturado (bp) Proteína (kd) 19: 1 4 100-1500 70-500 100-200 6 60-600 40-400 40-150 8 40-500 20-200 20-100 10 30-300 15-150 15-70 12 20-150 10-100 8-60 20:1 5 200-2000 70-800 >150 6 80-800 50-500 50-200 8 60-400 30-300 30-125 10 50-300 20-200 20-100 12 40-200 15-125 10-70 20 < 40 < 40 <30 117 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores São utilizados os mesmos tampões descritos para o gel de agarose. A porcentagem de monômero de acrilamida a ser escolhida para utilização estará relacionada com a faixa de separação dos ácidos nucléicos a serem analisados. (Tabela 8). Tabela 8: Faixa efetiva de separação da eletroforese em gel de poliacrilamida e o valor em bp correspondente à migração da coloração xileno cianol e azul de bromofenol (Sambrook et al, 2001). O equipamento utilizado para a eletroforese em gel de poliacrilamida é composto por duas placas de vidro separadas por espaçadores de até 2 mm, devidamente montadas em um sistema composto de uma caixa para tampão que entrará em contato com a parte inferior, e outra parte com a superior. A única conexão entre o tampão da caixa superior e inferior é o gel (Figura 76 e 77). Quanto mais alta a voltagem para a eletroforese,a menor espessura do gel e/ou maior porcentagem de poliacrilamida, há um aumento da resistência do gel, aumento demasiadamente a temperatura. Com isso, recomenda-se a utilização de placas com sistema de resfriamento ou aquecimento em eletroforese desnaturante em poliacrilamida, contendo uma placa de metal para dissipar o calor ou para seu aquecimento (Wartell et al, 1990; Sambrook et al, 2001). Concentração de monômero de acrilamida (%) Faixa efetiva de separação (bp) Xyleno cianol FF Azul de Bromofenol 3.5 1000-2000 460 100 5.0 80-500 260 65 8.0 60-400 160 45 12.0 40-200 70 20 15.0 25-150 60 15 20.0 6-100 45 12 118 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 76: Equipamento para eletroforese em gel vertical. Permite voltagens acima de 1500V. Fonte: http://nationaldiagnostics.com/article_info.php/articles_id/13 119 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 77: Equipamento para eletroforese em gel vertical para voltagens até 250V e 50mA. (Biometra. Instruction Manual - Model V-16 and V-16-2 Vertical Gel Electrophoresis Apparatus). Fonte: http://www.biometra.de/electrophoresis-native.0.html Existem diferentes tipos de tampões de corrida, como aqueles que contêm Tris- acetato e EDTA (pH8,0; TAE), Tris-borato (TBE) ou Tris-fosfato (TPE) em concentrações de ~50mM (pH7.5-7.8). Segundo Sambrook et al (2001), TAE possui a menor capacidade tamponante e TBE e TPE são mais caros do que o TAE, mas possuem maior capacidade tamponante. Para fragmentos de baixo peso molecular, entretanto, a resolução é melhor nos tampões TBE ou TPE (tabela 9). Tabela 9: Tampões para eletroforese (Sambrook et al, 2001) Tampão Solução de trabalho Solução estoque/litro 1X 50X 40mM Tris-acetato 242gTris-base 1mM EDTA 57,1ml ácido acético glacial 100ml EDTA 0,5M (pH8.0) 1X 10X 90mM Tris-fosfato 108g Tris-base 2mM EDTA 15,5ml ácido fosfórico (85%, 1,679g/ml) 40ml de EDTA 0,5M (pH8.0) 0,5X 5X 45mM Tris-borato 54g Tris-base 1mM EDTA 27,5g ácido-bórico 20ml de EDTA 0,5M (pH8.0) TAE TPE TBE 120 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Os tampões de corrida ou “loading buffers” (Tabela 10) possuem 3 finalidades: ? aumentar a densidade das amostras, assegurando que ela afunde no pocinho; ? colorir as amostras, facilitando sua visualização; ? contém corantes que movem para o ânodo em um campo elétrico em taxas previsíveis. Azul de Bromofenol migra através do gel de agarose ~2.2 vezes mais rápido do que o Xileno Cianol e, corridos em tampão TBE 0,5X, cruza aproximadamente na mesma velocidade de DNA de dupla-fita de 300pb em comprimento, enquanto o xileno cianol percorre aproximadamente na mesma velocidade do DNA de dupla-fita de 4kb em extensão. Esta relação não muda muito para géis de agarose de porcentagem entre 0.5% a 1.4% (Sambrook et al, 2001). Tabela 10: Tipos de tampão de corrida para eletroforese (Sambrook et al, 2001) A eletroforese capilar é amplamente utilizada em análise de DNA forense, por permitir que grandes quantidades de amostras sejam analisadas de maneira automatizada, além de necessitar de poucas quantidades de amostra para o processo de injeção e podem ser facilmente reinjetadas, se necessário. Separação eletroforética em capilar é realizada em menos de 1 hora, se comparado com as muitas horas necessárias para àquela realizada em géis de poliacrilamida para identificação humana. Além do Tipo do Tampão Tampão 6X Temperatura de Estocagem 0,25% azul de bromofenol 0,25% xileno cianol FF 40%(p/v) sucrose em água 0,25% azul de bromofenol 0,25% xileno cianol FF 15% Ficoll (tipo 400; Pharmacia) em água 0,25% azul de bromofenol 0,25% xileno cianol FF 30% glicerol em água 0,25% azul de bromofenol 40%(p/v) sucrose em águaIV 4° C temperatura ambiente 4°C 4° C I II III 121 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores tempo, a quantidade de passos para a elaboração do gel de acrilamida fazem com que possa haver uma chance maior de erro durante a manipulação. A desvantagem é o custo inicial para a compra dos equipamentos, sendo bem mais alta do que aqueles empregados na eletroforese em gel de poliacrilamida. No entanto, a eletroforese capilar é a mais empregada nos laboratórios de DNA forense (Butler, 2005) (Figura 78 e 79). Figura 78: Esquema representativo de eletroforese capilar: o capilar é um tubo de fibra de vidro com aproximadamente 50 μm em diâmetro e é completado com uma solução de polímero viscoso específico para tal finalidade, que funciona como o gel das eletroforeses descritas anteriormente. As amostras são colocadas em uma bandeja e injetadas para o capilar aplicando-se uma voltagem de cerca de 15000 volts, que separará o DNA em poucos minutos. Os fragmentos de PCR com fluoróforos são analisados assim que passam pela janela de detecção e são excitados por um laser específico. Os dados são automaticamente computadorizados e permitem um armazenamento e rápida análise. 122 Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores Figura 79: Manipulação do sequenciador automático, que possui o sistema de eletroforese capilar. -----------FIM DO MÓDULO IV-----------
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