Microscopia Confocal

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Microscopia Confocal
Pedro Vinícius Martins
Thatyanne Oliveira
Raynara Sousa
Nathalia Murielle
Ana Beatriz
Paloma Araújo 
Dayanne Lopes
Sasha Mendes
Angel Izar
Lucas Barros 
Carlos Henrique 
INTEGRANTES:
	O desenvolvimento do Microscópio Confocal foi impulsionado, em grande parte, pelo desejo de se obter uma imagem de eventos biológicos que ocorrem in vivo.
A invenção deste objeto é atribuída a Marvin Minsky que, em 1955, enquanto estudante de pós-doutoramento na Universidade de Harvard, construiu um microscópio com o objetivo de obter uma imagem de redes neurais, utilizando preparações não coradas de tecido cerebral vivo. Todos os Microscópios Confocais modernos empregam o mesmo princípio da imaginologia confocal patenteada em 1957.
Na sequência do trabalho de Marvin Minsky, surgem M. David Egger e Mojmir Petran, no final dos anos 1960, que fabricam um Microscópio Confocal de feixes múltiplos, onde utilizaram um disco giratório (disco de Nipkow) para examinar secções de tecido cerebral não corado e células ganglionares.
Aplicações:
Observação do estado fisiológico das células e tecidos
Construção de imagens em 3D
Colocalização
 
Observação de células e tecidos marcados com fluorocromos por imunofluorescência
Possibilita a eliminação de informações fora de foco da imagem
Favorece a aquisição de amostras mais espessas, como biofilmes bacterianos, tecidos dentários e dentre outros tipos celulares.
Aquisição da imagem:
Iluminação por varredura a laser de um espécime biológico normalmente tratado com compostos fluorescentes.
A luz refletida pela amostra atravessa uma abertura mecânica ou íris (pinhole) que bloqueia feixes provenientes de pontos acima e abaixo do plano focal.
A luz chega a um detector (de regra um fotomultiplicador), apenas a luz originada em um único plano focal é observada.
Uma tomografia do especime.
Princípios Físicos do Funcionamento do Microscópio Confocal:
Existem três tipos de Microscópios Confocais comercialmente disponíveis: 
(1) o Confocal Laser Scanning Microscope (LSCM), o modelo mais utilizado devido à elevada qualidade de imagem que permite a obtenção de imagens de alta resolução através de cortes ópticos, posteriormente agrupados para se fazer a reconstrução tridimensional da topografia de objetos complexos.
(2) o Spinning-Disk Confocal Microscope, com um disco de Nipkow, cujo rácio de construção é mais rápido e eficaz que o LSCM, sendo, por isso, útil em observações dinâmicas;
(3) o Programmable Array Microscope (PAM).
O sistema óptico usado neste tipo de Microscópios é o mesmo que é aplicado nos Microscópios de Fluorescência. No entanto, nestes últimos, o campo é todo iluminado, enquanto que no Microscópio Confocal focaliza somente um ponto em determinada profundidade no espécime.
Constituição:
Laser (fonte de luz);
Scanner (move o laser de modo a focalizar a amostra linha por linha);
Z control (foca a amostra e faz a aquisição dos ‘’cortes’’);
Fotomultiplicadores (detectar os fotões emitidos e/ou refletidos pela amostra);
Pinhole (orifício de abertura);
Beam Splitter (ou via de fluorescência);
Objetivas (formação óptica da imagem);
Laser 
Monocromática: possui um comprimento de onda específico de luz, o que vai resultar numa cor específica;
Coerente ou "organizada" : cada fóton move-se juntamente com restantes. Todos os fótons possuem frentes iniciadas simultaneamente;
Direcionada: Possui um feixe estreito e concentrado, contrariamente a outras fontes de luz que produzem dispersão;
Intensa.
Preparação da amostra:
É imprescindível ter em consideração quais os métodos de preparação ideais. No caso da Microscopia Confocal as amostras podem ser organismos vivos, culturas celulares, amostras fixadas, cortes histológicos de rotina, sendo as técnicas adequadas ao tipo de amostra e procedimento.
A fixação mais comum é o Paraformaldeído a 4% tamponado;
A amostra deve ser submersa em fixador com ligeira agitação;
A espessura dos cortes histológicos depende da distância de trabalho de cada alvo, da penetrabilidade do anticorpo ou do fluorocromo utilizado para coloração e das propriedades de transparência do tecido que forma a amostra.
O tempo de observação deve ser limitado, uma vez que os radicais livres que são produzidos durante o tempo de excitação dos fluorocromos danificam as células e tecidos não fixados.
As amostras devem ser protegidas da luz, analisadas rapidamente e armazenadas no frio.
SOLUÇÃO DO SISTEMA: 
 
Para pesquisas de células vivas de rotina, o sistema confocal de escaneamento a laser C1 em um  microscópio invertido da série TE2000 com CLEM, PFS e incubador de controle de ambiente. Para imagem de células vivas avançadas, de alta resolução e tecnologia avançada, o sistema confocal de varredura de campo LiveScan da Nikon com o microscópio invertido TE2000-PFS com portas de laser múltiplo, incubador de controle de ambiente e estágio Piezo.
Referencias:
http://www.fop.unicamp.br/index.php/pt-br/cmi-equipamentos/cmi-confocal
https://pt.wikipedia.org/wiki/Microscopia_confocal
https://www.researchgate.net/publication/299389995_Microscopia_Confocal_Aplicada_as_Ciencias_Biologicas_Basicas
https://www.nikoninstruments.com/pr_BR/Aprender-Explorar/Tecnicas/Confocal