15_Mutacoes em bacterias

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Modificação da informação genética (II)
Principais mecanismos que geram variabilidade genética nas bactérias e 
contribuem para o processo de evolução:
. Mutação
. Transposição
. Transferência de genes ( veiculada por plasmídeos ou bacteriófagos)
. Recombinações entre regiões das moléculas do DNA
Como surgem as mutações ?
• Espontâneas
– na ausência de qualquer agente mutagénico
– aleatórias; podem resultar de erros durante a replicação do 
DNA
– Baixa frequência: ~ 10-8 por par de nucleótidos e por
geração
• Induzidas
– Desenvolvem-se após exposição a um agente mutagénico, 
que aumenta a frequência de mutação.
Mutação- qualquer alteração permanente de uma sequência de
bases do DNA, mesmo que não tenha efeito detectável no fenótipo.
Pode levar ao estabelecimento de uma subpopulação. 
Teste de Ames – usado para despistar a potencial acção mutagénica de compostos 
químicos (por exemplo, compostos aditivos de alimentos ou cosméticos, pesticidas, etc.); 
recorre a mutantes auxotóficos de bactérias (ex. Mutante His- de Salmolella sp.). 
Neste teste, é analisada a frequência de reversão das células de mutante auxotrófico a 
prototróficas por acção do composto a testar. 
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Teste de Ames- detecção de compostos mutagénicos
Placa controlo
(colónias de revertentes espontâneos)
Placa onde foi introduzido o 
possível agente mutagénico –
maior nº de colónias prototróficas 
em relação à histidina 
do que na placa controlo
Estirpe ou clone- uma população de células geneticamente idênticas
Gene- um fragmento de DNA em que a sequência de bases, após 
transcrição e tradução, origina uma proteína com uma sequência de 
aminoácidos bem definida
Genoma- conjunto de todos os genes de um organismo. 
Genótipo- conjunto de genes específico que um organismo possui.
(Ex. his, his-)
- gene hisC (codifica para proteína HisC); hisC-
Fenótipo- propriedade observável. A expressão fenotípica é profundamente 
influenciada por factores ambientais.
Ex. Estirpe His+ versus estirpe His-
→→→→
Mutação espontânea
Tautomerismo de bases-
resulta de erros na replicação 
do DNA devido à incorporação 
de nucleótidos contendo for-
mas tautoméricas raras das 
bases.
Os níveis de mutação espontânea
são controlados pela actividade 
de polimerases 5´-3´ e 
exonucleases 3´-5´
(reconhecimento e reparação
de erros durante a replicação
do DNA)
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Mutação espontânea por transição
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Neste tipo de mutação uma purina é substituída por outra purina 
diferente (ou uma pirimidina por outra pirimidina diferente)
ex: G A
C T
Neste tipo de mutação uma purina é substituída por outra purina 
diferente (ou uma pirimidina por outra pirimidina diferente)
ex: G A
C T
Outras causas de mutações espontâneas:
- radicais de oxigénio (p.ex. Guanina →→→→ 8-Hidroxiguanina)
Mutação 
pontual
Adição e eliminação de bases
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Seta azul –
indica a direcção da 
replicação
Hipotéticamente, pode ocorrer
um escorregamento numa das
cadeias (cadeia em formação 
ou parental) que leva à
formação de um “laço”
estabilizado por ligações de –H-
A continuação da replicação
de DNA leva à adição ou remoção
de nucleotídeo(s), respectivamente.
Adição de 1 T 
Eliminação de 2 Ts
Transposição
- requer a enzima transposase e extremidades contendo sequências de repetição 
invertida (IR); recombinação não-homóloga
- em células do tipo procariótico e do tipo procariótico
- sequências de inserção são transposões simples
Transposões complexos – podem transportar genes diversos (p.ex. Genes que conferem resistência a 
antibióticos ou a metais pesados, genes que codificam para toxinas, etc)
(~750 – 1600 bp)
Tn-5
Tn-10
Canamicina (resistência)
Tetraciclina (resistência)
Tn-1681 →→→→ Heat-stable enterotoxin formation (virulência)
A mutação pode ocorrer por inserção de uma sequência de inserção ou de um 
transposão complexo dentro da sequência codificante de um gene ou na sua 
região reguladora.
Consequências possíveis:
- paragem prematura da tradução por introdução de um codão „stop“;
- interrupção da sequência codificadora de um gene;
- activação da transcrição de um gene (o transposão pode transportar uma região reguladora);
- transferência de genes para plasmídeos, ou de plasmídeos para o cromossoma;
(P.ex. Os transposões complexos que transportam genes de resistência a antibióticos 
podem contribui para a criação de plasmídeos R e para a disseminação 
deste fenómeno entre bactérias)
Efeito das mutações ao nível das proteínas
Mutação "missense"
Molécula de DNA
normal
⇒⇒⇒⇒ Proteína normal
Mutação pontual num 
codão pode levar à substituição 
de um aminoácido por outro, 
resultando numa proteína
diferente (p.ex. inactiva)
Mutação "nonsense“
(sem sentido)
Origina o aparecimento
de um codão STOP, tendo
como consequência a produção
de uma proteína truncada, 
sem actividade 
Mutação "frameshift„
(mutação desfasada)
A adição ou eliminação de
pares de bases não múltiplos
de 3, leva à alteração da gre-
lha de leitura aberta do 
segmento de DNA que 
codifica para uma proteína
Expressão das mutações
A detecção de mutantes numa população microbiana só é posível se as alterações
ocorridas no património genético do microrganismo causar uma alteração de fenótipo
���� "Forward mutation„ (mutação directa)
���� "Reverse mutation" (mutação inversa)
AAA (K, Lys) GAA (E, Glu) AAA (K, Lys)
selvagem mutante selvagem
Forward Reverse
UCC (S, Ser) UGC (C, Cys) AGC (S, Ser)
selvagem mutante selvagem
Forward Reverse
Gene →→→→ gene mutado →→→→ proteína modificada
selvagem „Forward“
Estirpe selvagem →→→→ Mutante
Contudo, a seguir a uma primeira mutação directa, podem seguir-se mutações 
(mutação inversa ou mutação supressão) que restabelecem o genótipo selvagem 
ou um genótipo equivalente ao que existia antes da 1ª mutação 
⇒⇒⇒⇒ restabelecimento do fenótipo original
���� "Suppressor mutation" (mutação supressão)
As mutações de supressão (alteração compensatória) podem restabelecer
o fenótipo original. Podem ser intragénicas ou extragénicas
K S P S L R A
AAG AGU CCA UCA CUU AAU GCC
(-A) (+G)
AAG GUC CAU CAC UUA AUG GCC
K V H H L M A
Selvagem
Mutante
duplo
Ex. mutação supressão intragénica
Mutação silenciosa
Devido à degenerescência do código genético, nem todas as
mutações são expressas fenotipicamente. Em muitos codões,
a modificação na 3a base é uma mutação silenciosa.
GCU GCC, GCA, GCG
A A A A
Mutação neutra
Resulta na codificação de um aminoácido diferente, mas
funcionalmente equivalente 
AAA AGA
K R
Lisina Arginina 
(aminoácidos com cadeias laterais iónicas) 
���� Agentes mutagénicos
����Químicos ����Físicos
Exemplo:
Radiação UV
Mutações induzidas
���� Preparação e selecção de mutantes
Agentes mutagénicos 
- são agentes que aumentam a taxa de mutação (~ 1000 x)
Taxa de mutação- é a probabilidade de haver uma mutação
num gene quando a célula divide. A taxa de mutação espontânea 
num determinado gene é de 10- 8 (1 mutação em cada 108 genes 
que replicam)
• Os agentes mutagénicos são frequentemente usados em laboratório para a
produção de mutantespara investigação ou melhoramento 
de estirpes para fins biotecnológicos
⇒⇒⇒⇒ Selecção de mutantes
• Para fins biotecnológicos, os mutantes obtidos por manipulação 
genética são mais difíceis de aceitar 
�Bioquímicos- levam a alterações 
metabólicas
- Auxotróficos
- Têm mutações em vias metabólicas
- Necessitam de um produto de uma 
via metabólica no meio de cultura, 
porque não são capazes de o sintetizar
- Prototróficos
• Crescem em meio mínimo 
(sem suplementos adicionais)
Exemplos
• Auxotróficos para a síntese de 
aminoácidos, vitaminas, etc.
- Placas réplica com meio de cultura 
completo e meio mínimo
Tipo de mutantes Selecção
Detecção e selecção de mutantes
Mutantes nutricionais (auxotróficos Lys-)
obtidos por réplica plating
"Master plate "
Meio de crescimento 
completo (contendo lisina)
(os mutantes Lys- estão assinalados
com um x)
" Replica plate "
Meio mínimo 
(sem lisina)
Selecção indirecta (negativa)- „replica plating“
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
1) Tratamento com 
agente mutagénico
2) Selecção de mutantes 
auxotróficos para a 
Lisina (Lys-)
A selecção indirecta
permite detectar 
Mutantes bioquímicos e 
mutantes condicionais
Por exemplo, a técnica de 
replica plating
é usada para identificar 
mutantes que perderam a 
capacidade de 
sintetizar um nutriente
essencial (são auxotróficos
em relação a esse nutriente)
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Mutantes nutricionais (auxotróficos Lys-)
obtidos por réplica plating
"Master plate "
Meio de crescimento 
completo (contendo lisina)
(os mutantes Lys- estão assinalados
com um x)
" Replica plate "
Meio mínimo 
(sem lisina)
�Bioquímicos- levam a alterações 
metabólicas
- Auxotróficos
- Têm mutações em vias metabólicas
- Necessitam de um produto de uma 
via metabólica no meio de cultura, 
porque não são capazes de o sintetizar
- Prototróficos
• Crescem em meio mínimo 
(sem suplementos adicionais)
Exemplos
• Auxotróficos para a síntese de 
aminoácidos, vitaminas, etc.
• Deficientes na capacidade de 
fermentar açúcares
- Placas réplica com meio de cultura completo 
e meio mínimo
- Meio contendo um indicador de pH
Tipo de mutantes Selecção
Detecção e selecção de mutantes
Tipo de mutantes Selecção
����Morfológicos
Análise da morfologia colonial
(cor, mucosidade)
Ex: mutantes pigmentados e 
despigmentados de Aspergillus nidulans
���� de Resistência (resistentes) 
Crescimento em meio de cultura que contém 
concentrações seleccionadas do agente de 
resistência (ex. toxina, antibiótico, etc.)
Ex: Desenvolvimento de colónias resistentes
a um antibiótico
Selecção directa
A selecção directa permite
detectar mutantes morfológicos,
mutantes de resistência
e mutantes prototróficos
(a partir de população de 
mutante auxotrófico)
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Teste de Ames – usado para despistar a potencial acção mutagénica de compostos 
químicos (por exemplo, compostos aditivos de alimentos ou cosméticos, pesticidas, etc.); 
recorre a mutantes auxotóficos de bactérias (ex. Mutante His- de Salmolella sp.). 
Neste teste, é analisada a frequência de reversão das células do mutante auxotrófico a 
prototróficas por acção do composto a testar. 
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
���� Exemplos de agentes mutagénicos
����Químicos ����Físicos
Exemplo:
Radiação UV
Incorporação de análogos de bases
Nos análogos de bases 
existe maior frequência 
da forma enol rara
Ex: 5-bromouracilo
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
A molécula de 5-bromouracilo é incorporada no DNA em lugar de
timina, mas muitas vezes emparelha com guanina. O crescimento 
de uma população de células na presença deste análogo origina 
uma descendência de células onde ocorreu substituição de bases
(par A-T →→→→ par G-C).
Agentes alquilantes
Agentes:
Hidroxilamina
Metanossulfonato de etilo (EMS)
Metanossulfonato de metilo (MMS)
N-metil-N´-nitro-N-nitrosoguanidina
Posições de alquilação:
N7 e O6 da guanina
N3 da adenina
O4 da timina
A alquilação de purinas (A, G)
também torna mais lábil a sua 
ligação à desoxirribose 
⇒⇒⇒⇒ depurinação do DNA
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
⇒⇒⇒⇒ Emparelhamento errado de bases
Desaminação oxidativa das bases por acção de HNO2
A adenina é desaminada a 
hipoxantina a qual forma 
ligação com citosina em
vez de timina
A citosina é desaminada a 
uracilo, o qual liga a adenina 
em vez de guanina
A guanina é desaminada a 
xantina, a qual continua a 
emparelhar com citosina, 
mas só por duas ligações de 
hidrogénio
⇒⇒⇒⇒ Ligação mais lábil
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Ácido nitroso como agente mutagénico
A adenina desaminada emparelha com a citosina
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
O ácido nitroso pode ser gerado na água a partir de NO2- (nitrito; poluente da água)
Agentes que se intercalam entre 
as bases da cadeia dupla de DNA
Estes agentes químicos intercalam-se entre as bases do DNA
formando um "laço" numa das cadeias. Quando ocorre replicação,
uma ou mais bases podem ser inseridas ou eliminadas. 
Estes agentes causam mutações do tipo "frameshift".
Exemplos:
-Brometo de etídeo
-Acridina laranja
-Proflavina
Agentes mutagénicos físicos – Radiação UV
Mutantes de interesse são seleccionados 
entre as células sobreviventes.
Vantagem: é eficiente e evita o recurso a 
compostos químicos (que são tóxicos)
Realizar selecção de mutantes na
ausência de luz visível
(mutação pode ser eficientemente
reparada por acção fotoquímica)