Fundamentos e Técnicas de Criopreservação de Embriões (pdf)

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINÁRIA
CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA 
FUNDAMENTOS E TÉCNICAS 
DE CRIOPRESERVAÇÃO DE 
EMBRIÕES BOVINOS
HEIMY PISSINATI RODRIGUES
ORIENTADOR: PROF. DR. ANTONIO CAMPANHA MARTINEZ
1	INTRODUÇÃO
Whittingham et al., 1972 
Wilmut, 1972
Wilmut e Rowson, 1973
Fukuda et al., 1990
Polge et al., 1949
Whittingham et al. (1972) e Wilmut (1972) relataram pioneiramente a congelação, com êxito, de embriões de camundongos, baseado nos trabalhos utilizando sêmen de galo, realizados por Polge et al. (1949).
Logo depois, Wilmut e Rowson (1973) produziram o primeiro bezerro vivo com a transferência de um embrião bovino produzido in vivo e criopreservado pela técnica de congelação clássica.
O primeiro bezerro nascido de embriões bovinos produzidos totalmente in vitro e criopreservados/descongelados foi relatado por Fukuda et al. (1990).
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2		REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 
2.1		CRIOPRESERVAÇÃO
Preservação do metabolismo celular
Etapas comuns em todas as técnicas:
ACP’s
Temperatura
Descongelação
Remocão dos ACP’s
A criopreservação de embriões consiste na preservação do metabolismo celular em estado de quiescência, por tempo indeterminado, através da exposição à baixas temperaturas (criogênicas), que induzem à suspensão de todas as reações químicas, atividades físicas intra e extracelulares e processos biológicos, porém, mantendo as células íntegras para que após a descongelação, o embrião possa retomar seu desenvolvimento normal.
quatro etapas são comuns em todas as técnicas de criopreservação: (I) exposição das células à agentes crioprotetores (ACPs); (II) resfriamento à uma temperatura baixa o suficiente para causar redução das atividades celulares; (III) descongelamento por aquecimento até o nível fisiológico; (IV) remoção do ACP do meio intracelular e restituição da osmolaridade. 
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2.2		CRIOPROTETORES
Ponto de congelamento
Remoção da água intracelular
Proteção
Equilíbrio osmótico
Viscosidade 
Os agentes crioprotetores são substâncias de classe orgânica variada, que agem protegendo a célula durante o período de armazenamento em baixas temperaturas, evitando a formação de gelo intracelular, possíveis danos causados pela desidratação e choque osmótico. Portanto, todos os métodos de criopreservação, independente da técnica necessitam de ACPs para proteção, tanto na congelação como no descongelamento. 
Os ACPs promovem a redução do ponto de congelamento do meio, fornecendo um tempo maior para remoção da água intracelular durante a pré-congelação. Além, de auxiliar na proteção das membranas celulares ao estresse provocado durante o processo. Crioprotetores aumentam a viscosidade da solução e fornecem equilíbrio osmótico entre a solução e o material biológico.
Um eficiente crioprotetor deve apresentar características fundamentais como: (I) baixo peso molecular; (II) alta capacidade de ultrapassar a membrana celular e (III) baixa toxicidade. ACPs que penetram rapidamente a membrana são mais indicados, pois o menor tempo de exposição do embrião ao agente antes da congelação previne injúrias osmóticas.
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Fonte: Embryo. Disponível em: <http://www.embryo.med.br/web/congelamento-de-embrioes/>. Acesso em: 28/11/2017.
Intracelulares: 
Etilenoglicol (EG)
Dimetilsulfóxido (DMSO)
Propanodiol (PROH)
Glicerol (GLY)
Extracelulares:
Sacarose
Glicerose
Manitol
Trealose
Os crioprotetores são classificados em duas categorias: (I) intracelulares ou permeáveis – são pequenas moléculas que ultrapassam a membrana celular, penetrando o meio intracelular, reduzindo a temperatura de congelação e evitando a formação dos CGI, a retração que ocorre no embrião quando este é exposto à um agente intracelular é devido a perda de água decorrente da hiperosmolaridade inicial do meio extracelular, além da propriedade do embrião ser mais permeável à saída de água do que à entrada do crioprotetor. Entre os mais utilizados encontram-se o etilenoglicol (EG), dimetilsulfóxido (DMSO), propanodiol (PROH), e glicerol (GLY). 
E os extracelulares ou não permeáveis – são macromoléculas e açúcares que permanecem no meio extracelular, removendo a água intracelular por osmolaridade e promovendo a desidratação, além de proteger a membrana celular; alguns exemplos incluem a glicose, sacarose, manitol e trealose.
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Etapas
Concentrações e associações
Congelação x Vitrificação
Toxicidade
Destaca-se, na atualidade, uma disposição desses crioprotetores serem adicionados de uma só vez, ainda que, este procedimento também possa ser realizado em várias etapas. Para isso, os crioprotetores são acrescentados em concentrações crescentes, intervaladas por alguns minutos, pretendendo, assim, evitar um intenso choque osmótico. Geralmente, agentes não penetrantes são combinados com os penetrantes com o intuito de diminuir a concentração destes no meio intracelular, prevenindo a formação dos CGI e reduzindo a toxicidade celular.
na técnica convencional, na maioria das vezes, utiliza-se somente um agente; a concentração utilizada é baixa (1-2M) e a remoção de água intracelular ocorre lentamente (SARAGUSTY; ARAV, 2011), portanto, não previne a formação dos CGI.
Na vitrificação, realiza-se misturas de crioprotetores e utiliza-se entre 4-8M 
Quanto maior for esse valor, maior será a temperatura de transição para o estado vítreo e, consequentemente, menor será a chance de formação dos CGI.
A toxicidade dos agentes é proporcional ao tempo de exposição dos embriões aos mesmos e ao aumento da concentração. Na década de 80, estudos já relatavam a toxicidade dos crioprotetores como um entrave para o sucesso da criopreservação (FAHY, 1986). Portanto, têm-se pesquisado novas substâncias capazes de proteger as células dos efeitos deletérios das baixas temperaturas e que não sejam prejudiciais às mesmas (HAN, 2009). Além, da elaboração de novas estratégias, como a utilização de agentes menos tóxicos e/ou a associação de dois ou mais crioprotetores.
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2.3		MÉTODOS DE CRIOPRESERVAÇÃO
2.3.1 	Congelação Lenta Controlada
25°C a – 7°C 
1 a 3°C/min
Seeding
-30°C a -35°C
0,3-1°C/min
Imersão em LN2
Vantagens x Desvantagens
Primeiramente, os embriões são envasados em palhetas de 0,25mL para serem submetidos à congelação. Necessitando, para isto, de um aparelho de congelação programável para regular as diferentes quedas sucessivas de temperatura. A princípio, a temperatura diminui de 25°C a – 7°C a uma velocidade que pode variar de 1 a 3°C/min, permanecendo estável por cinco minutos até a indução da cristalização. O seeding é realizado pelo contato de um objeto metálico resfriado em LN2 com a palheta . Este processo induz a mudança do estado líquido da água para gelo, portanto os embriões congelam lentamente. A temperatura para a realização do seeding depende do ponto de congelação da solução e dos crioprotetores utilizados. Após 10-15 minutos ocorre o equilíbrio e então os embriões são congelados gradualmente pela redução da temperatura entre 0,3-1°C/minuto, até atingir -30 a -35°C. Neste instante, ocorre a formação de gelo extracelular e aumento da concentração do soluto neste meio. Após a desidratação da célula, a concentração elevada dos solutos impedirá a cristalização do gelo, e então a palheta é imersa no LN2 à -196°C, evitando a ocorrência de desidratação muito intensa e consequente morte embrionária. 
VANT.: Esse método apresenta tranquilidade para execução, devido ao longo tempo dos banhos, além de possibilitar a realização de transferência direta; um treinamento curto é suficiente para a sua realização; os danos tóxicos e osmóticos decorrentes parecem não ser tão graves, já que são utilizadas baixas concentrações das soluções crioprotetoras ; 
DESV.: No entanto, essa concentração é insuficiente para prevenir a formação de CGI, prejudicando a recuperação e sobrevivência das células embrionárias; requer obrigatoriamente um aparelho programável de congelação; em algumas espécies,não é viável a sua utilização, principalmente a suína, nem em todos os estádios embrionários, pela sensibilidade maior às temperaturas entre 15°C e -5°C; o método lento de congelação além de ser um processo demorado, requer um grande volume de LN2; custo do equipamento e a demora do processo 
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2.3.2	Vitrificação 
Taxa de resfriamento
ACP’s
Viscosidade 
Desidratação
Estado vítreo
Toxicidade celular e choque osmótico
Alternativas?
O sucesso da vitrificação é dependente de três fatores: a viscosidade, o volume da amostra e as taxas de congelação/reaquecimento. Sendo todos independentes, e ressaltando que quanto maior for a viscosidade e a taxa de refrigeração, maior será a probabilidade de vitrificação. Entretanto, quanto menor for o volume, maior serão as chances de sucesso, pois permite maior rapidez de resfriamento e redução de injúrias. 
A vitrificação apresenta uma estratégia divergente à aplicada no método convencional, visto que na última, a taxa de resfriamento é lenta, para que haja um equilíbrio entre vários fatores que podem gerar danos, como fraturas da zona pelúcida e de embriões, alterações celulares, injúrias osmóticas, formação de CGI, efeito tóxico dos ACP, entre outros, à medida que a vitrificação elimina completamente a formação dos CGI.
Ao contrário da congelação lenta, em que a solução se cristaliza. A vitrificação é um processo físico no qual uma solução hiperconcentrada (cerca de 40% da solução), se solidifica a taxas rápidas de resfriamento (107°C/s), tornando-se muito viscosa, apropriando-se de um estado amorfo (vítreo), que conserva a distribuição molecular e iônica do estado líquido, ou seja, inibe a formação do CGI. A passagem pela zona crítica de temperatura ocorre de forma rápida, impedindo a ocorrência destas injúrias. 
Apesar dos ACPs em alta concentração aumentarem a viscosidade dos meios intra e extracelulares, tornando possível essa passagem do estado líquido ao vítreo sem a formação dos cristais, e permitirem a desidratação do embrião pela rápida saída de água, esta hiperconcentração acarreta em efeitos tóxicos e hipertônicos à célula, e consequentemente, elevam as chances de ocorrer injúrias pelo choque osmótico e pela toxicidade celular. 
COMO DITO ANTERIORMENTE, GERALMENTE NESSA TÉCNICA SÃO UTILIZADAS ASSOCIAÇÕES DE ACP’s, UMA OU MAIS ETAPAS, MÉTODOS DESENVOLVIDOS PARA REDUZIR O VOLUME E AUMENTAR A TAXA DE CONGELAÇÃO
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2.3.2.1	Técnica convencional em palhetas de 0,25 mL
160-200μL de solução, ar, 20μL do meio com os embriões, ar e 25μL de solução
2000°C a 2500°C/min
Imersão em LN2
30 segundos
Estas palhetas são preenchidas em colunas, na seguinte ordem: 160-200μL de solução, ar, 20μL do meio com os embriões, ar e 25μL de solução. Após serem seladas, as palhetas são imersas em LN2. O tempo decorrido desde a exposição aos ACPs até a imersão em LN2 é de aproximadamente 30 segundos. 
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2.3.2.2		Open Pulled Straw (OPS)
0,5-2μL
Imersão em LN
20000°C/min
Contaminação
< 30 segundos
A técnica OPS foi desenvolvida por Vajta et al. (1997) primariamente para embriões bovinos. A palhetas francesas de 0,25mL foram adaptadas, para esse método, através do aquecimento em sua região central e estiramento manual, até que o diâmetro interno e a espessura da parede atingissem metade do tamanho original. Em seguida, foram resfriadas ao ar e cortadas na região estreita. 
Cerca de 0,5-2μL da solução de vitrificação com o embrião é inserido por efeito capilar simples na extremidade estreita da palheta. Essa porção, contendo o embrião é então imersa rapidamente no LN2, de forma que a coluna solidifique sem que ocorra dispersão da solução. Esta redução do diâmetro, permite o envase do embrião por capilaridade e a utilização de um volume menor, e consequentemente, aumenta a taxa de resfriamento em até dez vezes, se comparada às palhetas originais, alcançando cerca de 20000°C/min. Outras razões para esta taxa de resfriamento são o contato direto entre a solução e o material resfriado/aquecido e a redução da espessura da parede da palheta (cerca de 0,07mm na palheta estendida e 0,15mm na original). 
Os altos padrões de resfriamento e aquecimento reduzem os danos causados pela vitrificação, além disso, promove a imediata diluição dos ACPs durante o reaquecimento, uma vez que o tempo de exposição total dos embriões à estes é menor que 30 segundos, portando os efeitos tóxicos e osmóticos são minimizados.
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2.3.2.3	Vitrificação em Grades De Microscopia Eletrônica
Imersão em LN2
1µL
> 20000°C/min
30 segundos 
Martino et al. (1996b) desenvolveram esta técnica utilizando as grades de microscopia eletrônica como suporte físico para os embriões ou oócitos, imergindo-as imediatamente ao LN2, com o objetivo de alcançar uma curva de resfriamento ultrarrápida, cuja velocidade de congelação é maior do que 20000°C/min. Dessa forma, um pequeno volume de crioprotetor (1µL) é suficiente para manter os embriões, e então os mesmos são mergulhados quase que em contato direto com o LN2.
Os embriões são transferidos sobre a grade, com o auxílio de uma pipeta, em um volume pequeno de solução. O lado inferior é então colocado sobre um papel filtro, para reduzir o excesso de meio, mantendo apenas os embriões. Utilizando uma pinça, a grade é então imersa no LN2. Este processo, desde a exposição aos ACPs até a imersão, dura em média 30 segundos (MARTINO et al., 1996b). Após a vitrificação, as amostras são armazenas em criotubos e mantidas no LN2 (KIM et al., 2006).
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2.3.2.4 Cryoloop
Fonte: SAKI; DEZFULY (2005)
A técnica de Cryoloop, desenvolvida por Lane et al. (1999a), consiste na utilização de um instrumento constituído por uma alça de metal presa com um laço de nylon (0,5-0,7mm de diâmetro e 20μm de largura). 
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1-2μL
Imersão em LN2
< 45 segundos
Fonte: SAKI; DEZFULY (2005)
Esse laço é preenchido por solução de vitrificação que forma uma fina película deste sobre o mesmo. Em seguida, o meio contendo o embrião (1-2μL) é sobreposto à película com auxílio de uma pipeta de vidro. Devido à concentração elevada de ACPs essa solução se encontra bastante viscosa, promovendo uma tensão superficial que mantém o material fixo. O dispositivo é então imerso no LN2. O tempo entre o contato com os ACPS e a imersão do embrião é menor que 45 segundos. Geralmente o cryoloop é armazenado no interior de criotubos.
Os embriões mantidos em meio de cultura com crioprotectores são pipetados no circuito de nylon, que foi mergulhado em crioprotetor para formar uma película fina. A fotografia mostra embriões bovinos de oito células mantidos dentro de um loop. 
O loop é mergulhado diretamente no líquido N2 e, enquanto estiver sob o nitrogênio, a tampa é perfurada no frasco para injectáveis. O loop neste caso é afixado a um pino colado dentro da tampa de um criovial. As tampas utilizadas neste estudo e mostradas nesta fotografia contêm uma placa magnética e podem ser facilmente manipuladas com a varinha magnética mostrada, ou com uma pinça de bloqueio padrão. O loop de nylon foi retocado amarelo para mostrar sua localização e tamanho. 
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2.3.2.5	Vitrificação em Micropipeta De Vidro (GMP)
Alternativa para a OPS 
0,14μl
25 segundos
Fonte: BUNN (2007)
A técnica em micropipeta de vidro foi desenvolvida por Kong et al. (2000) como uma alternativa para a OPS com o objetivo de substituir a palheta por uma que não flutue no LN2 e que possua um diâmetro externo e interno menor, permitindo uma maior taxa de resfriamento, consequente à maior condutividade do vidro e ao menor volume da solução contendo o embrião. O tempo entre o contato dos embriões com os ACPs e a vitrificação não excedeu 25 segundos.
Esta micropipeta também é produzida por meio do estiramento, utilizando a mesma técnica descrita para a produção da OPS. O diâmetro externo e interno da OPS é de 1,7mm e 0,8mm, respectivamente, com capacidade para armazenar um volume de 2,68mm3 de solução. Já na micropipeta estes diâmetros são de 1,0mm e 0,3mm, respectivamente, podendo conservarum volume de apenas 0,14μl. 
A maior limitação dessa técnica é a maior fragilidade da micropipeta no armazenamento, sendo comumente quebrada ou rachada próxima a extremidade mais estreita. 
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Palheta convencional de 0,25mL (1,7 mm)
 OPS (0,8 mm) 
Micropipeta de vidro (0,3 mm) 
Fonte: RODRÍGUEZ; JIMÉNEZ (2011).
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2.3.2.6	Cryotop	
Fonte: adaptado de KUWAYAMA et al. (2005).
0,1μl
> 23000°C/min
Dentre os métodos desenvolvidos para diminuir o volume da solução e evitar o contato com o LN2, o mais utilizado nos últimos anos para a vitrificação de embriões bovinos é o Cryotop . Esta técnica consiste em um fino filme, acoplado à uma haste de plástico para facilitar o manuseio (Figura 5), cujo embriões são colocados em um pequeno volume (0,1μl) e submersos diretamente em LN2. Essa redução de volume permite uma taxa de resfriamento extremamente rápida, podendo alcançar mais que 23000°C/min, e consequentemente há uma passagem muito rápida pela zona de perigo (15°C a -5°C). As taxas de aquecimento também são elevadas (>42000°C/min), o que segundo a literatura, é o mais importante no processo de desvitrificação. Portanto, essa técnica tornou-se um dos métodos de vitrificação disponíveis mais eficaz, representado a alternativa mais confiável.
Foto representativa do Cryotop. Observa-se o fino filme (a) acoplado à haste de plástico (b). A tampa plástica (c) recobre a palheta, impedindo o contato direto com o LN2. 
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2.4	DESCONGELAÇÃO/REAQUECIMENTO
Diminuição da viabilidade celular 
Recristalização
Osmolaridade
Remoção do(s) ACP(s)
Tem-se observado, desde os primeiros relatos, que o êxito da transferência de embriões criopreservados é afetado pela diminuição da viabilidade celular após a descongelação, resultando em taxas inferiores às obtidas a partir de embriões transferidos a fresco. Portando, assim como no processo de congelação, a descongelação pode intervir na sobrevivência embrionária. Segundo Woods et al. (2004), o sucesso deste procedimento é dependente da técnica utilizada na criopreservação, da reidratação celular e da remoção do crioprotetor. 
A descongelação de forma lenta pode causar a formação de grandes CGI através do crescimento de pequenos núcleos de cristais oriundos da criopreservação, resultando em recristalização e decorrentes injúrias (BROCKBANCK et al., 2001). Neste processo, ocorre fluxo de água e ACPs através da osmolaridade, assim como na criopreservação, pela membrana celular. Essa alteração do volume celular é um fator importante relacionado à ruptura de membrana e prevenção de danos mecânicos.
O processo de remoção do ACP pode ser feito em uma única etapa, através da adição de sacarose ao meio, de forma que ocorra uma força osmótica contrária, pois esta substância não penetra na célula e enquanto isso o agente intracelular pode passar para o meio extracelular mais rapidamente.
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Fonte: Embryo. Disponível em: <http://www.embryo.med.br/web/congelamento-de-embrioes/>. Acesso em: 28/11/2017.
3	CONCLUSÃO
Protocolo único
Inconsistência de pesquisas
O número elevado de soluções crioprotetoras e os diferentes métodos de criopreservação dificultam a determinação de um único protocolo. As informações publicadas até o momento são inconsistentes, pois os resultados de sobrevivência pós criopreservação variam significativamente. Além do mais, os efeitos estruturais da criopreservação foram amplamente descritos, mas poucos estudos compararam o uso de diferentes suportes de vitrificação em termos de tais efeitos.
Portanto, à medida que se avance no conhecimento sobre princípios e técnicas criobiológicas, será possível a identificação de pontos cruciais para o desenvolvimento de métodos que provoquem menores crioinjúrias, tornando-as totalmente reversíveis ou até mesmo nulas ao desenvolvimento embrionário subsequente.
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OBRIGADA!!!
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