Método Lowry

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INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO RIO GRANDE DO SUL – CAMPUS PORTO ALEGRE
CURSO TÉCNICO EM BIOTECNOLOGIA
JOÃO GABRIEL
LEONARDO ALVES
YURI SIQUEIRA
Relatório: Processos Bioquímicos
Aula Prática: Quantificação de proteínas- Método de BiuretoLowry
NOTA 7,5
Professores: Alessandra N. Bruno
Júlio Heck
Letícia Scribel
PORTO ALEGRE – RIO GRANDE DO SUL
2018.
INTRODUÇÃO
Proteína é uma macromolécula composta por uma ou mais cadeias polipeptídicas, cada uma com uma sequência característica de aminoácidos unidos por ligações peptídicas (Nelson e Cox, 2014). As metodologias para a quantificação de proteínas são de grande interesse para diferentes áreas, como indústria de alimentos, indústria farmacêutica, análises clínicas, saúde, meio ambiente, pesquisa científica e controle de qualidade de produtos (Bruno, 2014).
Em que se baseia na espectrofotometria, ou fotocolorimetria, que é uma técnica analítica que permite determinar a concentração das soluções por meio da intensidade de luz absorvida ou transmitidas por elas. Com soluções coloridas, em que a intensidade da luz produzida é proporcional à concentração da substância que está sendo dosada, conseguimos quantificar a concentração de uma dada substância em uma solução. Isso é possível, pois diversas biomoléculas absorvem luz em comprimentos de onda () característicos (Bruno, 2014).
A partir de 1852, Johann Lambert estudou a transmissão de luz por sólidos homogêneos, enquanto August Beer estendeu os estudos para a análise das soluções, resultando na Lei de Lambert-Beer que determina que: “Quando uma faixa de luz monocromática atravessa uma solução colorida, a quantidade de luz absorvida é diretamente proporcional à concentração da solução colorida e à espessura da camada atravessada” (Nelson e Cox, 2011).
E através da fotocolorimetria originou o método de Lowry, que se baseia na redução do reagente de fenol (Folin-Ciocalteu) quando reage com proteínas na presença do catalizador cobre (II) em meio alcalino. Essa reação resulta na produção de um composto de coloração azul e com absorção máxima em 750 nm que possibilita a quantificação espectrofotométrica (Bruno, 2014).
OBJETIVO
Utilizar um método espectrofotométrico de quantificação e determinar a concentração de proteína em uma amostra biológica pelo método de Lowry.
MATERIAIS
- 14 Tubos de ensaio de vidro;
- Proveta de 50 mL;
- 02 Pipetas de vidro de 1 mL;
- 01 Pipeta de vidro de 5 mL;
- 01 Micropipeta de 1000uL (P1000);
- 01 Micropipeta de 200uL (P200);
- Ponteiras;
- Espectrofotômetro;
- Cubetas;
- 600uL de solução padrão de BSA a 5 mg/mL;
- Amostra: leite;
- Reagente A: Previamente preparado (5 g/L de sulfato de cobre e 10 g/L de citrato de sódio);
-Reagente B: Previamente preparado (20 g/L de carbonato de sódio, 4 g/L de hidróxido de sódio);
- Reagente C: 35 mL (2,5 mL em cada tubo X 14 tubos) = preparar no momento do uso. 1 parte do reagente A + 50 partes do reagente B. 
- Reagente D: 3,5 mL (250 μL em cada tubo). Partes iguais de reagente de Folin Ciocaltens 2 N e água. Pode ser estocada já sob esta forma (diluído). 
MÉTODOS
- Pipetar a curva padrão conforme a tabela abaixo (em duplicata).
Curva Padrão
	Tubos
	Concentração (mg/mL)
	Volume de BSA a 5 mg/mL (ug)
	Volume de água (uL)
	Leituras (Absorbância)
	Branco
	0,0
	0
	1000
	0,000
	1
	0,1
	20
	980
	0,108
	0,127
	2
	0,2
	40
	960
	0,173
	0,175
	3
	0,3
	60
	940
	0,229
	0,236
	4
	0,4
	80
	920
	0,332
	0,322
	5
	0,5
	100
	900
	0,396
	0,416
Quantificação de Proteínas na Amostra
	Tubos
	Concentração (mg/mL)
	Volume de BSA a 5 mg/mL (ug)
	Volume de água (uL)
	Leituras (Absorbância)
	Amostra
	0,312
	500
	500
	0,256
	0,289
- Prepare a amostra a ser quantificada. A amostra (leite) deve ser diluída de forma que a sua concentração fique dentro da amplitude da curva padrão (0,1 – 0,5 mg/mL). Para este procedimento o leite deverá ser diluído 80x. Faça os cálculos para realizar esta diluição, sendo que o volume final da amostra deverá ser de 5,0 mL. 
- Pipete as amostras adequadamente diluídas a serem quantificadas conforme a tabela abaixo (em duplicata).
- Preparar o Reagente C: 1 parte do reagente A + 50 partes do reagente B (35 mL por grupo). 
- Adicionar 2,5 mL do reagente C em cada tubo de ensaio.
- Incubar por 5 minutos à temperatura ambiente. 
- Adicionar 250 μL do reagente D (Reagente de Folin-Ciocaltens 1:1) e aguardar 30 minutos à temperatura ambiente e no escuro (reagente usado é fotossensível). 
- Ler a absorbância em espectrofotômetro a 750 nm. 
- Calcular o fato de calibração médio a partir da curva padrão (FC= C/ ABS).
- Calcular a concentração de proteína nos tubos contendo a amostra (C= FCM X ABS).
ANEXO
No ícone abaixo está anexado o protocolo da disciplina de Processos Bioquímicos da seguinte aula prática Quantificação de proteínas - Método de Lowry.
RESULTADOS
Dados de absorbância da proteína BSA 5mg/ml obtidos no espectrometria pelo método Lowry; média de duplicatas:
Abs.1 = (0,108 + 0,127) / 2 = 0,117
Abs.2 = (0,173 + 0,175) / 2 = 0,174
Abs.3 = (0,229 + 0,236) / 2 = 0,232
Abs.4 = (0,332 + 0,332) / 2 = 0,332
Abs.5 = (0,396 + 0,416) / 2 = 0,406
Tabela 1
	Curva Padrão de absorbância de BSA 5mg/ml pelo método de Lowry
	Tubos
	Concentração (mg/mL)
	Volume de BSA a 5 mg/mL (ug)
	Volume de água (uL)
	Leituras (Absorbância)
	Branco
	0,0
	0
	1000
	0,000
	1
	0,1
	20
	980
	0,108
	0,127
	2
	0,2
	40
	960
	0,173
	0,175
	3
	0,3
	60
	940
	0,229
	0,236
	4
	0,4
	80
	920
	0,332
	0,322
	5
	0,5
	100
	900
	0,396
	0,416
Gráfico 1
Gráfico: Curva padrão de quantificação de proteína padrão; BSA (Proteínas Albumina do Soro Bovino) a 5mg/ml, pelo método de Lowry. Comprimento de onda a 750nm.	Comment by leticiascribel: Na verdade foram feitas diluições para as concentrações de cada ponto da curva padrão
A partir dos dados experimentais podemos obter, de cada ponto da curva do gráfico, o FC (Fator de calibração): Valor determinado pelo seguinte cálculo; (FC = Q/A), onde “Q” é o volume, da média das duplicatas, de BSA a 5 mg/ml; e “A” é o índice de Absorbância. E o Fator de Calibração Médio, expresso como, FCM = (FC1+FC2+FC3+FC4) / 4. Cálculos abaixo: 	Comment by leticiascribel: Concentração!!	Comment by leticiascribel: ??
FC1 = 0,1 / 0,117 = 0,855 mg/mL
FC2 = 0,2 / 0,174 = 1,149 mg/mL
FC3 = 0,3 / 0,232 = 1,293 mg/mL
FC4 = 0,4 / 0,332 = 1,205 mg/mL
FC5 = 0,5 / 0,406 = 1,231 mg/mL
FCM = (0,855 + 1,149 + 1,293 + 1,205 + 1,231) / 5 = 1,147 mg/mL
Tabela 2
	Quantificação de proteína na amostra
	Tubos
	Concentração (mg/mL)
	Volume de BSA a 5 mg/mL (ug)
	Volume de água (uL)
	Leituras (Absorbância)
	Amostra
	0,312
	500
	500
	0,256
	0,289
	Por meio dos dados obtidos com os pontos da curva padrão, quantificamos a solução proteica, segue os cálculos:
Abs amostra = (0,256 + 0,289) / 2 = 0,272
[ ]amostra = 0,272 × 1,147 = 0,312 mg/ml
O valor da amostra é, 0,272 x 80 = 21,76. Devido a diluição de oitenta vezes de um dos componentes da solução, o leito.
DISCUSSÕES E CONCLUSÃO
Preparamos a amostra de leite para ser quantificada. Fizemos a diluição da amostra em 80 vezes. Sendo o volume final de 5,0 mL, e o volume do leite de 0,625 ul (50 / 80 = 0,625).	Comment by leticiascribel: Isso não é uma discussão, é apenas a descrição do que foi realizado
Preparamos o Reagente C: 1 parte do reagente A e 50 partes do reagente B; sendo o volume final de 35ml. Reagente A: (35 / 50 = 0,7 ml > 700). Reagente B: (35 – 0,7 = 34,3 ml). E adicionar 2,5 mL do reagente C em cada tubo de ensaio. Incubamos por 5 minutos à temperatura ambiente. Adicionamos 250 ul do reagente Folin-Ciocaltens 1:1 e aguardamos 30 minutos à temperatura ambiente e no escuro.
	Obtivemos os valores por meio do espectrofotômetro. Calculamos os fatores de calibração (FC= C/ ABS), e o com os resultados calculamos o fator de calibração médio (FCM):(C= FCM X ABS).
	No método de Lowry, em meio alcalino, a proteína reage com o cobre formando um complexo com capacidade de reduzir o agente Fenol (Folin–Ciocalteau) obtendo um composto azulado. É a cor azul que possibilita a quantificação da amostra em espectrofotometria, no comprimento de onda especifico de 750nm. O método é padronizado utilizando uma proteína pura conhecida, nesse caso usamos BSA a 5mg/ml.	Comment by leticiascribel: Isso também não é discussão, é a descrição do método que cabe estar na introdução
Para cada amostra usamos duplicatas, e o valor de cada amostra se assemelha, em muito, a sua respectiva duplicata. Não ocorreram contaminações ou erro de medição.	Comment by leticiascribel: Discutir... isso é reprodutibilidade! E o resulatdo da amostra, é confiável a partir da curva padrão obtida? Como ficou a curva padrão? Isso é o que vcs devem discutir ;)
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Nelson e Cox. Princípios da Bioquímica de Lehninger. Porto Alegre: Artmed, 2011.
Nelson e Cox. Princípios da Bioquímica de Lehninger. Porto Alegre: Artmed, 2014.
Bruno. Biotecnologia I: Princípios e Métodos. Porto Alegre: Artmed, 2014.
�Nome: Data:
PRÁTICA: QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS EM ESPECTROFOTÔMETRO - MÉTODO DE LOWRY 
Material POR GRUPO incluindo a curva padrão:
- 14 tubos de vidro (11 tubos da curva + 3 tubos da quantificação).
- Proveta de 50mL.
- Pipetas de vidro (1 de 1mL para água/ 1 de 1mL para o leite/ 1 de 5mL para o reagente C ). 
- 1 Micropipeta de 1mL + ponteiras grandes para o reagente D/ 1 Micropipeta de 40-200uL + ponteiras pequenas para a albumina-curva.
- Solução padrão de BSA a 5 mg/mL. 600uL por grupo.
- Amostra: leite.
- Reagente A: Previamente preparado (5 g/L de sulfato de cobre e 10 g/L de citrato de sódio). 
-Reagente B: Previamente preparado (20 g/L de carbonato de sódio, 4 g/L de hidróxido de sódio). 
- Reagente C: 35 mL (2,5 mL em cada tubo X 14 tubos) = Preparar no momento do uso. 1 parte do reagente A + 50 partes do reagente B. 
- Reagente D: 3,5 mL (250 μL em cada tubo). Partes iguais de reagente de Folin Ciocaltens 2 N e água. Pode ser estocada já sob esta forma (diluído). 
- Espectofotômetro
Introdução: 
Existe uma variedade de métodos para determinação da concentração de proteína em de uma amostra. Todos os métodos usados devem ser padronizados com uma proteína pura conhecida (Ex: albumina de soro bovina). No caso do método de Lowry (1951), em meio alcalino, a proteína reage com o cobre formando um complexo com capacidade de reduzir o reagente de Fenol (Folin – Ciocalteau) obtendo-se um composto de cor azul intensa. Esta coloração possibilita a quantificação espectrofotométrica. 
Objetivos: 
- Utilizar um método espectrofotométrico de quantificação, 
- Determinar a concentração de proteína em uma amostra biológica pelo método de Lowry. 
Procedimento: 
- Pipetar a curva padrão conforme a tabela abaixo (em duplicata).
- Prepare a amostra a ser quantificada. A amostra (leite) deve ser diluída de forma que a sua concentração fique dentro da amplitude da curva padrão (0,1 – 0,5 mg/mL). Para este procedimento o leite deverá ser diluído 80x. Faça os cálculos para realizar esta diluição, sendo que o volume final da amostra deverá ser de 5,0 mL. 
- Pipete as amostras adequadamente diluídas a serem quantificadas conforme a tabela abaixo (em duplicata).
- Preparar o Reagente C: 1 parte do reagente A + 50 partes do reagente B (35 mL por grupo). 
- Adicionar 2,5 mL do reagente C em cada tubo de ensaio.
- Incubar por 5 minutos à temperatura ambiente. 
- Adicionar 250 μL do reagente D (Reagente de Folin-Ciocaltens 1:1) e aguardar 30 minutos à temperatura ambiente e no escuro (reagente usado é fotossensível). 
- Ler a absorbância em espectrofotômetro a 750 nm. 
- Calcular o fato de calibração médio a partir da curva padrão (FC= C/ ABS).
- Calcular a concentração de proteína nos tubos contendo a amostra (C= FCM X ABS).
	Curva Padrão
	Tubos
	Concentração (mg/mL)
	Volume de BSA a 5 mg/mL (μL)
	Volume de Água (μL)
	Leituras (Abs)
	B
	0
	0
	1000
	
	1
	0,1
	20
	980
	
	2
	0,2
	40
	960
	
	3
	0,3
	60
	940
	
	4
	0,4
	80
	920
	
	5
	0,5
	100
	900
	
	
Quantificação de proteínas na amostra
	Tubos
	Concentração (mg/mL)
	Volume de amostra (μL)
	Volume de Água (μL)
	Leituras (Abs)
	
Amostra
	
	500 μL
	500 μL
	
	
	
	500 μL
	500 μL