Resumo do Capitulo 2 do livro Biologia celular (Junqueira; Carneiro)

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Biologia Celular e Molecular – (Junquera; Carneiro)
Capítulo 2
Estudo morfológico imediato das células: estuda-se células vivas a fresco (sem coloração) ou com coloração vital.
Estudo morfológico mediato das células: estudam-se as células mortas e em laminas permanentes através da seguinte ordem: fixação, inclusão, microtomia, coloração e montagem.
Lâminas fixadas: Um preparado permanente ideal deveria mostrar as células com a mesma estrutura microscópica e composição química que possuíam quando vivas, mas isso não é possível devido aos procedimentos que devem ser seguidos para a preparação da lâmina.
1º Procedimento: Fixação: possui como finalidade evitar a autólise (destruição da célula por suas próprias enzimas), impedir a atividade e proliferação de bactérias, endurecer as células para uma melhor resistência aos outros procedimentos e aumentar a afinidade das estruturas pelos corantes utilizados.
Os fixadores utilizados costumam apresentar além das qualidades desejáveis uma série de deficiências e por isso são utilizados em conjunto para que o dano à célula seja o menor possível. Alguns dos químicos mais utilizados são o formol, glutaraldeido e o tetróxido de ósmio, e os físicos podem ser através do calor, dessecação e congelamento. 
2º Procedimento: Inclusão: possui como função envolver e penetrar o fragmento biológico endurecendo-o e facilitando o corte.
3º Procedimento: Microtomia: para a observação das células é necessário que nela se faça uma série de cortes. Para isso, após ser incluída em parafina ou resinas plásticas, devem ser levadas a um aparelho chamado micrótomo, que efetuará cortes de 1 a 6 micrometros de espessura.
4º Procedimento: Coloração: pelo fato de a maioria das organelas celulares serem transparentes deve haver uma prévia coloração da célula antes do término da lamina para que se possa distinguir componentes celulares com índice de refração muito próximos. Para isso devem-se usar corantes ácidos para a coloração de estruturas acidófilas (ricas em agrupamentos básicos que possuem afinidade com corantes ácidos) e corantes básicos para estruturas basófilas (ricas em agrupamentos ácidos que possuem afinidade com corantes básicos).
5º Procedimento: Montagem: possui como função encerrar o corte entre a lamina e a lamínula a fim de obter uma preparação permanente e transparente.
Microscópio ótico: composto por uma parte mecânica (suporte) e uma parte ótica (três sistemas de lentes: condensador, objetiva e ocular). O condensador possui como finalidade projetar um cone de luz no material examinado, a objetiva efetua o aumento a imagem e projeta-a na ocular que por sua vez aumenta-a novamente e leva a imagem a nossa retina.
A capacidade de separar detalhes no microscópio é chamada de poder de resolução e por sua vez o poder de resolução é expresso pelo limite de resolução que é a menor distancia que deve existir entre dois pontos para que eles apareçam individualizados. 
Concluímos assim que quanto menor o poder de resolução de um M.O. melhor será sua reproduçã já que menor será a distancia que dois pontos deverão ter para que sejam exatamente dois pontos e não um só.
O limite de resolução depende exclusivamente da objetiva, da abertura numérica da mesma e do comprimento de onda da luz utilizada segundo a seguinte equação:
Onde k é uma constante de valor entre 0,5 e 0,61 e NA é a abertura numérica da objetiva. 
Microscópio de polarização: é parecido com o microscópio ótico com a única diferença de possuir dois prismas polares, um polarizador e um analisador. São observadas nesse microscópio apenas as estruturas celulares chamadas anisotrópicas ou birrefringentes que dividem o feixe polarizado em dois, sendo o primeiro absorvido pelo analisador e o segundo pela ocular. Nas estruturas isotrópicas o único feixe polarizado é diretamente absorvido pelo analisador e não chega à ocular.
Microscópio de Contraste de Fase: possui um sistema óptico que transforma diferenças de fase dos raios luminosos em diferenças de intensidade tornando possível a análise de estruturas que não seriam visíveis sem o uso do corante. É empregado principalmente na observação de células vivas sendo de grande utilidade na observação de células cultivadas, pois permite o acompanhamento do crescimento sem empregos de corantes que poderiam matar as células.
Microscópio Confocal: neste microscópio a imagem é formada por um delgado feixe de raios laser que varre o corte iluminando apenas um determinado plano da célula resolvendo o problema do microscópio óptico comum que causa borrões nos planos da célula que não estão sendo observados (botão micrométrico acionado). A imagem obtida dos diversos planos pode ser salva e depois utilizada para a criação de uma imagem tridimensional, cálculos de comprimento, área e volume. 
Microscópio Eletrônico: ao invés de feixes de luz ou a laser aqui são utilizados feixes de elétrons retirados de um filamento e tungstênio – o cátodo – e são acelerados devido á diferença de potencial entre o cátodo e o ânodo – placa perfurada no centro. O feixe de elétrons passa por uma bobina condensadora que o dirige diretamente para o objeto. Em seguida passam por outra bobina que corresponderia à objetiva do microscópio ótico. Por fim a terceira bobina projeta os elétrons sobre uma tela fluorescente para a observação.
O trajeto dos elétrons deve ser feito no vácuo para que não haja choque entre eles e os átomos do ar. Devido a essa condição todos os materiais observados devem estar mortos e fixados. A preparação destas lâminas de fixação é mais complexa que nos outros microscópios.
Em primeiro lugar efetuam-se cortes em um micrótomo especial devido á finura do corte a ser obtido. Em seguida desidrata-se o material e leva-o a uma coloração com glutaraldeido, passando depois pelo tetróxido de ósmio sendo possível também um tratamento com outros metais para o aumento do contraste. A utilização de metais para o contraste é conhecida como coloração positiva.
A coloração negativa se dá pela utilização de corantes que desciam elétrons sendo que a figura aparece clara envolta por uma capa escura eletrodensa que no caso seria o corante depositado.
Há também a técnica de sombreamento onde um metal (geralmente ouro, cromo ou urânio) é pulverizado no material segundo certo ângulo e o formato do material aparece em relevo no plano.
Microscópio eletrônico de varredura: a grande vantagem do microscópio eletrônico de varredura para o de transmissão é o fato de não haver a necessidade de se efetuar cortes sendo um material de 1 cm perfeitamente analisado se inteiro. Deve também ser dissecado e fixado devido à presença do feixe de elétrons e consequentemente do vácuo. As imagens não são mais obtidas em filme fotográfico ou projeção e sim pelo computador. O poder de resolução não é tão grande quanto o de transmissão, logo a imagem obtida é pior.
Citoquímica: estuda a localização intracelular das substancias. Para a fixação da lâmina utiliza-se um aparelho chamado histofotômetro ou citofotômetro que permite determinar a intensidade da cor produzida dosando a quantidade de matéria utilizada. Para cada substancia que se quer observar há um procedimento diferente de preparo.
DNA: reação de Feulgen. A técnica consiste no mergulho da lâmina em uma solução aquecida de HCl o que causa a hidrólise da bases púricas mantendo as extremidades de radicais aldeídicos livres para se combinar com o reativo de Schiff que será tratado o material na segunda etapa. O reativo de Schiff ao se combinas com as extremidades do DNA dá uma coloração vermelha ao conjunto.
Como se utiliza a técnica do histofotômetro é possível determinar a quantidade de DNA presente na célula e com isso percebeu-se que essa quantidade é estável de espécie para espécie e se duplica na interfase.
RNA: para a observação há a necessidade do preparo de duas lâminas. A primeira é tratada com a enzima ribonuclease que digere o RNA. Em seguida as duas lâminas são tratadas com um corante básico. O RNA será a estrutura corada que aparecerapenas na lâmina que não foi tratada com a ribonuclease sendo os outros compostos comuns ás duas matérias que não interessam ao estudo.
Catecolaminas: são tratadas com formaldeído originando um composto fluorescente. Pode-se assim observar a localização das catecolaminas adrenalina e noradrenalina.
Proteínas: para a preparação da lamina de proteínas há a complicação de todas as proteínas serem formadas basicamente pelos mesmos aminoácidos. Para isso deve-se utilizar um processo diferente se tratando de cada uma das proteínas estudadas.
Polissacarídeos: o procedimento é parecido com o do RNA. Utilizam-se duas lâminas sendo a primeira tratada com a enzima alfa-amilase digerindo o glicogênio. Em seguidas as duas lâminas são tratadas com o ácido periódico que oxida o grupo OH formado grupos aldeídos que reagem com o reativo de Schiff dando uma coloração vermelha à amostra. Por fim faz-se uma comparação sendo o local do polissacarídeo apenas a parte na qual não está presente na lâmina tratada com a enzima.
Enzimas: em grande parte das vezes para impedir que o fixador inative a enzima é necessário utilizar cortes não fixados obtidos por congelação. Se analisarmos uma enzima como as desidrogenases que deslocam o hidrogênio de certos compostos devemos incubar os cortes em uma substancia de tetrazol que reagirá com o hidrogênio deslocado na região depositando um composto colorido no local indicando assim a presença da enzima.
Já para a observação das fosfatases ácidas que hidrolisam ésteres do ácido fosfórico deve-se mergulhado em uma solução contendo glicerofosfato de sódio e nitrato de chumbo com pH 5. A enzima hidrolisa o glicerofosfato formando um precipitado insolúvel e incolor de fosfato de chumbo. Em seguida o corte é tratado com sulfeto de amônia que transforma o precipitado em sulfeto de chumbo, de cor negra.
Microscopia de fluorescência: permite a observação de compostos com caráter fluorescente se excitados com a vitamina B2, A e as porfinas. Pode ser utilizada também com compostos que não possuem caráter fluorescente sendo necessária para isso a utilização de corantes fluorescentes. Sua principal aplicação é na imunocitoquímica.
Imunocitoquímica: permite o estudo da localização intracelular exata de proteínas específicas. São de dois tipos:
Imunocitoquímica direta: obtêm uma proteína X de rato e injeta-se essa proteína em um coelho, por exemplo. O coelho produzirá anticorpos para a proteína exógena. Os anticorpos são coletados e marcados (ou com substâncias fluorescentes ou com peroxidase) e em seguida introduzidos novamente no órgão de onde se conseguiu a proteína X. Os anticorpos marcados atacarão a proteína e poderão ser observados no microscópio (eletrônico ou óptico, depende do tipo de marcação) informando assim a localização da proteína na célula.
Imunocitoquímica indireta: é mais utilizada, pois possui uma sensibilidade maior demonstrando pequenas quantidades de antígeno. Nessa técnica ao invés de utilizarmos o anticorpo marcado utilizaremos um anti-anticorpo. Efetua-se o mesmo processo adquirindo uma proteína X do rato, injetando-a no coelho, obtendo um anticorpo do coelho à proteína X. Em seguida pega-se o anticorpo do coelho e injeta-se em uma cabra obtendo assim o anti-anticorpo do coelho. Esse anti-anticorpo é marcado e introduzido no sistema antígeno-anticorpo formando assim o sistema antígeno-anticorpo-antianticorpo+marcação. Observa-se assim a localização da proteína na célula.
Cromatografia em coluna: técnica de separação de proteínas e ácidos nucléicos. Baseia-se no fato de que quando se faz uma mistura de proteínas (ou ácidos nucléicos) dissolvidas em água passar por uma matriz sólida e porosa a velocidade de migração das diferentes proteínas (ou ácidos nucléicos) varia conforme a interação de cada uma delas com a matriz. Coleta-se cada proteína por vez.
Antes de iniciar o procedimento, deve-se analisar a afinidade da matriz com a molécula e utilizar um solvente que interrompa a afinidade que houver. Essa afinidade pode ser também muito útil na separação de um composto. Os tipos são:
Interação de troca iônica: a matriz é constituída por partículas positivas e partículas negativas e a separação das proteínas depende da carga elétrica na superfície de suas moléculas.
Interação hidrofobia: as partículas da matriz possuem caráter hidrofóbico retardando a passagem das proteínas que também tem caráter hidrofóbico.
Filtração em gel: a matriz atua como peneira na qual as proteínas menores passam com maior rapidez e as maiores são retardadas. 
Interação por afinidade: se pegarmos uma matriz com características antígenas as proteínas anticorpos da misturas serão retardadas e podem ser obtidas depois das outras para o estudo.
Eletroforese em gel de poliacrilamida: essa técnica é utilizada para a observação do tamanho das moléculas de proteína. Primeiro elas são tratadas com uma solução extremamente negativa para que se tornem negativas também. Em seguida suas ligações S-S são rompidas tornando-as com uma forma alonga. Então são colocadas no centro de uma substancia em gel com uma extremidade positiva e outra negativa. A velocidade com que migram para a extremidade positiva (devido ao seu caráter negativo) dependerá exclusivamente do seu tamanho sendo as menores mais rápidas e as maiores mais lentas.
Uma variável do método é a eletroforese bidimensional na qual ocorre em primeiro lugar a separação das partículas por carga e em seguida uma nova deposição no gel para que haja a separação por tamanho evitando assim o aglomerado de mais de uma partícula.
Radioautografia: é utilizada para localizar isótopos radioativos intencionalmente introduzidos nas células para estudo (como por exemplo a utilização do H³ em uma cadeia de DNA, as células marcadas com esse isótopo estavam em divisão durante o intervalo de tempo analisado). A técnica mais utilizada em biologia celular é a técnica da emulsão líquida. Para sua utilização deve-se seguir as seguintes etapas:
Mergulha-se a lâmina contendo as células radioativas em uma emulsão fundida a 45°;
Remove-se com papel absorvente a emulsão do verso da lamina e deixa-se secar à temperatura ambiente;
Colocam-se os preparados em caixas à prova de luz, para o período de exposição, durante o qual a radiação irá atual sobre a emulsão;
Após a exposição, revela-se a emulsão fotográfica;
Em seguida as células são coradas e observadas ao microscópio. Grânulos negros de prata metálica indicarão a radioatividade.
Centrifugação: para a separação de organelas através desse método faz-se a imersão das células em uma solução de sacarose e em seguida faz-se a ruptura da membrana plasmática para a obtenção de um homogeneizado. Durante o processo a maioria das organelas se mantém intacta sendo rompido apenas o Retículo endoplasmático. O isolamento de uma organela através da centrifugação depende do seu coeficiente de sedimentação, ou seja, do seu tamanho, forma e densidade, sendo levada em conta também a densidade e viscosidade do líquido que se encontra.
A técnica mais utilizada é a centrifugação diferencial na qual a velocidade de centrifugação é gradativamente aumentada. As organelas mais densas sedimentam primeiro e o sobrenadante de cada centrifugação passa novamente pelo processo em uma velocidade maior, sendo desse modo as organelas sendo sucessivamente separadas.
Se a cada centrifugação forem obtidos sedimentados mais de um componente deve-se solubilizar novamente o precipitado e submetê-lo novamente à centrifugação. O sobrenadante que permanece após a ultima centrifugação é chamado de porção solúvel.
Outro tipo de centrifugação é a centrifugação contragradiente onde o homogeneizado é colocado sobre um tubo contendo uma substancia com gradiente de concentração crescente de cima para baixo. A amostra é levada à centrifugação e cada organela desce até o ponto onde há equilíbrio entre a força centrífuga da partícula e a concentração do gradiente formando assim faixas diferentes que depois podem ser separadas.
Estudo de células: paraa efetuação do estudo de uma célula viva deve-se colocá-la em um meio isotônico para que não haja modificação em seu volume e utilizar um microscópio de contraste de fase para evitar o uso de corantes ou utilizar corantes vitais que não causam a morte da célula.
Se o interesse é em um estudo mais prolongado costuma-se colocar a célula em um meio de cultivo que possibilita o estudo dos movimentos celulares, da mitose, as ação de diversas substancias sobre as células e da secreção pela célula de produtos que irão acumular-se no meio de cultura.
Esse cultivo permite o estudo dos movimento celulares, proliferação celular, digestão celular, ação de drogas sobre as células, ação de produtos de secreção acumulados no meio, cariótipo, obtenção de vírus, microcirurgia, fertilização in vitro, transferência de embriões e câncer. 
O cultivo em frasco deve conter aminoácidos, glicídios, sais minerais, vitaminas e fatores de crescimento que são proteínas que estimulam a proliferação e diferenciação das células. As culturas primárias são constituídas pelas células iniciais dos animais que morrem após certo número de mitoses.
Porém algumas células podem sofrer mutações e se tornar imortais constituindo as culturas secundárias. Essas células imortais possuem as mesmas características das células cancerígenas podendo crescer sem se aderir à parede do frasco e se reproduzir de forma mais rápida que as células normais. 
Com o avanço no domínio do método de cultivo de células pode-se observar que certos vírus possuem a capacidade de fazer duas células se fundirem tornando-se bi ou multinucleadas que no caso de serem de espécies diferentes são conhecidas como heterocários. Essas células ao se dividiram tornam-se mononucleadas novamente, mas com a diferença de conterem os dois tipos de cromossomos no seu no seu núcleo.
Protoplastos: células veg8etais sem a parede celular.
Células totipotentes: células com capacidade de voltar ao estágio embrionário e dar origem a qualquer outro tipo de célula. Foram observadas que as células vegetais são totipotentes por estar em cultura e depois de certo número de divisões darem origem a pequenos agregados de células indiferenciadas.