Apostila Módulo X Provas Bioquímicas

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE 
INSTITUTO DE SAÚDE DE NOVA FRIBURGO 
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS 
MICROBIOLOGIA 
 
 
X - Provas Bioquímicas 
 As colorações, apesar de exercerem função importante na visualização 
e diferenciação das bactérias quanto à morfologia, arranjo e diferenças 
estruturais, não são capazes de identificar cepas bacterianas. 
 Os testes bioquímicos, ou provas bioquímicas, são utilizados em 
associação com os resultados obtidos através dos cultivos e colorações para a 
identificação mais precisa dos micro-organismos, uma vez que suas 
propriedades metabólicas são específicas em cada gênero ou espécie, como 
as vias de obtenção de energia (fermentação, oxidação), ou através da 
produção de enzimas, responsáveis pela metabolização dos substratos 
presentes no meio de cultura. 
 Os testes realizados neste item estão relacionados aos micro-
organismos Gram negativos fermentadores, mais precisamente as 
enterobactérias, e às suas atividades enzimáticas. (Para os Gram positivos, ver 
item VII). 
 Objetivo: obter a identificação microbiana, após observação do perfil 
bioquímico. 
 
1- Fermentação de carboidratos 
A fermentação é um processo metabólico onde os carboidratos são 
degradados e metabolizados em compostos menores, tendo como produto final 
ácidos, que variam de acordo com a espécie bacteriana (no caso da 
fermentação da glicose também poderá haver produção de gás). Normalmente 
para esse teste utiliza-se um meio de cultura básico com indicador de pH, 
sendo o vermelho de fenol o mais utilizado. 
O meio TSI (Triple Sugar Iron) apresenta três fontes de carboidratos 
(glicose, sacarose e lactose) que, quando fermentados, realizam a viragem do 
meio de vermelho para amarelo, e ferro (sulfato ferroso de amônio), utilizado 
para indicar a presença de H2S. 
 
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Materiais utilizados: 
- Bico de Bunsen 
- Agulha bacteriológica 
- Placa de Petri já semeada 
- Tubo com TSI estéril 
 
Roteiro: 
- Prenda o cabelo, retire relógio, pulseira, anéis, brincos ou cordões grandes. 
Coloque o jaleco e feche-o; 
- Faça a desinfecção da bancada com álcool 70% e lave corretamente as 
mãos. Coloque as luvas; 
- Certifique-se de que todo o material necessário esteja sobre a bancada; 
- Flambe a agulha e espere esfriar. 
- Na placa de Petri com crescimento bacteriano, pegue uma pequena 
quantidade de micro-organismos da colônia que estiver isolada; 
- Pegue o tubo com TSI, abra-o da forma correta, flame a boca e introduza a 
agulha, de modo a fazer a semeadura em profundidade (em apenas 2/3 do 
meio); 
- Ao retirar a agulha do meio, não retire-a do tudo. Faça a semeadura também 
no bizel, em estria sinuosa; 
- Retire a agulha, flambe o tubo e feche; 
- Flambe a agulha; 
- Feche o bico de Bunsen, limpe a bancada, retire as luvas e lave as mãos. 
 
Após o período de incubação, poderão ser observadas as seguintes leituras: 
- Fermentação apenas da glicose: ocorre acidificação na base do meio, virando 
para amarelo, e a região próxima ao bizel permanecerá vermelha (reações de 
oxidação); 
- Fermentação de dois ou três carboidratos: ocorre a acidificação de todo o 
meio, tornando-o inteiramente amarelo. 
- Produção de H2S: de fácil visualização, pois caracteriza-se pela presença de 
partes pretas no meio de cultura, ou todo ele enegrecido. 
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- Produção de outro gás (que não o H2S): ocorre a quebra do meio, seu 
descolamento do fundo do tubo, ou poderá ser observado pela presença de 
bolhas. 
 
Ilustração dos possíveis resultados: 
 
Figura 15.1: Em A houve fermentação da glicose, sem produção de gás; Em B houve 
fermentação de dois ou três dos carboidratos, com produção de gás, não sendo H2S; Em C 
houve a fermentação de dois ou três carboidratos, sem produção de gás; Em D e em F 
podemos observar a fermentação da glicose com produção de H2S em diferentes proporções; 
Em E, a cor original do meio, indicando que não houve fermentação de nenhum carboidrato; 
Em G houve fermentação da glicose com produção de gás, não sendo H2S. 
2- Teste de Oxidação-Fermentação (OF) 
Diferencia as bactérias de acordo com sua capacidade em oxidar (aeróbias) 
ou fermentar (anaeróbias) o meio em que estão inseridas. Este teste permite a 
diferenciação, dentre os Gram negativos, em aeróbios estritos (Pseudomonas 
aeruginosa) e os anaeróbios facultativos (Escherichia coli), por exemplo, pois o 
meio de cultura utilizado será sempre em par, ou seja, dois tubos, um contendo 
óleo na sua superfície, criando um ambiente anaeróbio, e outro sem óleo, 
permitindo a passagem de oxigênio, sendo, portanto, um meio aeróbio. Isso se 
torna possível, pois nas duas vias metabólicas ocorre a produção de ácido a 
partir da quebra do carboidrato. 
O meio mais utilizado, o OF, é semi-sólido e apresenta baixa concentração 
de peptona para limitar a produção de produtos alcalinos, que poderiam 
neutralizar o ácido produzido a partir do metabolismo microbiano. A glicose é 
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normalmente o carboidrato de escolha, sendo incorporada em altas 
concentrações, o que permite sua utilização e, com isso, a acidificação do 
meio, que contem um indicador de pH, dessa vez o azul de bromotimol, que 
inicialmente é verde em pH neutro e se torna amarelo em pH ácido. 
 
Materiais utilizados: 
- Bico de Bunsen 
- Agulha bacteriológica 
- Placa de Petri com crescimento bacteriano 
- Dois tubos com meio OF estéreis, um deles contendo de 2 a 3 mL de óleo 
mineral 
Roteiro: 
- Prenda o cabelo, retire relógio, pulseira, anéis, brincos ou cordões grandes. 
Coloque o jaleco e feche-o; 
- Faça a desinfecção da bancada com álcool 70% e lave corretamente as 
mãos. Coloque as luvas; 
- Certifique-se de que todo o material necessário esteja sobre a bancada; 
- Flambe a agulha. Pegue a placa de Petri e retire uma pequena porção da 
colônia que estiver isolada; 
- Pegue primeiro o tubo sem óleo, abra-o e flambe. Introduza a agulha e faça 
semeadura em profundidade (2/3 do meio), flambe e feche; 
- Pegue a placa de Petri novamente e retire um pouco mais de bactérias (a 
mesma semeada no primeiro tubo); 
- Agora use o tubo com óleo. Abra-o, flambe e faça a semeadura em 
profundidade (2/3 do meio). Retire a agulha, flambe o tubo novamente e feche; 
- Flambe a agulha (é normal que faça barulho, devido a presença do óleo); 
- Feche o bico de Bunsen, limpe a bancada, tire as luvas e lave as mãos. 
 
 
 
 
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Após o período de incubação, poderão ser observadas as seguintes leituras: 
- Meio com óleo (fermentação) amarelo e sem óleo (oxidação) verde: a bactéria 
é capaz de fermentar, mas não de oxidar a glicose presente no meio 
(anaeróbia); 
- Meios com e sem óleo amarelos: a bactéria é capaz tanto de fermentar 
quanto de oxidar (anaeróbia facultativa); 
- Meio com óleo verde e sem óleo amarelo: a bactéria não é capaz de 
fermentar, mas é capaz de oxidar (aeróbia). 
- Meios com e sem óleo verdes: não houve nem fermentação, nem oxidação 
(bactérias inertes). 
Ilustração dos possíveis resultados: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 A BFigura 15.2: (A) Primeiro conjunto de tubos: a bactéria foi capaz de oxidar, mas não de 
fermentar (basta a viragem de uma pequena parte do meio para caracterizá-lo como positivo); 
(B) Segundo conjunto de tubos: a bactéria foi capaz tanto de oxidar quanto de fermentar a 
glicose presente no meio. 
 
3- Teste de utilização do citrato 
Algumas bactérias são capazes de obter energia a partir da utilização do 
citrato como única fonte de carbono. O citrato é uma molécula orgânica, 
presente no ciclo de Krebs (ela permite que o Acetil-CoA entre no ciclo e, por 
isso, pode ser utilizada como molécula doadora de energia). 
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Essa utilização ocorre quando o meio não possui nenhuma fonte de 
carboidrato presente, sendo o mais utilizado o ágar Citrato de Simmons. Ele é 
um meio sólido em tubo que apresenta o indicador de pH azul de bromotimol. 
Porém, não ficará amarelo, pois não ocorrerá a acidificação do meio, mas sim, 
alcalinização. As bactérias, ao utilizarem o citrato, liberam grandes quantidades 
de gás carbônico (CO2), que reagem com o sódio (Na+) e a água (H2O), 
formando compostos alcalinos, como o carbonato de sódio (Na2CO3), 
aumentando o pH do meio, tornando-o azul. 
Uma vez que a utilização do citrato é um processo aeróbico, o inóculo 
deverá ser semeado apenas na superfície do bizel. 
Devemos observar ainda que, grandes quantidades de inóculo fazem com 
que ocorra acúmulo de compostos orgânicos proveniente da parede celular de 
bactérias mortas, que podem liberar carbono e nitrogênio suficientes para 
alcalinizar o meio e produzir um resultado falso-positivo. Portanto, é 
imprescindível que se inocule pouca quantidade de micro-organismos, através 
de semeadura por estria reta. 
 
Materiais utilizados: 
- Bico de Bunsen 
- Agulha bacteriológica (pode ser feito com alça, porém tomando cuidado para 
que não seja colhido grande quantidade de bactérias) 
- Placa de Petri com crescimento bacteriano 
- Meio Citrato de Simmons 
 
Roteiro: 
- Prenda o cabelo, retire relógio, pulseira, anéis, brincos ou cordões grandes. 
Coloque o jaleco e feche-o; 
- Faça a desinfecção da bancada com álcool 70% e lave corretamente as 
mãos. Coloque as luvas; 
- Certifique-se de que todo o material necessário esteja sobre a bancada; 
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- Flambe a agulha e espere esfriar. Pegue a placa de Petri e encoste 
levemente em uma colônia isolada; 
- Pegue o tubo com o meio Citrato de Simmons, abra-o e flambe. Introduza a 
agulha e faça uma estria reta na superfície do bizel, com cautela para que o 
ágar não seja rasgado; 
- Retire a agulha, flambe o tubo e feche; 
- Flambe a agulha; 
- Feche o bico de Bunsen, limpe a bancada, retire as luvas e lave as mãos. 
 
Após o período de incubação, poderão ser observadas as seguintes leituras: 
- As bactérias que utilizarem o citrato irão alcalinizar o meio, tornando-o azul. 
Todo o ágar poderá se tornar azul, ou apenas parte dele (a superfície), mas já 
será o suficiente para constatar a positividade do teste. 
- Caso o ágar mantenha sua coloração original (verde), significa que a bactéria 
não foi capaz de metabolizar o citrato, portanto, não houve produção de 
compostos nitrogenados, não havendo a viragem do meio. 
Ilustração dos possíveis resultados: 
 
 A B 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 15.3: Meio Citrato de Simmons, positivo em azul (A) e negativo em sua cor original, 
verde (B). 
 
 
 
 
 
 
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4- Teste de motilidade e produção de indol 
Apesar da motilidade não ser uma prova bioquímica, nos permite identificar 
e diferenciar bactérias flageladas e não flageladas. Um meio muito utilizado 
para essa finalidade é o SIM, pois como se trata de um meio semi-sólido, 
permite que bactérias consigam se movimentar. 
Já o teste do indol é utilizado para caracterizar, ou identificar, bactérias 
entéricas que são capazes de produzir o Indol a partir da oxidação do 
triptofano. Quando os micro-organismos possuem a enzima triptofanase, 
metabolizam o triptofano presente no meio, convertendo-o em indol, amônia e 
ácido pirúvico, sendo esses dois últimos utilizados pela bactéria para a 
obtenção de energia. Isso nos permite diferenciar os micro-organismos indol 
positivos (Escherichia coli e Proteus spp.) dos indol negativos (Enterobacter 
spp. e Klebsiella spp.). 
Para a detecção do indol, utiliza-se o reagente de Kovacs, pingando de 2-3 
gotas sobre a superfície do meio. Em alguns instantes, caso haja presença de 
indol, haverá a formação de um halo corado (rosa ou vermelho) no lugar do 
reativo. Se não houver, o reagente continuará com sua cor de origem, tratando-
se, portanto, de um organismo indol negativo. 
 
 
 A B 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 15.4: Representação da dição do reagente de Kovacs para visualização da 
produção de indol, sendo positivo em A e negativo em B. 
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 O meio SIM também indica a produção de H2S, pois possui o citrato 
ferroso de amônio e o tiossulfato de sódio, que reagem com o gás formando 
um composto enegrecido. 
 
Materiais utilizados: 
- Bico de Bunsen 
- Agulha bacteriológica 
- Placa de Petri com crescimento bacteriano 
- Meio SIM 
- Reagente de Kovacs 
 
Roteiro: 
- Prenda o cabelo, retire relógio, pulseira, anéis, brincos ou cordões grandes. 
Coloque o jaleco e feche-o; 
- Faça a desinfecção da bancada com álcool 70% e lave corretamente as 
mãos. Coloque as luvas; 
- Certifique-se de que todo o material necessário esteja sobre a bancada; 
- Flambe a agulha de inoculação até que chegue ao rubro. Espere esfriar; 
- Pegue a placa de Petri e retire uma pequena parte da colônia que estiver 
isolada; 
- Pegue o tubo com o meio SIM, abra-o da maneira correta, utilizando o dedo 
mínimo, flambe a boca e introduza a agulha, fazendo semeadura em 
profundidade (2/3 do ágar). Flambe novamente e feche; 
- Flambe a agulha, desligue o gás, limpe a bancada e lave as mãos. 
 
Após o período de incubação, poderão ser observadas as seguintes leituras: 
- Caso o meio apresente turbidez ao redor do inóculo, ou em todo o ágar, 
significa que a bactéria possui motilidade. Caso esteja com indicação de 
crescimento apenas na área de inoculação, não houve motilidade, portanto, a 
bactéria não possui flagelos; 
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- Caso alguma parte do meio esteja enegrecida, ou todo ele, significa que a 
bactéria produziu H2S como produto de seu metabolismo. Caso contrário, não 
houve produção de sulfeto; 
- Após a adição do reagente de Kovacs, caso o líquido se torne rosado após 
alguns segundos, indica que o micro-organismo produziu indol. Se permanecer 
em sua cor original, não houve a produção de indol. 
 
Ilustração dos possíveis resultados: 
 
 
 A B C D 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 15.5: Alguns dos possíveis resultados obtidos com o meio SIM. Em (A) e (B) micro-
organismoimóvel, não produtor de H2S, sendo o (A) indol positivo e o (B) indol negativo. Em 
(C) micro-organismo móvel, produtor de indol e H2S e em (D) micro-organismo móvel, não 
produtor de indol e nem de H2S (Mot: motilidade). 
 
 
 
 
 
 
 
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 Exercícios para fixação: 
1- Como devemos proceder com a semeadura no meio Citrato de 
Simmons? Por quais motivos? 
2- O meio OF possui apenas uma fonte de nutriente. Cite qual é e diga 
quais testes são revelados com a utilização desse meio de cultura. 
3- Quais são os possíveis resultados obtidos a partir do ágar TSI? 
4- De qual maneira é revelado a produção de indol no meio SIM? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Anotações