1º Aula Introdução à biotecnol

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Processos Bioquímicos II
Processos Bioquímicos – São processos que utilizam reações bioquímicas ou biomoléculas no preparo de produtos de interesse econômico. Atualmente é utilizado o conceito de biotecnologia, considerado mais amplo.
Biotecnologia – Segundo a Federação Européia de Biotecnologia a biotecnologia é uma ciência interdisciplinar, que faz uso integrado da bioquímica, microbiologia e engenharia química para atingir a aplicação tecnológica das capacidades de micróbios e células em cultura.
	Essa definição é interessante, porem não engloba outros aspectos da biotecnologia, como a agronomia, medicina e meio ambiente/ecologia. 
No curso será discutido o uso da biotecnologia para a obtenção de substâncias químicas, produtos farmacêuticas e alimentos. Na tabela abaixo são mostrados alguns produtos obtidos por biotecnologia. Esses produtos podem ser metabolitos dos -os/células ou produtos de biotransformação por -os.
	Químicos
	Farmacêuticos
	Alimentos
	Solventes
	Antibióticos
	Bebidas Alcóolicas
	Ácidos orgânicos
	Vitaminas
	Laticínios
	Polímeros
	Vacinas
	Vinagres
	Detergentes
	Hormônios
	
	Inseticidas
	
	
	Nos produtos químicos e farmacêuticos pode haver uma “concorrência” entre processos químicos/biotecnologicos, como na produção de etanol.
	Na vitamina A era utilizado um processo biotecnologico, que foi substituido por processo químico e atualmente há a tendencia a utilizar um novo processo biotecnologico.
Microrganismos(-os) de uso industrial
	Tradicionalmente -os são utilizados pela industria de biotecnologia.
Bactérias – São -os procariontes, ou seja, entre outras características não apresentam uma membrana separando o núcleo do material citoplasmático. Seu tamanho celular é pequeno (máx. 10m), levando a uma ótima relação área volume, facilitando as trocas com o meio e tornando seu metabolismo de um modo geral muito acelerado. Apresentam parede celular e membrana plasmática. Quanto a morfologia celular podem ser divididas em :
Morfologia bacteriana: (1) cocos, ou bactérias esféricas. Os cocos podem se organizar como (2) diplocos (5) sarcinas (6) estafilococos (7) estreptococos. Cocos que não apresentam um formato perfeitamente esférico são (3) gonococos (4) Pneumococos (8) bacilos ou bactérias cilíndricas (9) vibrios (10) e (11) espirilos
	Além da morfologia celular (microscópica) bactérias apresentam também uma morfologia/cor características de suas colônias quando crescem em meio sólido.
	Outra classificação importante das bactérias é em relação a coloração no microscópio. Uma parte das bactérias pode ser corada pelo corante de Gram. Essas bactérias são chamadas Gram+. As que não são coradas por esse corante são as Gram-. A diferença de capacidade de coloração está ligada a diferenças na estrutura da parede celular.
	Bactérias se dividem por cissiparidade, não ocorrendo divisão sexual. Para compensar essa desvantagem, as bactérias podem trocar informação genética umas com as outras utilizando plasmideos, que são fragmentos de DNA circular.
Fungos – São microorganismos eucariontes (núcleo separado por membrana). Seu tamanho é maior que as bactérias (min. 10m), tendo um metabolismo mais lento devido a menor relação área/volume. Apresentam parede celular e membrana citoplasmatica. No microscópio há uma grande diversidade de formas. São classificados do ponto de vista macroscópico em:
Bolores – Formam os chamados micélios, não crescendo em meio liquido
Leveduras – São fungos que crescem bem em meio liquido, ou seja, submersos.
	Os fungos podem se reproduzir utilizando reprodução assexuada como as bactérias ou reprodução sexuada, passando por células com metade do material genético original.
	Fungos e bactérias são de um modo geral bastante flexíveis quanto aos seus aspectos nutricionais, podendo se adaptar a uma grande variedade de fontes de alimento. Porém não são autotróficos, ou seja, não conseguem aproveitar a energia da luz do sol como plantas e algas.
Células de mamíferos – Fora os fungos e bactérias, podem ser utilizadas em processos industrias. São utilizadas linhagens de células que conseguem viver e se reproduzir bem fora do seu organismo original. São muito maiores (atingem até 100m) e mais exigentes que os -os do ponto de vista nutricional, apresentando um metabolismo mais lento. São utilizadas na produção de vírus e na produção de proteínas que não podem ser produzidas por outros meios.
Vírus – São as formas vivas mais simples. Como sua bioquímica é muito limitada sempre tem que se reproduzir utilizando uma célula hospedeira. Tem muita importância em medicina, veterinária e agronomia. Industrialmente são produzidos para a preparação de vacinas e kits para diagnóstico clinico.
Algas e protozoários – São utilizados em processos muito específicos.
Seleção de microrganismos
	Os microrganismos são selecionados tradicionalmente a partir de fontes naturais. Nessa fonte (solo, por exemplo), o -o de interesse se encontra contaminado com outras espécies. Para isola-lo são necessários procedimentos específicos.
Método de diluições : nesse método a mistura de -os é diluída de forma seqüencial, diminuindo a concentração de -os presentes. Essas diluições são inoculadas em meio sólido. Cada nova colônia formada em meio sólido tende a se apresentar como uma espécie isolada. 
Meios de cultura – Como será visto mais a frente, os -os apresentam exigências nutricionais diferentes. Utilizando-se meios de crescimento seletivos, pode-se enriquecer o material no microorganismo de interesse.
Uso de inibidores – Como será discutido mais adiante, determinadas substâncias químicas podem inibir seletivamente o crescimento de microorganismos, diminuindo a contaminação por inibir algumas espécies presentes no meio.
Melhoramento de -os
	Como já foi dito, os primeiros -os foram isolados de fontes naturais. Os rendimentos de produtos obtidos, porém era baixo. Logo foi determinado que um dos fatores que limitava o rendimento era o próprio -o . Por isso foram desenvolvidas técnicas para preparar linhagens mais produtivas do -o.
	Como já foi dito, fungos podem se reproduzir de forma sexuada. Uma forma de obter linhagens mais produtivas foi “cruzar” linhagens que apresentavam características desejadas, para obter uma nova linhagem que englobasse as duas características. Por exemplo, “cruzar” uma linhagem que cresce rápido, mais com baixo rendimento, com uma de crescimento mais lento, mais com bom rendimento de produto.
	A principal técnica para produzir -os mais produtivos foi a indução de mutações. As mutações na verdade são mudanças na estrutura do DNA induzida por agentes físicos e químicos. Seguem a lógica mostrada na próxima folha.
	A mutação é um processo que ocorre naturalmente. Em processos de seleção foram utilizados agentes que apenas induziram que essas mutações ocorressem de forma mais rápida. Esses agentes provocam lesões na estrutura química do DNA. As células tem enzimas que são especializadas em reparar essas lesões, só que no processo de reparo podem ocorrer erros nas seqüências de bases nitrogenadas, levando a produção de proteínas mutantes
Exemplos de algumas lesões químicas que podem ser utilizadas para induzir mutações. A deaminação é conseguida utilizando-se nitritos, que em meio fisiológico estão em equilíbrio com o ácido nitroso. Vários reagentes eletrofilicos podem ser utilizados, como o iodometano e as mostardas nitrogenadas. As radiações são Ultra violetas e raio X.
	A mutação foi utilizada com êxito para desenvolver cepas altamente produtivas de antibióticos e vitaminas, entre outros. Apesar desses sucessos, o processo apresenta vários inconvenientes. Não há controle sobre as mutações, sendo que a maioria dos mutantes não é viável. Por esse motivo, o custo é elevado, o tempo é longo e a principio não há uma garantia de sucesso. 
Manipulação genética de -osO uso de técnicas de mutação no desenvolvimento de -os mais produtivos começou em torno de 1940. No final da década de 1960 o conhecimento acumulado de genética microbiano foi ajudado pela descoberta de enzimas que podiam manipular de forma controlada o DNA, iniciando a era da engenharia genética.
	O fundamento dessa técnica é o uso dos plamideos, fragmentos de DNA circular que as bactérias podem trocar umas com as outras. Esses fragmentos podem ser “abertos” com enzimas seletivamente, e novos fragmentos de DNA contendo genes para a preparação de proteínas de interesse. O esquema abaixo mostra de forma resumida como é feito o processo.
	O plasmideo codifica vários genes, como o gene A. Utilizando-se enzimas o plamideo pode ser aberto, um novo gene B introduzido e o plasmideo pode ser fechado e inserido na bactéria. A bactéria irá produzir a proteína codificada em B, que pode ser o produto de interesse. Outra possibilidade é que a proteína seja uma enzima que irá produzir um metabolito que é o produto de interesse. 
Caracterização de -os
	A caracterização de um microrganismo purificado e selecionado é importante para demonstrar que não ocorreu uma contaminação do microrganismo por outra espécie e o -o selecionado manteve sua característica. Pode ser feita de várias maneiras.
Provas bioquímicas : Utilizando-se alguns testes que são sensíveis ao metabolismo do -o, pode-se verificar se é a cepa escolhida ou não. O inconveniente destes métodos é o tempo demorado para a obtenção de resposta. 
Morfologia/cor das colônias em meio sólido
Testes Imunoquímicos : Quando inoculados em animais, -os estimulam a produção de proteínas especificas pelo sistema imunológico. Essas proteínas são chamadas de anticorpos e reconhecem seletivamente o -o que foi inoculado. Desta forma existem anticorpos comerciais que reconhecem determinados -os, e produzem reação colorida na presença deles. Laboratórios também podem preparar seus próprios anticorpos, precisando ter animais disponíveis. Esses métodos são rápidos, sensíveis e seletivos. O grande inconveniente é que os reagentes são caros.
Análise de Proteínas totais : Uma das características de uma cepa de -o é o perfil eletroforético de proteínas celulares totais. Se a cepa permaneceu estável, esse perfil não varia. A estabilidade pode ser determinada comparando o perfil da cepa em análise com uma cepa de referência.
Análise de isoenzimas: Teste semelhante a analise de proteínas totais, só que na eletroforese se utiliza um reagente que desenvolve cor somente na presença de determinada enzima. O perfil eletroforético de uma cepa é dessa forma um marcador de sua identidade. Tem uma sensibilidade maior que o anterior. 
Análise genética: O DNA do microorganismo pode ser analisado por eletroforese após extração e fragmentação com enzimas. O perfil eletroforético deve ser o mesmo de uma cepa de referência.
Armazenagem de -os
Os -os podem ser mantidos de duas formas principais
Repiques sucessivos : Por esse método o -o é transferido de um meio de crescimento para outro, após um intervalo de tempo. Esse método é antigo e tem várias desvantagens. Durante a manipulação há sempre o risco de contaminação. O -o pode sofrer mutações ao longo do tempo.
Liofilização : Nesse método uma amostra de -o é congelada é a água presente é removida por vácuo molecular. É desta forma uma secagem à frio. A remoção do excesso de água e a redução de temperatura contribuem para estabilizar o -o, podendo esse ser guardado por longo tempo em meio refrigerado, como freezer e nitrogênio líquido.
Fornecimento de -os de referencia
ATCC – American Type Culture Collection
	Maior coleção de -os do mundo. Fornece cepas de referencia.
Fora a ATCC as empresas multinacionais mantém suas próprias coleções, com cepas geneticamente manipuladas de alta produtividade. O acesso a essas cepas é restrito por razões de segurança industrial. 
INCQS – Fiocruz
	Fornece cepas de referência no Brasil.
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