ITA02003 poligrafo 2005 1 parte 2

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL 
INSTITUTO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS 
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
ITA02003 
BIOENGENHARIA PARA ENGENHARIA QUÍMICA 
- POLÍGRAFO - 
 
Profa Rosane Rech 
 
 
 
 
 
 
 
 
Semestre 2005/1 
 
ITA02003 – Bioengenharia para Engenharia Química Profa. Rosane Rech 
Semestre 2005/1 ii 
 
Índice 
 
12 Esterilização .......................................................................................................................................52 
12.1 Modos de atuação dos agentes esterilizantes..................................................................................52 
12.2 Esterilização de equipamentos e meios de cultivo por calor úmido ...............................................54 
12.2.1 Cinética de morte celular ........................................................................................................54 
12.2.2 Esterilização em batelada de meios de cultivo .......................................................................54 
12.2.3 Esterilização contínua de meios de cultivo.............................................................................56 
13 Elementos de genética ........................................................................................................................59 
13.1 Nucleotídeos e ácidos nucléicos .....................................................................................................59 
13.2 Ácidos nucléicos - DNA e RNA.....................................................................................................59 
13.2.1 DNA .......................................................................................................................................60 
13.2.2 RNA........................................................................................................................................63 
13.2.3 Processo de “construção” de proteínas nas células.................................................................63 
13.3 Regulação gênica............................................................................................................................65 
13.4 Organização do genoma de procariotos:.........................................................................................67 
13.5 Genética de microrganismos...........................................................................................................68 
13.5.1 Mutação ..................................................................................................................................68 
13.6 Herança extracromossômica em microrganismos – plasmídeos.....................................................70 
13.6.1 Conjugação .............................................................................................................................71 
13.6.2 Funções de partição ................................................................................................................72 
14 Elementos de engenharia genética – cultivo de microrganismos recombinantes ...............................73 
14.1 Enzimas de restrição.......................................................................................................................73 
14.2 Vetores genéticos............................................................................................................................74 
14.3 Hospedeiros para DNA recombinante ............................................................................................74 
 
 
ITA02003 – Bioengenharia para Engenharia Química Profa. Rosane Rech 
Semestre 2005/1 iii 
 
Lista de Figuras 
 
Figura 12.1:Perfil típico de temperatura do meio de cultivo e evolução da morte celular em uma 
esterilização em batelada (Fonte: Doran, 1997). ....................................................................................55 
Figura 12.2: Curvas de aquecimento e resfriamento em uma esterilização em batelada. .............................56 
Figura 12.3: Equipamentos para esterilização contínua: (a) injeção direta de vapor com resfriamento flash; 
(b) transferência de calor utilizando trocadores de calor........................................................................57 
Figura 12.4: Curvas de aquecimento, manutenção da temperatura e resfriamento durante uma esterilização 
contínua: (a) injeção direta de vapor com resfriamento flash; (b) transferência de calor utilizando 
trocadores de calor..................................................................................................................................57 
Figura 12.5: Trocador de calor de placas (Fonte: Dairy Processing Handbook, 1995). ...............................57 
Figura 12.6: Trocadores de calor de tubulares (Fonte: Dairy Processing Handbook, 1995). .......................58 
Figura 13.1: Representação esquemática de um nucleotídeo........................................................................59 
Figura 13.2: Bases nitrogenadas. ..................................................................................................................59 
Figura 13.3: Polímeros de DNA e RNA. ......................................................................................................60 
Figura 13.4: Estrutura dupla-hélice em formato helicoidal do DNA. ...........................................................61 
Figura 13.5: Ligações A-T e C-G do DNA...................................................................................................61 
Figura 13.6: Dupliação de uma dupla-fita de DNA. .....................................................................................62 
Figura 13.7: Duplicação do DNA com a enzima DNApolimerase. ..............................................................62 
Figura 13.8: Transcrição do DNA para RNA pela RNApolimerase. ............................................................63 
Figura 13.9: Processo de transcrição do DNA em RNA e de tradução do mRNA em proteínas pelos 
ribossomos..............................................................................................................................................64 
Figura 13.10: Transcrição do DNA para RNA e tradução do mRNA para proteína.....................................64 
Figura 13.11: Pontos de regulação gênica nos organismos vivos. ................................................................65 
Figura 13.12: Regulação gênica positiva e negativa com sinal molecular que provoca a ligação ou o 
desligamento de uma proteína regulatória no operador..........................................................................66 
Figura 13.13: Representação esquemática da organização dos genes bacterianos em operons. ...................67 
Figura 13.14: Regulação negativa do operon lac..........................................................................................67 
Figura 13.15: Regulação positiva do operon lac...........................................................................................68 
Figura 13.16: Representação esquemática de mutações por deleção e por inversão. ...................................69 
Figura 13.17: Representação esquemática de mutação por radiação ultravioletra........................................70 
Figura 13.18: Representação esquemática do plasmídeo pBR322................................................................71 
Figura 13.19: Conjugação de um plasmídeo R entre duas bactérias. ............................................................72 
Figura 13.20: Partição de plasmídeos nas células-filhas. ..............................................................................72 
Figura 14.1: Representação esquemática da construção de uma célula bacteriana geneticamente modificada.
..................................................................................................................................................................73Lista de Tabelas 
Tabela 14.1: Exemplos de enzimas de restrição............................................................................................74 
 
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Semestre 2005/1 52 
 
12 Esterilização 
 
Em muitos bioprocessos, a presença de microrganismos estranhos, genericamente denominados 
contaminantes, pode levar a prejuízos consideráveis. O grau de eliminação de contaminantes com o objetivo 
de obter bons resultados depende de cada caso. 
Em um processo podem ou devem ser esterilizados os equipamentos (biorreatores, tubulações, 
bombas, centrífugas, homogeneizadores, etc.), os meios de cultivo, o ar que entra nos biorreatores e as 
embalagens finais. 
A esterilização engloba todos os procedimentos físicos, mecânicos e químicos utilizados para 
destruir microrganismos contaminantes. 
Os métodos químicos englobam o uso de óxido de etileno, aldeídos, gás-plasma de peróxido de 
hidrogênio. Os métodos físicos compreendem a utilização de calor e radiações. Ainda podem ser utilizados 
agentes esterilizantes e desinfetantes. 
Terminologia: 
Esterilização: é um processo físico ou químico que destrói ou inativa todas as formas de vida 
presentes em um determinado material através de agentes físicos. 
Desinfecção: é um processo menos rigoroso de eliminação de microrganismos, objetivando 
sobretudo a destruição dos microrganismos patogênicos presentes, envolvendo normalmente o uso de um 
agente químico, à temperatura ambiente ou moderada. 
Antisséptico: substância que impede a proliferação de bactérias através da inativação ou destruição 
das mesmas . 
Assepsia: conjunto de métodos utilizados com o intuito de impedir a entrada de microrganismos 
em local que não os contenha . 
12.1 Modos de atuação dos agentes esterilizantes 
Calor úmido: 
A temperatura elevada associada com alto grau de umidade provoca a desnaturação das proteínas. 
Os carboidratos do meio de cultivo também sofrem alterações, muitas vezes gerando produtos tóxicos. 
O calor úmido possui alta penetração, destruindo esporos e bactérias em tempos bastante curtos. É 
também econômico e não deixa resíduos tóxicos. Contudo não pode ser utilizado em soluções que formam 
emulsões com a água e possui ação corrosiva sobre alguns metais. 
A esterilização de biorreatores via calor úmido normalmente ocorre via injeção de vapor no 
equipamento. A esterilização normalmente é realizada a 121oC e 1 atm em tempos que variam entre 20 
minutos a mais de 1 hora conforme a necessidade. 
Calor seco: 
Destrói microrganismos através da oxidação de seus constituintes químicos. É utilizado para 
vidrarias, metais e sólidos resistentes ao calor. Ocorre em fornos ou estufas que atingem temperaturas 
maiores do que 150oC. Contudo, a ausência de umidade torna a transferência de calor mais lenta e os 
microrganismos mais resistentes. Desta forma o calor seco necessita de tempos mais longos para atingir o 
grau de esterilização desejado, cerca de 3 a 4 horas. 
 
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Radiação ultravioleta (UV): 
Os efeitos letais estão associados à mutagênese através de transformações fotoquímicas nas bases 
de pirimidinas no DNA. A reação principal é a formação de ligações cruzadas entre purinas adjacentes. 
Também ocorrem dímeros citosina-timina, citosina-citosina e uracila-uracila (RNA). É produzida por 
lâmpadas emissoras de radiação UV. Devido à sua baixa penetração somente é utilizada para a esterilização 
de superfícies e do ar. O tempo de exposição necessário é da ordem de horas. 
Radiação ionizante: 
São as radiações alfa (α), beta (β), gama (γ), raios X, raios catódicos, além de prótons, nêutrons e 
elétrons de alta energia. Estas radiações podem produzir radicais químicos altamente reativos, como 
peróxidos e radicais livres, os quais podem alterar grupos químicos e até quebrar fitas de DNA. Dentre estas 
a radiação gama é a mais importante. 
A radiação gama em geral é produzida por cobalto 60 ou césio 137, e possui um poder de 
penetração extremamente alto. Os materiais expostos à radiação gama não guardam nenhum resquício 
radioativo, tornando a irradiação um método seguro. 
O bombardeio com radiação gama é realizados em câmaras especiais que uma vez postas em 
operação, não é mais possível impedir a emissão de radiação, de forma que estas câmaras operam de forma 
contínua. Materiais como vidrarias, metais, alimentos, sementes, solo, pós, embalagens podem ser 
submetidos à este tipo de esterilização. 
Plasma de peróxido de hidrogênio: 
O plasma, considerado um quarto estado da matéria, é definido como uma nuvem de íons, elétrons 
e partículas neutras, altamente reativas. A geração de um campo eletromagnético pela energia de 
radiofreqüência produz a formação do plasma. Os radicais livres gerados no plasma de peróxido de 
hidrogênio apresentam-se com cargas negativas e positivas, que excitados tendem a se reorganizar, 
interagindo com moléculas essenciais ao metabolismo e reprodução microbianos, ligando-se de maneira 
específica às enzimas, fosfolipídeos, DNA e RNA. Essa reação química é extremamente rápida, viabilizando 
o processo de esterilização em curto espaço de tempo. 
É indicado para esterilização de artigos termossensíveis. O ciclo de esterilização ocorre em torno de 
1 hora. É compatível com a maioria dos metais, plásticos, vidros, borrachas, acrílicos e incompatível com 
celulose e ferro. O produto final é água e oxigênio, não oferecendo portanto toxicidade para os profissionais 
e clientes. 
Óxido de etileno (EtO): 
É um éter cíclico que reage substituindo um átomo de H de grupos funcionais de proteínas, ácidos 
nucléicos e outras moléculas (radicais carboxil, amino ou sulfidril) pela molécula de EtO aberta (CH2CH2O-). 
Esta reação causa a inativação destas moléculas. O óxido de etileno é um gás inodoro, sem cor, inflamável e 
explosivo. A adição de estabilizantes como dióxido de cloro ou clorofluorocarbonado reduz o risco de 
explosão e de fogo. Vantagens: podem ser esterilizados materiais sem danificá-los. Desvantagens: alto custo, 
toxicidade, e tempo longo do ciclo. 
Glutaraldeído: 
O glutaraldeído reage como os grupamentos amina livres da camada de peptidioglicano na 
superfície das células, onde ocorrem reações glutaraldeído-proteínas, o que interfere no transporte de 
aminoácidos de baixo peso molecular. Em alguns microrganismos ocorre a aglutinação celular, devido à 
formação de ligações intercelulares. É indicado para desinfecção em alto nível em artigos termossensíveis 
com tempo de exposição de 30 minutos em solução a 2%. Também é indicado como esterilizante, com o 
tempo de exposição entre 8 e 10h. O produto sofre alterações em temperaturas superiores a 25°C. É tóxico, 
não biodegradável, portanto deve ser manipulado em local ventilado e com uso de EPI. 
 
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Formaldeído: 
Formaldeído é um monoaldeído que existe como um gás solúvel em água. Embora tenha sido usado 
durante muitos anos, seu uso foi reduzido com o aparecimento do glutaraldeído. Suas desvantagens 
principais estavam relacionadas a menor rapidez de ação e carcinogenicidade. Embora tido como 
carcinogênico, isto foi demonstrado a altas doses de exposição. 
Ação: ativo apenas na presença de umidade para formação do grupo metanol. Interage com 
proteínas, DNA e RNA. No entanto é difícil especificar acuradamente seu modo de ação na inativação 
bacteriana. Possui amplo espectro de ação, inclusive contra esporos. 
Tem o mesmo mecanismo de ação semelhante ao do glutaraldeído. É pouco ativo a temperaturas 
inferiores a 20°C, aumentando a atividade em temperaturas superiores a 40°C. Em processo de desinfecção 
ou esterilização possui desvantagens,pois tem baixo poder de penetração, distribuição não uniforme e alta 
toxicidade que restringem o seu uso. O tempo de exposição deve seguir orientações do fabricante: para 
desinfecção utiliza-se solução 4% volume-volume (v/v) por trinta minutos. Para esterilização, tanto na 
solução alcoólica a 8%, quanto para a solução aquosa a 10%, o tempo mínimo é de 18 horas. 
Álcoois: 
Agem por desnaturação das proteínas dos microrganismos e sua ação bactericida aumenta quando 
hidratado. Possuem ação bactericida, fungicida e viruscida, porém não destroem esporos bacterianos. 
Álcool isopropílico: tem ação seletiva para vírus, é mais tóxico e com menor poder germicida que o 
álcool etílico. 
Álcool etílico (70%): a concentração 77% (v/v) que corresponde a 70% em peso, tem baixa 
toxicidade, é indicado para desinfecção de nível intermediário ou médio. Deve ser utilizado por fricção, em 
três aplicações, com secagem espontânea e tempo total de exposição de 10 minutos. 
Compostos liberadores de cloro ativo: 
Hipoclorito de sódio/cálcio/lítio: Produto instável, termossensível, fotossensível e inativado 
rapidamente em presença de matéria orgânica, o que diminui sua atividade rapidamente em recipientes claros 
ou em altas temperaturas. Por ser corrosivo seu uso é contra-indicado em artigos metálicos. 
Efeitos adversos: os compostos inorgânicos liberadores de cloro ativo são tóxicos, irritantes de 
pele, mucosa e árvore respiratória. 
Ácido Peracético: 
É bactericida, fungicida, viruscida e esporicida. Promove a desnaturação de proteínas e alteração na 
permeabilidade da parede celular. Possui como vantagens manter-se efetivo em presença de matéria orgânica 
e não promover a formação de resíduos tóxicos. Como desvantagens: é corrosivo e instável após diluído. O 
ácido peracético ou peroxiacético, em baixas concentrações (0,001% a 0,02%) apresenta rápida ação contra 
os microorganismos, incluindo os esporos. 
12.2 Esterilização de equipamentos e meios de cultivo por calor úmido 
12.2.1 Cinética de morte celular 
12.2.2 Esterilização em batelada de meios de cultivo 
O meio de cultivo é colocado dentro do biorreator e aquecido à seguir. Deste modo o meio de 
cultivo e o biorreator são esterilizados simultaneamente. 
Formas de aquecimento: 
- vapor passando por uma camisa ou serpentina de aquecimento 
- injeção direta de vapor 
- aquecimento elétrico do meio dentro do biorreator. 
 
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Perfil típico de temperatura (Figura 12.1): 
- aquecimento: duração de horas 
- manutenção da temperatura: duração de minutos 
- resfriamento: duração de horas 
 
 
Figura 12.1:Perfil típico de temperatura do meio de cultivo e evolução da morte celular em uma 
esterilização em batelada (Fonte: Doran, 1997). 
 
O cálculo de um processo de esterilização consiste em calcular o tempo de manutenção necessário 
para atingir um determinado nível de destruição celular. 
Esterilização absoluta ? tempo infinito 
Desta forma trabalha-se com probabilidade de contaminação. Por exemplo: Nf = 10-3 significa o 
risco de sobrevivência de 1 microrganismo em cada 1000 bateladas esterilizadas. 
Curvas de aquecimento conforme o método de aquecimento: 
a) injeção direta de vapor (curva hiperbólica, Figura 12.2): 
⎟⎟
⎟⎟
⎟
⎠
⎞
⎜⎜
⎜⎜
⎜
⎝
⎛
+
+=
t
M
M
TCM
tMh
TT
m
s
pm
s
&
&
1
1 00 (12.1) 
b) aquecimento elétrico (curva linear, Figura 12.2): 
⎟⎟⎠
⎞
⎜⎜⎝
⎛ +=
0
0 1 TCM
QtTT
pm
 (12.2) 
c) trocador de calor com vapor isotérmico (curva exponencial, Figura 12.2): 
⎟⎟⎠
⎞
⎜⎜⎝
⎛ −+=
−
pmCM
UAt
s
s
s eT
TTTT 01 (12.3) 
d) resfriamento com passagem de água não isotérmica (Figura 12.2): 
 
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⎟⎟
⎟⎟
⎟
⎠
⎞
⎜⎜
⎜⎜
⎜
⎝
⎛
−+= ⎥
⎥⎥
⎥
⎦
⎤
⎢⎢
⎢⎢
⎣
⎡
⎟⎟
⎟⎟
⎠
⎞
⎜⎜
⎜⎜
⎝
⎛
−⎟⎟⎠
⎞
⎜⎜⎝
⎛ − ⎥⎥⎦
⎤
⎢⎢⎣
⎡ −
pwCwM
UA
pm
pww e
CM
tCM
ci
ci
ci eT
TTTT
&&
1
01 (12.4) 
onde: 
A = área de transferência de calor; 
Cp = calor específico do meio de cultivo; 
Cpw = calor específico da água; 
h = diferença específica de entalpia entre o vapor e o meio; 
Mm = massa inicial de meio de cultivo ; 
sM& = vazão mássica de vapor; 
wM& = vazão mássica de água; 
Q = velocidade de transferência de calor; 
T = temperatura; 
T0 = temperatura inicial do meio de cultivo; 
Tci = temperatura inicial da água de resfriamento; 
Ts = temperatura do vapor; 
t = tempo; 
U = coeficiente global de transferência de calor. 
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4 5 6 7 8
tempo (horas)
te
m
pe
ra
tu
ra
 (o
C
)
injeção direta de vapor
aquecimento elétrico
transferência de calor de vapor isotérmico
resfriamento
 
manutenção da temperatura
Figura 12.2: Curvas de aquecimento e resfriamento em uma esterilização em batelada. 
 
12.2.3 Esterilização contínua de meios de cultivo 
Na esterilização contínua de meios de cultivo consegue-se trabalhar com processos de alta 
temperatura e tempo de exposição curtos, o que reduz significativamente a destruição de componentes do 
meio de cultivo, e levando a um alto grau de destruição de microrganismos. Entre as vantagens da 
esterilização contínua em relação à esterilização em batelada estão a economia de vapor (a esterilização 
contínua consome entre 20% e 25% do vapor consumido pelo processo em batelada) e o tempo reduzido de 
processo, pois o aquecimento e o resfriamento são quase instantâneos. As Figuras 12.3 e 12.4 mostram 
configurações típicas de equipamentos de esterilização contínua e os seus respectivos perfis de temperatura, e 
as Figuras 12.5 e 12.6 mostram trocadores de calor de placa e tubulares, respectivamente, utilizados para o 
aquecimento e o resfriamento dos meios de cultivo nos processos de esterilização contínua. 
 
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meio de cultivo
trocador
de calor
meio de cultivo estéril
injeção de vapor
seção de manutenção
da temperatura
resfriador flash
biorreator
meio de cultivo
trocador
de calor
meio de
cultivo
estéril
seção de manutenção
da temperatura
biorreator
trocador
de calor
vapor
 
(a) (b)
Figura 12.3: Equipamentos para esterilização contínua: (a) injeção direta de vapor com resfriamento flash; 
(b) transferência de calor utilizando trocadores de calor. 
 
 
(a) (b)
Figura 12.4: Curvas de aquecimento, manutenção da temperatura e resfriamento durante uma esterilização 
contínua: (a) injeção direta de vapor com resfriamento flash; (b) transferência de calor utilizando trocadores 
de calor. 
 
 
Figura 12.5: Trocador de calor de placas (Fonte: Dairy Processing Handbook, 1995). 
 
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Figura 12.6: Trocadores de calor de tubulares (Fonte: Dairy Processing Handbook, 1995). 
 
 
 
 
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13 Elementos de genética 
13.1 Nucleotídeos e ácidos nucléicos 
Nucleotídeos são compostos ricos em energia que controlam os processos metabólicos das células. 
Os nucleotídeos são formados por (Figura 13.1): 
• Pentose 
o D-ribose 
o 2’-deoxi-D-ribose 
• Base nitrogenada (Figura 13.2) 
o Purinas: adenina (A) e guanina (G) 
o Pirimidinas: timina (T), citosina (C), uracil (U) 
• Fosfato 
 
Figura 13.1: Representação esquemática de um nucleotídeo. 
 
 
Figura 13.2: Bases nitrogenadas. 
13.2 Ácidos nucléicos - DNA e RNAOs ácidos nucléicos são polímeros de nucleotídeos e funcionam como o depósito de informação 
genética das células. São os: 
 
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• Ácido ribonucléico – RNA 
• Ácido desoxi-ribonucléico – DNA. 
No DNA o grupo hidroxila em vermelho (-OH) é substituído por um hidrogênio (-H), conforme a 
Figura 13.1. 
Os polímeros de DNA e RNA são formados por quatro bases nitrogenadas, duas purinas, adenina e 
guanina, e duas pirimidinas, citosina e timina no DNA e citosina e uracil no RNA. Nos polímeros de DNA e 
RNA os nucleotídeos são ligados covalentemente através do grupamento fosfato, conforme mostrado na 
Figura 13.3. 
 
Figura 13.3: Polímeros de DNA e RNA. 
13.2.1 DNA 
O DNA é a molécula responsável pelo armazenamento de informações genéticas. 
 
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A seqüência de aminoácidos de cada proteína e a seqüência de nucleotídeos de cada RNA da célula 
é especificada pela seqüência de DNA da célula. 
Os polímeros de DNA constituem fitas duplas de nucleotídeos em formato helicoidal onde A liga 
com T e C liga-se com G, conforme as Figuras 13.4 e 13.5. 
 
Figura 13.4: Estrutura dupla-hélice em formato helicoidal do DNA. 
 
 
Figura 13.5: Ligações A-T e C-G do DNA. 
 
Gene é o segmento de DNA que contém a informação necessária para a síntese de um determinado 
produto. Os genes são agrupados em estruturas denominadas cromossomos. 
Quando uma célula se duplica, seu DNA deve estar duplicado também para que a herança genética 
seja repassada para as células-filhas. Na duplicação do DNA, a dupla fita se abre e cada fita de DNA da 
 
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célula mãe gera uma nova fita-dupla de DNA que irá p/ célula-filha. A enzima responsável pela adição de 
nucleotídeos a fita-molde original é a DNApolimerase (Figuras 13.6 e 13.7). 
 
Figura 13.6: Dupliação de uma dupla-fita de DNA. 
 
 
Figura 13.7: Duplicação do DNA com a enzima DNApolimerase. 
 
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13.2.2 RNA 
Molécula responsável por levar a informação genética do DNA às estruturas celulares por 
transformá-las em proteínas. Também auxilia na tradução de proteínas. 
Tipos de RNA: 
RNA ribossomal (rRNA): componentes estruturais dos ribossomos, responsáveis pela síntese de 
proteínas. 
RNA mensageiro (mRNA): seqüências de ácidos nucléicos que carregam a informação de um ou 
mais genes para o ribossomo. 
RNA transferidor (tRNA): são as moléculas que carregam os aminoácidos. 
13.2.3 Processo de “construção” de proteínas nas células 
DNA ? RNA = transcrição 
RNA ? proteínas = tradução 
A transcrição do DNA para RNA é realizada através da atuação da enzima RNApolimerase 
(Figuras 13.8 e 13.9) 
A tradução do RNA para proteínas é realizada nos ribossomos com o auxílio dos tRNA, 
responsáveis por carregar os aminoácidos até o ribossomo. Cada três nucleotídeos de RNA (códon) 
codificam para um aminoácido (Figura 13.10) 
 
 
Figura 13.8: Transcrição do DNA para RNA pela RNApolimerase. 
 
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Figura 13.9: Processo de transcrição do DNA em RNA e de tradução do mRNA em proteínas pelos 
ribossomos. 
 
Figura 13.10: Transcrição do DNA para RNA e tradução do mRNA para proteína. 
 
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Semestre 2005/1 65 
 
13.3 Regulação gênica 
Dos 4.000 genes de uma genoma bacteriano típico ou dos 100.000 genes estimados do genoma 
humano, somente alguns estão sendo transcritos e traduzidos em um dado momento. 
A regulação da expressão gênica é de importância primordial para a regulação do metabolismo 
celular 
Pontos do processamento gênico onde as proteínas podem ser reguladas (Figura 13.11): 
• Transcrição do mRMA primário 
• Processamento pós-transcricional do mRNA primário 
• Degradação do mRNA 
• Síntese da proteína (tradução) 
• Degradação da proteína. 
 
 
Figura 13.11: Pontos de regulação gênica nos organismos vivos. 
 
 
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Tipos de genes quanto a regulação: 
Constitutivos: responsáveis por produtos necessários durante o tempo todo dentro da célula, como 
as enzimas que catalisam as vias metabólicas centrais, como a glicólise. 
Induzidos: Genes cuja concentração de seus produtos aumenta em determinadas condições. O 
processo de aumento da concentração do produto celular destes genes é denominado indução. Ex: enzimas de 
reparo celular. 
Reprimidos: Genes cuja concentração de seus produtos diminui devido a um sinal celular. O 
processo de diminuição concentração do produto celular destes genes é denominado repressão. Ex: a 
presença de triptofano no meio reprime os genes das enzimas responsáveis pela biossíntese de triptofano pela 
célula. 
 
Iniciação da transcrição 
Três tipos de proteínas regulam a iniciação da transcrição do DNA: 
• fatores de especificidade 
• repressores 
• ativadores 
Operador: sítio de ligação da proteína repressora. 
A regulação gênica pode ser positiva ou negativa, como mostrado na Figura 13.12. 
 
 
Figura 13.12: Regulação gênica positiva e negativa com sinal molecular que provoca a ligação ou o 
desligamento de uma proteína regulatória no operador. 
 
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13.4 Organização do genoma de procariotos: 
Os genes responsáveis pela mesma rota metabólica normalmente são organizados na forma de 
operons. Os mRNAs transcritos apresentam diversos genes e são denominados mRNAs policistrônicos, 
conforme mostrado na Figura 13.13. 
 
Figura 13.13: Representação esquemática da organização dos genes bacterianos em operons. 
 
Operon lac 
O operon lac codifica os genes responsáveis pela degradação da lactose em Escherichia coli. É 
formado pelos seguintes genes: 
• LacI – repressor 
• LacZ – β-galactosidadse 
• LacY – lactose-permease 
• LacA – transacetilase 
 
Regulação negativa do operon lac: 
O operon lac sofre regulação negativa pela lactose (Figura 13.14). Na ausência de lactose os genes 
do operon lac são reprimidos. Na presença de lactose (indutor), esta é transformada em alolactose, que se 
liga ao repressor diminuindo a afinidade deste com o operador, que se desliga do DNA permitindo a 
transcrição dos genes do operon. 
 
Figura 13.14: Regulação negativa do operon lac. 
 
Regulação positiva do operon lac (efeito repressor da glicose): 
O operon lac também sobre regulação positiva pela presença de glicose (Figura 13.15). O efeito 
repressor da glicose é denominado repressão catabólica e é mediado pela molécula cAMP (adenosina 
monofosfatada cíclica) e pela proteína CAP (catabolite gene activator protein). 
Na ausência de glicose a CAP liga-se ao DNA próximo ao promotor lac e estimula a transcrição do 
RNA em 50 vezes. O CAP é uma proteína regulatória positiva. A ligação da CAP do DNA ocorre quando a 
 
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quantidade de cAMP é alta e este encontra-se ligado na CAP. Quando a concentração de glicose é alta, a 
concentração de cAMP cai, este desliga-se da CAP que por sua vez desliga-se do DNA, diminuindo muito a 
afinidade da RNApolimerase com o DNA. 
 
Figura 13.15: Regulação positiva do operon lac. 
 
O cAMP e a CAP estão envolvidas na regulação coordenada de diversos operons que codificam 
enzimas do metabolismo deaçúcares secundários como lactose, galactose, arabinose. Esta rede de operons 
com um regulador em comum é denominada regulon. 
13.5 Genética de microrganismos 
O estudo da genética de fungos, bactérias e vírus à partir de 1941 foi um marco decisivo para o 
desenvolvimento da genética. 
Vantagens de se trabalhar com microrganismos: 
- ciclo vital rápido 
- pequenos 
- pouco complexos 
13.5.1 Mutação 
Considera-se mutação qualquer alteração no material genético que possa ser transmitida aos 
descendentes, como: 
- perdas ou adição de segmento cromossômico 
- inversões ou translocações de material genético 
- mutação gênica ou pontual ? substituição, adição ou perda de um ou poucos 
nucleotídeos do DNA. 
As mutações ocorrem espontaneamente durante a duplicação do DNA em 1 a cada 108 divisões 
celulares. A utilização de agentes mutagênicos aumenta em até 103 vezes a freqüência de mutações. 
 
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Figura 13.16: Representação esquemática de mutações por deleção e por inversão. 
 
Agentes mutagênicos: 
- radiação gama e ultravioleta 
- agentes alquilantes: dietilsulfato (DES), metanosulfonato de etila (EMS), 
nitrossoguanidina (NTG) 
- agentes desaminadores: ácido nitroso (HNO2) e a hidroxilamina (HA) 
- análogos de bases nitrogenadas: 2-aminopurina (2-AP) e 5-bromosoxiuridina (5-BdU) 
As mutações espontâneas e induzidas ocorrem ao acaso e são necessárias técnicas p/ selecionar os 
mutantes com as características de interesse. 
A seguir são descritos os principais tipos de mutantes utilizados na genética de microrganismos. 
Mutantes auxotróficos 
Incapazes de sintetizar algum tipo de vitamina, base nitrogenada ou aminoácido. Ex: leu2, ura3, 
lysA 
Mutantes que não utilizam alguma fonte de carbono ou nitrogênio 
Incapazes de crescer em alguma ou mais fontes de carbono diferente da glicose ou em algum tipo 
de fonte inorgânica de nitrogênio. Ex: lactose negativos (lac-) e mutantes que utilizam amônia e nitrito e não 
utilizam nitrato. 
Mutantes resistentes a agentes inibidores 
São organismos resistentes a antibióticos, quimioterápicos ou metais pesados. 
Mutantes morfológicos 
 
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Mutantes para a produção de substâncias liberadas pela célula 
Apresentam maior ou menor produção de antibióticos, compostos orgânicos, enzimas. 
Mutantes para virulência e patogenicidade 
Mutantes sensíveis a algum fator específico (como temperatura) 
 
 
Figura 13.17: Representação esquemática de mutação por radiação ultravioletra. 
 
Reversões 
É a mutação reversa de algum mutante citado acima. Pode ser intragênica ou intergênica. É uma 
medida da estabilidade da mutação. A freqüência de reversões é maior que a freqüência de mutações, pois 
diferentes mudanças de bases podem restaurar o fenótipo selvagem sem restaurar o genótipo – pseudo-
reversão. 
13.6 Herança extracromossômica em microrganismos – plasmídeos 
O plasmídeo é definido como um replicon, ou pedaço de DNA com capacidade de replicação, 
estavelmente herdado de modo extracromossomal. Consiste tipicamente como um pedaço circular de DNA 
dupla fita com capacidade autônoma de replicação. 
Características comuns a todos os plasmídeos: 
1. todos possuem capacidade de replicação independente do DNA cromossomal. 
2. todos pertencem a algum grupo de incompatibilidade. 
Características dos plasmídeos: 
1. muitos plasmídeos possuem genes que codificam propriedades como: 
a. resistência a antibióticos (fatores de R ou de “resistência”) 
b. degradação de macromoléculas complexas 
c. produção de bacteriocinas 
d. resistência a metais pesados 
e. síntese de antibióticos 
f. fatores de virulência. 
2. habilidade de transferir-se para outra célula através de conjugação 
3. funções de partição. 
 
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Figura 13.18: Representação esquemática do plasmídeo pBR322. 
13.6.1 Conjugação 
A conjugação é definida como a transferência unidirecional da informação genética entre células 
através do contato célula-célula. Pode ocorrer com qualquer tipo de DNA que contenha o sítio de iniciação 
da transferência oriT ou mob. O termo unidirecional se refere ao fato que uma cópia do plasmídeo é 
transferida através de uma célula denominada “doadora” a uma célula denominada “receptora”. O contato 
entre as células é realizado através de um pilus, conforme mostrado na Figura 13.19. 
 
The bacterium with an R-plasmid is multiple antibiotic resistant and can 
produce a sex pilus (serve as a genetic donor). 
 
The sex pilus adheres to an F- female (recipient). One strand of the R-plasmid 
breaks. 
 
The sex pilus retracts and a bridge is created between the two bacteria. One 
strand of the R-plasmid enters the recipient bacterium. 
 
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Both bacteria make a complementary strand of the R-plasmid and both are 
now multiple antibiotic resistant and capable of producing a sex pilus. 
Figura 13.19: Conjugação de um plasmídeo R entre duas bactérias. 
 
13.6.2 Funções de partição 
Os plasmídeos possuem funções que aumentam a probabilidade de ambas as células-filhas 
possuírem cópias do mesmo. As funções de partição, denominadas par utilizam diversos mecanismos como 
monomerização de multímeros de plasmídeos e associação dos plasmídeos com a membrana celular. Ver 
Figura 13.20. 
 
Figura 13.20: Partição de plasmídeos nas células-filhas. 
 
 
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14 Elementos de engenharia genética – cultivo de microrganismos recombinantes 
A engenharia genética surgiu na década de 70 como decorrência da grande quantidade de 
conhecimentos acumulados na área de Biologia Molecular. Hoje pode-se programar geneticamente 
organismos vivos. 
Os microrganismos foram os primeiros seres a serem utilizados como hospedeiros de informação 
genética heteróloga devido a facilidade de manipulação. Hoje pode-se virtualmente produzir qualquer 
proteína em fermentações industriais desde que o gene que a expressa seja clonado em um microrganismo. 
Chama-se engenharia genética o conjunto de técnicas que tornam possível a criação de nocav 
combinações gênicas, inexistentes na natureza. 
A Figura 14.1 mostra os passos da construção de um microrganismos recombinante. Não 
necessários virtualmente quatro etapas para o processo. 
1. um meio de clivar e voltar a ligar in vitro diferentes moléculas de DNA, gerando o DNA 
recombinante. 
2. um elemento transportador de genes, o vetor genético, que ao ser multiplicado na célula 
hospedeira também multiplicará o gene recombinante 
3. um meio de introduzir o vetor numa célula viva 
4. um modo de selecionar, dentre uma grande população de células, apenas aquelas que 
tiverem o DNA recombinante. 
 
 
Figura 14.1: Representação esquemática da construção de uma célula bacteriana geneticamente modificada. 
14.1 Enzimas de restrição 
A construção de um DNA recombinante requer que seja possível cortar o DNA em pontos 
específicos. Isto só se tornou possível com a descoberta das endonucleases de restrição, que rendeu o Prêmio 
 
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Nobel a W. Arber, H. Smith e D. Nathans em 1978. As enzimas (endonucleases) de restrição são tesouras 
moleculares que cortam a molécula de DNA em pontos específicos. A Tabela 14.1 apresenta algumas 
enzimas de restrição com o organismo produtor e a seqüência de reconhecimento. 
As enzimas derestrição clivam a ligação fosfodiéster, deixando os grupos 5’ fosfato (5’ P) e 3’ 
hidroxila livres (3’ OH) nos fragmentos resultantes, que constituem o substrato para a enzima DNAligase. 
 
Tabela 14.1: Exemplos de enzimas de restrição. 
Organismo produtor Nome da enzima Seqüência de reconhecimento 
Escherichia coli EcoRI 5´...G↓AATT C...3´ 
3´...C TTAA↑G...5´ 
Proteus vulgaris PvuRII 5´...CAG↓CTG...3´ 
3´...GTC↑GAC...5´ 
Arthrobacter luteus AluI 5´...AG↓CT...3´ 
3´...TC↑GA...5´ 
Anabaena variabilis AvaI 5´...C↓PyCGPu G...3´ 
3´...G PuGCPy↑C...5´ 
Nocardia otitidiscaviarum NotI 5´...GC↓GGCC GC...3´ 
3´...CG CCGG↑CG...5´ 
Providencia stuartii PstI 5´...C TGCA↓G...3´ 
3´...G↑ACGT C...5´ 
Bacillus stearothermophilus ET BstEII 5´...G↓GTNAC C...3´ 
3´...C CANTG↑G...5´ 
Pu = qualquer purina; Py = qualquer pirimidina; N = qualquer nucleotídeo. 
14.2 Vetores genéticos 
Constituem as moléculas de DNA carreadoras do DNA recombinante. Normalmente são 
plasmídeos ou fagos, pois os vetores devem carregar o DNA heterólogo para a célula hospedeira e permitir 
sua multiplicação. Os vetores também devem possuir alguma característica que permita diferenciar a célula 
portadora do vetor das que o perderam. 
Características dos plasmídeos para serem utilizados como vetores de clonagem: 
a) baixo peso molecular 
b) ter sítios únicos de restrição para algumas enzimas 
c) ter origem de replicação compatível com o sistema hospedeiro 
d) conter pelo menos um gene marcador 
e) ter controle de replicação “relaxado” 
f) não ser um plasmídeo conjugativo. 
 
14.3 Hospedeiros para DNA recombinante 
As características necessárias para um hospedeiro de genes clonados são: capacidade de crescer em 
meios pouco dispendiosos e não ser patogênico. Os hospedeiros mais utilizados são a bactéria E. coli e a 
levedura S. cerevisiae. 
 
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Hospedeiros procarióticos 
O organismo mais utilizado até hoje continua sendo a Escherichia coli devido à grande quantidade 
de conhecimento acumulado sobre seus mecanismos genéticos e bioquímicos. Contudo a E. coli possui 
algumas desvantagens: 
• é encontrada no trato intestinal humano e é potencialmente patogênica; 
• mesmo as linhagens não-patogênicas produzem endotoxinas que podem contaminar os 
produtos; 
• não secreta eficientemente as proteínas, que ficam retidas no periplasma. 
Hospedeiros eucarióticos 
A levedura Saccharomyces cerevisiae é a mais utilizada, por ser a mais conhecida e para ela foram 
desenvolvidos diversos vetores de expressão. É unicelular e não patogênica e pode realizar diversas 
modificações pós-traducionais como remoção da metionina amino-terminal; acetilação do terminal amino, 
acilação, fosforilação e glicosilação. Também é capaz de realizar o “folding” correto das proteínas necessário 
para que estas adquiram sua conformação tridimensional correta e plena atividade biológica. 
Outros hospedeiros eucarióticos são as células de mamíferos, células de insetos e a transformação 
genéticas de plantas. 
Os sistema de células de mamíferos têm sido utilizadas para estudos de genética humana, câncer, 
doenças infecciosas e para a produção de proteínas terapêuticas como eritropoitina e hormônio de 
crescimento. Como não se conhecem plasmídeos de células de mamíferos os vetores de expressão utilizados 
são vírus, como os derivados do SV40. 
Transformação de células 
As bactérias são transformadas pelos métodos do CaCl2 seguido de choque térmico, e por 
eletroporação. As leveduras primeiramente eram transformadas por protoplastização (digestão da parede 
celular, seguida da regeneração dos protoplastos após o tratamento com o DNA. Hoje utiliza-se a técnica do 
cloreto de lítio e da eletroporação. 
 
 
 
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