Relatório: VELOCIDADE DAS REAÇÕES ENZIMÁTICAS

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UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA
Campus da Grande Florianópolis - Unidade Pedra Branca
Curso de Engenharia Química - Bioquímica das Fermentações
Profª Elisa Helena Siegel Moecke
Alunas: Caroline Moredo Ambrosio, Luiza Mendonça, Jéssica Schaefer Chaves
VELOCIDADE DAS REAÇÕES ENZIMÁTICAS
1. INTRODUÇÃO
A Universidade Nova de Lisboa afirma que a catalase é uma proteína enzimática que catalisa reações químicas. Ela se encontra em praticamente todos os organismos vivos e tem a função de decompor o peróxido de hidrogênio, como mostra a equação 1:
2 H2O2 2 H2O + O2 									(Equação 1)
A decomposição do H2O2 ocorre em duas etapas, conforme relatado por Chelikani et al., (2004) e representado através da equação abaixo (Equação 2). Quando H2O2 entra no sítio ativo da catalase, ela interage com aminoácidos e então é quebrada. O átomo de oxigênio se liga ao ferro do grupo heme e uma molécula de agua (H2O) é liberada. Em seguida, uma segunda molécula de H2O2 é quebrada, então a nova molécula de oxigênio irá se ligar à outra anteriormente ligada ao ferro. Logo, gás oxigênio (O2) e água (H2O) são liberados. 
2 H2O2 + CATALASE 2 H2O + O2							(Equação 2)
A atividade enzimática aumenta com a temperatura e as colisões entre o substrato e o centro ativo da enzima são cada vez mais frequentes. Na maioria das enzimas a sua atividade máxima ocorre aos 37ºC. 
Se acima desta temperatura, ocorre a diminuição da atividade enzimática. Ocorre a desnaturação da enzima, ou seja, a sua perda permanente de atividade biológica. Se em temperatura baixa, ao invés de decompor, a enzima fica inativa podendo ser reativada por meio de aumento de temperatura. (MARTINS, 2006)
Uma substancia capaz de interferir na taxa de uma reação de catalise enzimática é chamado de Inibidor enzimático. Esses processos se dividem em dois tipos: reversível e irreversível. Basicamente, sua diferença se encontra na formação do complexo “enzima-inibidor”, que dependendo do processo pode ser desfeito por diluição ou diálise. (MARQUES, P. R. B. O., YAMANAKA, H., 2008)
Os inibidores reversíveis são divididos em competitivos e não competitivos. Os “competitivos” são aqueles que se assemelham ao substrato, ocupando sítio ativo, podendo atingir uma velocidade máxima. Os “não competitivos” são aqueles que, ao contrário dos competitivos, não se assemelham ao substrato ocupando um sítio diferente do ativo, estes não conseguem atingir a velocidade máxima. Já os inibidores irreversíveis são aqueles que se ligam as enzimas com uma grande afinidade e não apresentam um equilíbrio de ligação. (BIANCONI, L. 2006)
Presentes nos alimentos, as reações enzimáticas se mostram de extrema importância. Pode-se exemplificar falando sobre o amaciamento da carne, resultado da adição da enzima bromelina. Também pode-se citar o escurecimento das frutas quando expostos ao O2, a enzima responsável é a polifenoloxidase. (NEVES, V. A., SOUZA, K. A. F. D., 2005)
 
2. OBJETIVOS
Analisar a velocidade das reações enzimáticas em diferentes ambientes, verificar a alteração ocorrida em temperaturas distintas, uso de inibidores e especificidade das enzimas. 
3. MATERIAL
4 tubos de ensaio
Pipeta graduada de 5 mL
Proveta pequena
Suporte universal
Argola metálica
Funil
Papel filtro
Béquer de 400 ou 500mL
Banho termostatizado
Termômetro
Gelo
Frasco lavador
Conta gotas
Régua
Água destilada
Sulfato de cobre 0,1M
3 batatas médias - extrato de batata
Fenol 0,010 M
1,4 ciclohexanodiol 0,01M
Catecol 0,01M
4. METODOLOGIA
4.1 Extrações da catalase e da polifenoloxidase
Foram descascadas e cortadas em rodelas finas 3 batatas médias, colocou-as em um liquidificador com 150 mL de água. Deixou-se bater por 5 minutos para partir as células e liberar a catalase e a polifenoloxidase. Depois de bem batido, filtrou-se o material numa peneira e depois com papel filtro. Utilizou-se o extrato logo após ter sido filtrado.
Ações da catalase
4.2.1. Efeito da temperatura
Com uma pipeta mediu-se 3 mL de H2O2 a 3 % e colocou-se num tubo de ensaio. Com a ajuda de uma pipeta, colocou-se 3 mL de extrato de batata (solução contendo catalase) em um outro tubo. Em seguida colocaram-se os dois tubos em um banho termostatizado a 37ºC por 5 minutos. Identificaram-se os dois tubos. Misturou-se então o conteúdo dos dois tubos adicionando a catalase sobre o H2O2. Agitou-se levemente uma vez para misturar e colocou-se o tubo de volta no banho por 5 minutos. Decorridos 5 minutos, retirou-se o tubo do banho e anotou-se a altura da espuma formada com o auxílio de uma régua.
Mediu-se novamente 3 mL de H2O2 3 %, à temperatura ambiente, e colocou-se em um tubo de ensaio. Em seguida adicionou-se no mesmo tubo 3 mL da solução da catalase. Agitou-se levemente uma vez para misturar. Anotou-se a altura da espuma a cada minuto até 5 minutos. Após esse tempo, mediu-se a temperatura da solução.
Colocou-se 5 mL de H2O2 3% em um tubo de ensaio e 3 mL de solução da catalase em outro tubo. Os tubos foram colocados em um béquer com gelo e um pouco d’água por 5 minutos. Misturou-se o conteúdo dos dois tubos adicionando a catalase sobre a H2O2. Agitou-se levemente para misturar e anotou-se a altura da espuma a cada minuto, até 5 minutos. Em seguida mediu-se a temperatura da solução.
Repetiu-se o procedimento nº 1 utilizando H2O2 e a catalase aquecidas a 70-80 ºC. Mediu-se a altura da espuma após 5 minutos.
Efeito do inibidor
Com uma pipeta foi adicionado 3 mL de H2O2 em um tubo de ensaio e 3 mL de catalase em outro tubo. No tubo da catalase adicionaram-se 5 gotas de sulfato de cobre 0,1 M.
Misturou-se o conteúdo dos dois tubos e a altura da espuma foi medida após 5 minutos.
 
4.3 Especificidades das enzimas
Utilizou-se uma enzima extraída da batata, a polifenoloxidase, que está presente no extrato da batata.
Rotularam-se quatro tubos de ensaio e preparou-se da seguinte maneira: 
Tubo nº 1: 10 gotas de água destilada;
Tubo nº 2: 10 gotas de solução 0,01M de fenol;
Tubo nº 3: 10 gotas de solução 0,01M de 1,4-ciclohexanodiol; 
Tubo nº 4: 10 gotas de solução 0,01M de catecol.
Adicionou-se 3mL de extrato da batata em cada um dos quatro tubos de ensaio, agitou-se levemente. Aguardaram-se 10 minutos e observou-se em qual dos tubos de ensaio apareceu uma cor vermelho escura. 
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Efeito da Temperatura
Quando expostas a baixas temperaturas as enzimas ficaram inativas, pois o seu sítio ativo se comprimiu. Conforme ocorreu o aumento da temperatura, os sítios ativos enzimáticos (que antes estavam em forma de novelo) se abriram, facilitando a entrada do peróxido de hidrogênio que interagiu com os aminoácidos do sitio ativo, liberando água e gás carbônico, que causou a formação de espuma. 
Quando submetidas a temperaturas acima de 70 °C, não houve ação enzimática, pois ocorreu a desnaturação da enzima. Elevadas temperaturas causam a alteração da sua estrutura tridimensional, o que afeta sua atividade biológica. Desta forma, não ocorreu formação de espuma ao levar a catalase a um aquecimento acima de 70°C. 
A maioria das enzimas tem como temperatura ideal aproximadamente 30°C, que após 5 minutos, foi onde teve maior altura de espuma, resultando em 10,5 cm de espuma formada pela liberação do CO2. 
A tabela 1 mostra os resultados obtidos com cada experimento realizado:
 Tabela 1. Efeito da Temperatura
	
	Tempo (minutos)
	
	1
	2
	3
	4
	5
	Altura da espuma produzida devido à liberação de O2, T= 37ºC.
	
	
	
	
	6,7 cm
	Altura da espuma a temperatura ambiente, T= 29ºC.
	7,5 cm
	8,6 cm
	9,3 cm
	9,9 cm
	10,5 cm
	Altura da espuma a temperatura baixa, T= 2ºC.
	3,5 cm
	4,2 cm
	4,2 cm
	4,3 cm
	4,3 cm
	Altura da espuma a temperatura no intervalo de 70 a 80 °C.
	
	
	
	
	0 (sem espuma)
Fonte: Acervo do autor (2018).
Efeito do Inibidor
O inibidor não permite que o substrato se ligue ao sitio ativo da enzima. O sulfato de cobre é um inibidor competitivo. Ele se assemelha ao substrato e ocupa seu lugar no sítioativo. Desta forma, ocorreu uma interação muito pequena ao colocar a solução de Sulfato de Cobre junto a catalase, pois como o sulfato é uma espécie de inibidor competitivo, isto é, de forma resumida, ele ocupa o sitio ativo da enzima, impedindo que o peroxido de hidrogênio se ligue, não ocorrendo então a reação, ou ocorrendo minimamente. 
A tabela 2 mostra o resultado obtido com o experimento:
 
Tabela 2. Efeito do Inibidor
	
	Tempo: 5 minutos
	Altura da espuma a temperatura ambiente, T= 23ºC.	
	0,4 cm.
Fonte: Acervo do autor (2018).
Especificidade das Enzimas
Além da catalase, a batata possui a enzima polifenoloxidase, sendo esta responsável pelo escurecimento do vegetal quando exposto ao ar. Esse escurecimento enzimático baseia-se na oxidação de compostos difenólicos (duas hidroxilas ligadas ao anel benzênico). De todos os substratos de estudo, o único que apresentou mudança de coloração foi na reação da enzima do polifenoloxidase (PPO) mais oxigênio com o catecol, formando a quinona que em presença de água acaba por oxidar e formar a melanina, responsável pelo escurecimento. A figura 1 apresenta a reação para formação da melanina. 
Figura 1. Reação de oxidação, formação da melanina.
Fonte: Reproduzido de SANTOS, V., ARAÚJO, W., et al. (2012).
A tabela 3 apresenta as cores obtidas de acordo com as soluções:
Tabela 3. Especificidade das Enzimas
	Tubo
	Solução
	Cor
	1
	10 gotas de água destilada
	Amarelo claro
	2
	10 gotas de solução 0,010M de fenol
	Amarelo claro
	3
	10 gotas de solução 0,01M de 1,4-ciclohexanodiol
	Amarelo claro
	4
	10 gotas de solução 0,010M de catecol
	Marrom claro
Fonte: Acervo do autor (2018).
6. CONCLUSÃO
O aumento de temperatura aumenta a taxa de reação enzimática devido ao aumento de energia cinética das moléculas participantes da reação, desta forma, a catalase agiu menos quanto submetida a baixas temperaturas do que quando expostas a temperaturas elevadas devido à ação enzimática junto à temperatura. Ocorreu uma interação muito pequena do sulfato de cobre contido no PPO junto à catalase, pois já que o sulfato é uma espécie de inibidor competitivo ele ocupa o sitio ativo da enzima, impedindo que o peroxido de hidrogênio se ligue. Além da catalase, a batata possui a enzima polifenoloxidase e de todos os substratos de estudo, o único que apresentou mudança de coloração foi na reação da enzima PPO com o catecol, resultando na quinona que reagindo com água forma a melanina, que são os compostos responsáveis pelo desenvolvimento da coloração escura.
7. REFERÊNCIAS
BIANCONI, L. Efeito de Inibidores na Atividade Enzimática. Universidade Federal do Rio de Janeiro. 2006. Disponível em <http://www2.bioqmed.ufrj.br/enzimas/inibidores.htm> Acesso: 14/04/2018.
Chelikani, P., Fita, I., Loewen, P.C. Diversity of structures and properties among catalases. Cellular and Molecular Life Sciences 61, 192-208, 2004. 
Estudo cinético da catalase isolada a partir de batata. Apostila. Faculdade de Ciências e Tecnologia – Universidade Nova de Lisboa. Grupo de Bioquímica Física de Proteínas, Lab 613/617. Disponível em <https://www.dq.fct.unl.pt/sites/www.dq.fct.unl.pt/files/catalase.pdf> Acesso: 01/04/2018.
MARQUES, P. R. B. O., YAMANAKA, H. Biossensores baseados no processo de inibição enzimática. Quím. Nova, 2008, vol.31, n.7, pp.1791-1799. ISSN 0100-4042.
NEVES, V. A., SOUZA, K. A. F. D. Extração e caracterização de enzimas. Experimentos de Bioquímica. Universidade do Estado de São Paulo. 2005. Disponível em: <http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/enzimas.htm> Acesso: 14/04/2018.
SANTOS, V., ARAÚJO, W., et al. Escurecimento enzimático em frutas. VII Congresso norte nordeste de pesquisa e inovação. 2012. ISBN 978-85-62830-10-5. Disponível em: < http://propi.ifto.edu.br/ocs/index.php/connepi/vii/paper/viewFile/1094/2837> Acesso: 14/04/2018.
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