Aula Transformação genetica de plantas PauloT

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Transformação Genética de Plantas
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA - UFBA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE - ICS
DEPARTAMENTO DE BIOFUNÇÃO
Disciplina: Biotecnologia Vegetal
Profª. Drª. Marta Bruno Loureiro _____________________________________________________________________________________________
1
9.000 anos a.C.
AGRICULTURA
Seleção e Cruzamentos de indivíduos com características de interesse
(inconsciente)
INTRA-ESPÉCIES 
Melhoramento clássico
MELHORAMENTO GENÉTICO DE PLANTAS 
1983 ......
 TRANSGÊNICOS!
Clonagem, Engenharia Genética e Transformação de Plantas
 INTER-ESPÉCIES
Biotecnologia moderna
Obtenção de cultivares resistentes a doenças ou outros fatores quando NÃO forem encontrados GENES DE INTERESSE no germoplasma da espécie
QUANDO E PARA QUE USAR A TRANSGENIA?
CARACTERÍSTICAS DO TIPO INPUT – relacionadas com o processo produtivo, visam reduzir os custos com a produção.
Ex: Resistência a herbicidas, doenças, insetos e pragas
CARACTERÍSTICAS DO TIPO OUTPUT – visam agregar valor ao produto final.
Ex: Melhoria da qualidade nutricional
MELHORAMENTO GENÉTICO CONVENCIONAL
Troca de genes limitada somente a espécies que são sexualmente compatíveis. 
TRANSGENIA X MELHORAMENTO GENÉTICO TRADICIONAL
TRANSGENIA
 Possibilidade de transferência de características (genes) de plantas não relacionadas (espécies sexualmente incompatíveis).
É a transferência (introdução) de um ou vários genes em um organismo sem que haja a fecundação ou o cruzamento. 
Organismo - transgênicos 
Genes inseridos - transgenes
TRANSGENIA
TRANSGÊNICO 
 Organismo que recebeu gene exógeno por engenharia genética 
ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO (OGM) 
 Organismo cujo o material genético foi modificado por engenharia genética - de modo que seja expressa uma nova enzima ou proteína, que irá conferir ao organismo novas características mais proveitosas para o Homem.  
1973 - Paul Berg (Químico) 
Retirou um gene do vírus e colocou-o em um ponto de encaixe no DNA de uma bactéria.
Como? Através de um outro tipo de vírus que ataca bactérias e conseguiu pela primeira vez que material genético de dois organismos diferentes se combinassem em laboratório. 
PLANTAS TRANSGÊNICAS “Global Status 2015”
ISAAA - Serviço Internacional para Aquisição de Aplicações em Agrobiotecnologia / www.isaaa.org
2015 – 18 milhões de fazendas em 28 países, com 179,7 milhões de hectares plantados, um decréscimo de 1,8 milhões de hectares em relação a 2014.
PLANTAS TRANSGÊNICAS “Global Status 2015”
ISAAA - Serviço Internacional para Aquisição de Aplicações em Agrobiotecnologia / www.isaaa.org
PLANTAS TRANSGÊNICAS “Global Status 2015”
ISAAA - Serviço Internacional para Aquisição de Aplicações em Agrobiotecnologia / www.isaaa.org
Área Global de cultivo de plantas transgênicas: 
Por Culturas (milhões de hectares)
PLANTAS TRANSGÊNICAS “Global Status 2015”
ISAAA - Serviço Internacional para Aquisição de Aplicações em Agrobiotecnologia / www.isaaa.org
Taxas globais (%) de utilização de plantas transgênicas: 
Principais culturas (milhões de hectares)
CARACTERÍSTICAS MAIS COMUNS INTRODUZIDAS EM OGMS 
 Tolerância a herbicida 
 Melhoria da qualidade de produto
 Resistência ao ataque de insetos
 Resistência ao ataque de vírus 
PLANTAS TRANSGÊNICAS “Global Status 2015”
ISAAA - Serviço Internacional para Aquisição de Aplicações em Agrobiotecnologia / www.isaaa.org
Área Global de cultivo de plantas transgênicas: 
Por características (milhões de hectares)
Tolerância a herbicidas 
Qualidade do produto 
Resistência a insetos 
TOLERÂNCIA A HERBICIDA 
Resistência aos herbicidas:
Glifosato
Piridina
Fosfonotricina 
Sulfoniureia
Fosametina
Bromacil
TOLERÂNCIA AO HERBICIDA GLIFOSATO (glicina + fosfato)
Via do Chiquimato
Aminoácidos aromáticos 
Metabólitos secundários 
(Alcalóides, fenilpropanóides)
EPSP SINTETASE
EPSP Sintetase - cataliza a reação do eritrose -4-fosfato e do fosfoenolpurivato para formar EPSP (5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato) e fosfato. 
Via do Chiquimato
Glifosato – se liga ao sítio ativo da EPSP sintetase
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TOLERÂNCIA A HERBICIDA 
Glifosato
Biossíntese de Aminoácidos Aromáticos
EPSPS : 
5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintetase 
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Exemplos de transgênicos resistentes ao glifosato
Soja Round up Ready (RR) – Resistente ao glifosato
Gene: EPSPS (clonado de Agrobacterium tumefaciens estirpe CP4)
Empresa produtora: Monsanto
Milho Liberty link - resistente ao herbicida glufosinato
Gene: PAT (clonado de Streptomyces hygroscopicus)
Empresa produtora: Aventis
MELHORIA DA QUALIDADE DO PRODUTO 
Características modificadas:
Conteúdo de betacaroteno
Conteúdo de proteínas 
Atraso de maturação
Conteúdo de matéria seca
Produtividade de grãos
Metabolismo do amido
Tolerância a estresse 
Outros. 
QUALIDADE DE PRODUTO 
Conteúdo de betacaroteno:
Humanos são capazes de sintetizar vitamina A a partir do precursor - betacaroteno.
Vitamina A ou 11-cis-retinol é requerida por todas as celulas animais, principalmente para os olhos
 Até 6.000 mortes diárias por falta de vitamina A
 500.000 pessoas cegas por ano
 Cereais são a principal fonte de alimentos, principalmente para a população pobre do mundo, porem são pobres em betacaroteno
 
GOLDEN RICE
Foi concebido para produzir beta-caroteno , um precursor da vitamina A , em partes comestíveis de arroz (endosperma)
20 x mais betacarotenao
A planta de arroz pode, naturalmente, produzir beta-caroteno em suas folhas, na fotossíntese. 
Não produz normalmente o pigmento no endosperma, local em que a fotossíntese não ocorre. 
Golden Rice
Criação em 2000
Conteúdo de betacaroteno:
 Biossíntese de betacaroteno em cereais transgênicos 
 
 Uma descoberta importante foi a de que um único gene de fitoeno dessaturase (bacteriana crt I) pode ser usado para produzir o licopeno a partir de fitoeno em tomate GM. 
QUALIDADE DE PRODUTO 
Transgene 1
Transgene 2
Transgene 3
Transgene 4
RESISTÊNCIA A INSETOS
Características modificadas:
Proteina Bt
Proteina repulsão 
Bacillus thuringiensis - forma cristais proteicos durante a fase estacionária e/ou de esporulação. 
Ocorre naturalmente em diversos hábitat: solo, filoplano, resíduos de grãos, poeira, água, matéria vegetal e insetos. 
Cristal proteico (delta-endotoxinas)- possui propriedades inseticidas específicas.
Formas: bipiramidal, esféricos, retangulares, cuboides e irregulares 
Resistência a insetos
Proteina Bt
Gene: cry ou gene bt
Plantas resistentes a lagarta do cartucho
Lagarta-do-cartucho 
Bacillus thuringiensis 
Com a expressão do gene Bt houve redução de 40% do uso de inseticidas químicos
Detalhe da lagarta infestando a planta de milho
MILHO Bt
 1ª planta transgênica mais cultivada do mundo
 2ª planta - Algodão Bt
A especificidade das toxinas do Bt resulta em alta seletividade na sua atividade, agindo apenas nas espécies-alvo. 
Afeta menos a comunidade dos insetos que utilizam o milho como hospedeiro, contribui para redução da utilização de inseticidas convencionalmente utilizados. 
Milho Bt Milho convencional
Resistência a insetos
Proteina Bt:
Ingestão de toxina e proteína cry3A;
Ligação das toxinas com receptores específicos;
Degradação da parede e entrada da cry3A;
Morte da lagarta 
 
cry3A
cry3A
Parede degradada
Principais pragas:
Lagarta-do-cartucho do milho (LCM) -  Spodoptera frugiperda 
Lagarta-da-espiga do milho (LEM) - Helicoverpa zea 
Broca da cana-de-acúcar (BCA) - Diatraea saccharalis 
Cristais de delta-endotoxinas
1987 – PRODUÇÃO DAS PRIMEIRAS PLANTAS TANSGÊNICAS (Bt)
Sintetizam a Proteina Cry modificada
Introdução dos genes- Bacillus thurigiensis
cry 1 AB
cry 1 AC
........Cry 50
Primeiras Plantas:
Tomate e Tabaco
RESISTÊNCIA A VÍRUS 
Resistência aos virus:Mosaico da alfafa
Virus X da batata
Virus Y da batata
Mosaico do pepino
Vírus do mamoeiro 
Mosaico da soja
Mosaico do fumo
Outros 
ESTRATÉGIA MAIS UTILIZADA 
Expressão do gene da capa proteica
RESISTÊNCIA A VÍRUS 
GENE DA CAPA PROTEICA
Resistência derivada do patógeno - introdução de sequências genômicas dos próprios patógenos.
Sequencias sem códon de iniciação 
Mutantes do gene CP - transcrito não pode ser traduzido em proteína
Liberado em 1998 
Resistência foi obtida através da introdução de partes do gene que codifica a capa protéica do vírus PRSV.
Mamoeiro resistente ao vírus da mancha anelar (PRSV)
 Havaí.
Mamão transgênico
ALTERAÇÕES NO AMADURECIMENTO
Desligamento de genes responsáveis pela síntese do etileno
Bloqueio da ação do etileno – estratégia antisenso
Desligamento de genes expressos durante a maturação – estratégia antisenso
ESTRATÉGIA ANTISENSO
Planta é transformada com fragmento de DNA do gene alvo em orientação oposta a orientação normal
Transcrição - Gera um RNA antisenso (complementar ao RNAm que se quer alterar)

RNA antisenso se liga ao RNAm do gene alvo, bloqueando a tradução (ptns)
1ª Planta - Tomate Flavr Sarv (1994) 
1º alimento geneticamente modificado a ser concedido uma licença para o consumo humano. 
Empresa: Calgene
Gene anti-senso para poligalacturonase (degrada pectina da parede celular durante o amadurecimento).
Resultado: Aumento de tempo de prateleira do fruto 
ALTERAÇÕES NO AMADURECIMENTO
PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS:
REQUISITOS PARA A TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA
Isolamento e clonagem de um gene útil
Adicionar segmentos de DNA que expressem ou aumentem a expressão do gene
Transferência desse gene para dentro da célula vegetal 
Integração do gene ao genoma da planta 
Selecionar células ou tecidos transformados
Regenerar a planta a partir da célula transformada
Avaliar a expressão do gene introduzido nas plantas regeneradas (avaliar)
Transmissão do gene introduzido de geração em geração.
PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS:
REQUISITOS PARA A TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA
Transformação genética: É a transferência de genes isolados de plantas, vírus, bactérias ou animais para um outro organismo contendo conteúdo genético diferente.
Requerimentos:
1) Identificação e isolamento do gene de interesse
2) Clonagem dos genes de interesse
3) Construção Gênica
4) Um sistema para a introdução do gene
1) Identificação e isolamento do gene de interesse
Enzimas de restrição e DNA ligases
Cortam o DNA alvo em diferentes pontos, ligam o DNA excisado com outras sequencias  DNA recombinante
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2) Multiplicação do gene de interesse
Plasmídeos de bactérias vetores 
Gene repórter: é um gene inserido no DNA recombinante cuja atividade pode ser facilmente detectada. 
Serve para ajudar na identificação das células transformadas, e na otimização de protocolos.
Ex.: gene gusA - Beta-glucuronidase (GUS)
 gene luc – Luciferase
 genes R/C – Antocianina
 
3) Construção Gênica
Expressão de Genes gus em embrião de feijão
Método: Bombardeamento de partículas
Brotação de planta trâsngênica
Embrião transgênico
Embrião não transgenico
Sementes de 1ª Geração
Expressão do gene reporter 24 horas após o bimbardeamento
3) Construção Gênica
Marcador de seleção (gene de seleção): é o gene utilizado para a seleção das células transformadas. 
Somente as células que receberam o gene de seleção sobrevivem na presença do agente seletivo (substância à qual o gene de seleção confere resistência).
Ex:
Gene de seleção: hpt (Higromicina fosfotransferase)
Agente seletivo: Higromicina
 Gene de seleção: bar (Herbicida)
 Agente seletivo: PPT (Fosfinotricina)
 Gene de seleção: nptII - Neomycin Phosphotransferase Gene (Antibiótico)
 Agente seletivo: Canamicina 
Sequencias Promotoras:
Seqüências de DNA específicas importantes para o início da transcrição. 
Estas seqüências são reconhecidas por algumas proteínas específicas (fatores de transcrição), que trazem a RNA polimerase para realizar a montagem dos RNA .
3) Construção Gênica
Sequencias terminadoras:
Seqüências de DNA específicas para a finalização da transcrição do gene.
3) Construção Gênica
2) Introdução do gene
Principais Métodos de transformação gênica 
Agrobacterium tumefaciens 
Bombardeamento de partículas 
Eletroporação
 
1) Natural ou indireto: Agrobacterium tumefaciens
2) Métodos Diretos
Bombardeamento de partículas
Eletroporação
Tratamentos químicos: PEG
Microinjeção
Agrobacterium tumefaciens 
Características 
Bactéria do solo (gram- negativa) que infecta algumas espécies formando um tumor na região do colo
Plasmídeo Ti (tumor-inducing) – Possui DNA extracromossomal moléculas circulares de DNA, são os responsáveis pela formação do tumor
 Os plasmídios são capazes de introduzir seu DNA (T DNA) no genoma da planta hospedeira 
T-DNA (transferred DNA) - contém genes envolvidos na produção de reguladores de crescimento vegetais e opinas.
 Por meio da manipulaçao genética é possível a substituição de sequências nativas na região de transferencia (T-DNA), por genes de interesse
2) Introdução do gene
Biologia do processo infeccioso por Agrobacterium tumefaciens (condições naturais)
1- A planta apresenta algum tipo de lesão ou ferimento (insetos, geadas ou tratos culturais)
2- Exsudados como moléculas sinalizadoras - na região dos ferimentos são exsudados (compostos fenólicos, açúcares e aminoácidos)
3- As bactérias são atraídas em direção ao tecido vegetal
4- Ligação bactéria + célula vegetal - bactérias sintetizam microfibrilas de celulose para favorecer a formação de agregados de células bacterianas em volta do tecido vegetal
Galha da coroa
2) Introdução do gene
Agrobacterium tumefaciens
Condições naturais: bactéria transfere o T-DNA a célula vegetal .
Célula vegetal: produz substâncias indutoras de crescimento (auxinas e citocininas) e opinas 
Estas substâncias são utilizadas bela bactéria de alimento e induzem tb a multiplicação da célula vegetal  tumores ou calos.
ONCOGENES 
Genes encontrados no T-DNA que codificam enzimas envolvidas na via de biossíntese de hormônios vegetais
Citocininas
Auxinas
Opinas (aminoácidos ou carboidratos)
Resposta do fenótipo: desbalanço hormonal nas células vegetais infectadas pela bactéria. 
As opinas produzidas são utilizadas como um dos critérios para a classificação de linhagens e espécies de Agrobacterium.
genes
2) Introdução do gene
Manipulação genética do plasmídeo Ti
 Substituição das sequências nativas na região de transferência do plasmídeo Ti (T-DNA) por genes de interesse. 
 Agrobacterium contendo um plasmídeo Ti manipulado infecta uma célula vegetal, transferirá o gene de interesse para dentro da célula, que será transformada.
Agrobacterium tumefaciens
2) Introdução do gene
Transferência do T-DNA da Agrobacterium para a célula vegetal requer 2 componentes
	Extremidades direita e esquerda
	Região de virulência (Genes de virulência presentes no cromossomo)
		• chvA, chvB, chvE, psc(A) ou exoC e att
Os oncogenes são retirados - necessário para a diferenciação e regeneração de plantas a partir das células transformadas. 
Obtenção de linhagem desarmada - Uma linhagem de Agrobacterium cujos oncogenes foram eliminados (não é mais capaz de induzir galhas ou raízes em plantas). 
2) Introdução do gene
2) Introdução do gene
Duas regiões com sequencias repetidas
25 pb
Delimitam o T-DNA
Necessárias para a transferência do T-DNA.
Pode-se retirar todo o T-DNA, ficando com as extremidades direita e esquerda do T-DNA na construção gênica
2) Introdução do gene
2) Introdução do gene
Região de virulência (vir) 
(25 genes) 
ativada pelos exsudados das células vegetais.
 Codifica proteínas que permitem a transferência do T-DNA para célula vegetal
A região vir também é essencial para a transferência 
do T-DNA
Contém genes cujos produtosvão promover a excisão e o transporte do T-DNA para a célula vegetal.
Preparação de linhagem de Agrobacterium como vetor
Etapas distintas:
1ª Etapa- Obtenção de linhagens desarmadas
2ª Etapa- Construção do vetor binário (T-DNA + genes de interesse)
Devido ao seu tamanho, o plasmídio Ti não pode ser manipulado diretamente. 
Plasmídios menores (mais fáceis de manipular), foram desenvolvidos (vetores binários), 
3ª Etapa - Transferencia do vetor binário
Transferido para a linhagem desarmada de Agrobacterium
Conjugação triparental
Eletroporação
Choque térmico
Transformação da célula vegetal
1ª Etapa: 
Tecido vegetal: folhas discos ou fragmentos foliares, segmentos de caules ou de raízes, tubérculos, pecíolos, cotilédones, protoplastos, embriões somáticos. 
Coloca-se o Agrobacterium transformado em co-cultivo com o tecido a ser transformado por 24-48 horas
Ocorrerá a ligação entre a bactéria e a célula vegetal, no local de ferimento do explante
Indução dos genes da região vir, com subseqüente transferência do T- DNA para o genoma vegetal.
Os carboidratos e outros compostos liberados no ferimento dos explantes da planta ativam os genes de virulência
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Transformação da célula vegetal
2ª Etapa:
Transferência do explante para um meio de regeneração apropriado, contendo antibióticos (cefotaxima, ampicilina ou carbenicilina) 
 Aqui elimina-se as células de Agrobacterium (indesejáveis no meio de cultura). 
 Seleção das células transformadas - adicionando-se ao meio, agente seletivo (inibição do crescimento das células não-transformadas) 
 O efeito nocivo do agente de seleção será anulado pelo produto da expressão do gene marcador de seleção (geralmente uma enzima) nas células transformadas.
Limitação na utilização de Agrobacterium 
A bactéria não consegue infectar de forma eficiente a maioria das monocotiledôneas. 
Solução:
Desenvolvimento de métodos alternativos de transformação de plantas.
 Transferência direta: Bombardeamento de partículas
2) Introdução do gene
BIOBALISTICA
A técnica é denominada biobalística, em razão da alta velocidade imprimida aos projéteis revestidos com DNA.
Microprojéteis 
São constituídos de tungstênio ou ouro
Acelerados a uma velocidade de 500 m/s
Os danos causados pelo bombardeio são considerados poucos expressivos
Uma vez dentro da célula, o DNA que reveste os microprojéteis se solubiliza e pode ser integrado ao cromossomo da célula vegetal. 
	
2) Introdução do gene
Permite a introdução e expressão gênica em qualquer tipo celular. 
2) Introdução do gene
Importante testar:
Várias alturas de disparo, 
Um ou mais tiros,
Adição de compostos osmóticos no meio. 
Um bombardeamento muito forte pode levar à morte das células, enquanto um muito fraco leva a uma baixa ou nula transformação
2) Introdução do gene
2) Introdução do gene
2) Introdução do Gene
Introdução de DNA em células expostas a um campo elétrico. Consiste na aplicação de pulsos elétricos curtos de alta voltagem. 
Eletroporação
Aumentam o potencial de transporte de membrana, promovendo uma formação transitória de poros aquosos (“aquaporinas”) na bicamada lipídica, permitindo que macromoléculas migrem através desses poros.
Eletroporação
2) Introdução do Gene
Microinjeção de DNA
 
Consiste numa injeção de DNA no núcleo da célula a ser transformada, com um microcapilar.
As células são transformadas 1 a 1
Controla-se a quantidade de DNA inserido em cada célula
Técnica trabalhosa, adaptada da transformação de céluas animais
Resultados positivos:
Milho, soja, trigo, fumo, arroz, cevada, girassol
PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS
A transformação genética em vegetais só foi possível a partir do desenvolvimento das técnicas de cultura de tecido vegetais. 
Essas técnicas possibilitam a obtenção (regeneração) de uma planta a partir de uma única célula vegetal.
Possibilidade da utilização de genes que não poderiam ser utilizados através do melhoramento convencional
Diminuição do tempo necessário para a obtenção de nova variedade ou cultivar (desnecessário os cruzamentos e retrocruzamentos)
Diminuição dos custos de produção e uso de agrotóxicos 
Diminuição da poluição ambiental
TRANSGENIA - ASPECTOS POSITIVOS
 
Não ocorre aumento indireto de produtividade – poucos genes podem ser inseridos por vez (produção é caracteristica assistida por muitos genes)
Integração do transgene é aleatória – pode levar a expressão de outros genes
Limitada pela capacidade de regeneração das espécies
Elevação do custo da semente e compra de semente a cada safra (pagamento de Royalties)
Pode haver fluxo gênico entre plantas transgênicas e daninhas
Insetos resistentes 
Desenvolvimento de alergias
TRANSGENIA - ASPECTOS NEGATIVOS