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L R infócitos eativos para Analistas Clínicos Linfócitos Reativos PAULO ROBERTO MERISIO PARA ANALISTAS CLÍNICOS Junho de 2017 SUMÁRIO t Olá, este e-book vai ajudar você reconhecer um linfócito reativo e interpretar os significados desta célula. Seja bem vindo!!! Sobre o Autor Paulo Roberto Merisio é Farmacêutico e Bioquímico com Especialização e Mestrado na área de Hematologia. É professor de vários cursos de pós graduação no Brasil e consultor na área de Hematologia Laboratorial. Teve toda sua vivência acadêmica e profissional com foco na Hematologia Laboratorial. Atualmente é diretor da HemoClass – Hematologia e Medicina Diagnóstica, professor da PUCPR – campus Toledo das disciplinas de Hematologia e Estágio em Análises Clínicas e consultor de vários laboratórios de Análises Clínicas no Brasil, Paraguai e Argentina. CAPÍTULO 1 LINFÓCITOS A hematogênese, regida por fatores de crescimento, faz com que as células tronco originem, em um primeiro momento, células progenitoras mielóides e linfoides na medula óssea. Estas últimas, por sua vez, podem originar linfócitos T(LT), linfócitos B(LB) e linfócitos natural killer (NK). Os LT migram da medula óssea para o timo para maturação e após este processo entram em circulação. Já os LB maturam na própria medula, migrando posteriormente para órgãos linfoides secundários. Os NK derivam do mesmo precursor que origina os LT, mas são selecionados após interações específicas. A funcionalidade do LT está relacionada com processos de imunidade celular e na regulação da síntese de anticorpos, o LB participa apenas nos processos de imunidade, sendo o precursor do plasmócito, a principal célula produtora de anticorpos do organismo, e os NK, classificados como uma célula não T e não B, que detêm a propriedade de destruírem células tumorais e células infectadas por vírus, sem terem tido um contato prévio com os antígenos da célula alvo. Alguns autores classificam o NK como sendo um subtipo de LT. Linfogênese CAPÍTULO 2 LINFÓCITOS São células que compõe a principal linha de defesa contra infecções virais e contra o surgimento de tumores. Os LB são células responsáveis pela imunidade humoral porque sintetizam anticorpos. Já os LT podem ser separados em duas subpopulações: Os LT citotóxicos, com ação direta em células infectadas e tumorais, e os LT auxiliadores, que estimulam os LB(LTH2) e também a atividade microbicida dos macrófagos (LTH1). Os linfócitos respondem especificamente à estímulos antigênicos com a produção de anticorpos específicos pelos LB ou por citotoxicidade. Lesões teciduais e a presença de microrganismos também são exemplos de ativação linfocitária por presença de antígeno. A apresentação pode acontecer a nível local ou em órgãos linfoides secundários como linfonodos, placa de Peyer, anel de Waldeyer, baço e fígado. A ativação antígeno-dependente leva à uma ativação do linfócito, estimulando a divisão mitótica dando origem a um clone expandido de linfócitos responsivos. Função LINFÓCITOS Quando um antígeno penetra nos tecidos, isso induz no local, uma reação inflamatória, com atração de leucócitos para a região. Algumas células tem a capacidade de capturar e transportar antígenos para o linfonodo mais próximo. Essas estruturas estão localizadas de modo a cercar os locais de maior probabilidade de entrada de antígenos como sangue, linfa e mucosas. Nos gânglios os macrófagos podem digerir os antígenos e apresentá-los na sua superfície sob uma forma mais reativa. Esse procedimento é importante para a reação a antígenos T dependentes. Os LB não necessitam do processamento. Capturam os antígenos por meio dos seus anticorpos de superfície. Tanto os LT como os LB que reagem à apresentação do antígeno estão previamente programados para reagirem somente contra aquele epítopo. Normalmente, pela presença de vários epítopos nas agregações antigênicas normais, ocorre o aparecimento de vários clones reagentes dando origem à reação policlonal de linfócitos B e T. Função LINFÓCITOS A ativação do LB depende de imunoglobulinas de membrana como IgM e IgD. Estas são a contrapartida dos receptores de LT (TCR) e por analogia são denominados receptores de LB (BCR) em alguns contextos. Já a resposta dos LT frente a antígenos proteicos requer o reconhecimento do antígeno pelos LT auxiliares e sua interação específica com os LB, estimulando a expansão clonal dos LB, mudança de classe, maturação de afinidade e a diferenciação em LB de memória. Apesar das limitações, as células NK apresentam duas estratégias diferentes no reconhecimento de patógenos. A primeira, observada no reconhecimento de bactérias Gram- negativas, ocorre pela sinalização de receptores do tipo Toll (TLR) pelo lipopolissacarídeo bacteriano. A segunda ocorre pelo reconhecimento específico de glicosilceramidas presentes na parede celular bacteriana. Essa última via de sinalização assegura o reconhecimento de patógenos que não apresentam ligantes para TLR em sua parede celular. Função CAPÍTULO 3 LINFÓCITOS Turk, em 1907, relatou uma variante morfológica benigna dos linfócitos em um paciente com mononucleose infecciosa, descrevendo como células mononucleadas granulares. Entretanto Paul Ehrlich, em 1901, já havia descrito como um tipo diferenciado de leucócitos, postulando ainda que estas células não tinham relação com a linhagem mielóide, e que seus precursores se encontravam nos gânglios linfáticos e no baço. Já em 1923, Downey e Mckinlay fazem uma classificação detalhada, baseado na variabilidade morfológica destas células. Alguns autores defendem que os LR são formas intermediárias de ativação dos LT em decorrência de estímulos antigênicos virais, como o que acontece na mononucleose infecciosa. Já a atipia relacionada ao LB corresponde à uma forma intermediária desta célula quando a mesma se diferencia em plasmócito para a produção de anticorpos, citando como exemplo o que acontece em pacientes com dengue. Deste modo pode-se inferir que tanto os LT quanto LB podem adquirir morfologia de linfócitos reativos. Reativos CAPÍTULO 4 LINFÓCITOS REATIVOS Até cerca de 50 anos atrás a função dos linfócitos era pouco conhecida. Descrita por Hewson em 1774 e individualizada por Paul Erlich em 1879, essa célula teve o seu estudo incrementado a partir da década de 60 quando se descobriu ser ela a célula central do sistema imunológico. Embora não se tenha tão claramente, o conhecimento da função dos LR, sabe-se que apresentam síntese ativa de material nucléico, representando resposta à um estímulo antigênico. Sabe-se, entretanto, que em alguns casos específicos como a Dengue, que o vírus se replica com mais intensidade em LR do que em linfócitos em repouso. Em contrapartida, alguns autores defendem que a presença destas células está relacionada com a convalescência da doença. Se a primeira hipótese for levada em consideração, se explica porque em pacientes com formas severas de dengue e infecções secundárias teriam uma frequência maior de aparecimento de LR, e se a segunda hipótese for analisada, tem-se os LR como marcadores de uma melhora clínica do paciente. Função LINFÓCITOS REATIVOS De qualquer forma o aparecimento de LR na hematoscopia pode ser um bom indicador precoce do aparecimento de um quadro infeccioso viral. Especificamente os LB reativos secretam anticorpos de baixa afinidade do tipo IgM, os primeiros a serem produzidos. Os LB ativados ainda sofrem mais alterações que incluem a substituição das imunoglobulinas de superfície IgM e IgD por IgG, IgA e mais raramente IgE e a expressão de um segundo grupo de receptores de superfície para um segundo fator originário de células T chamado fator de diferenciaçãode células B (FDCB). Com a exposição ao FDCB os LB evoluem finalmente para plasmócitos, células de vida curta que secretam imunoglobulinas IgG, IgA ou IgE de alta afinidade. Tanto o tronco T como o B, após cessado o estímulo antigênico, produzem linfócitos de memória. Nos sítios inflamatórios o LR atua como os linfócitos normais, desempenhando um papel na resposta imune, tanto na primária quanto na auxiliar. Função CAPÍTULO 5 LINFÓCITOS Os linfócitos encontrados no SP periférico são, de modo geral, pequenos com 10 a 12 µm, ou um pouco maiores com 12 a 16 µm, geralmente redondos com núcleo também redondo apresentando cromatina densa e bem corada, correspondendo de 80 à 90% do tamanho total da célula. O citoplasma é escasso. Os linfócitos grandes se apresentam com contorno irregular, a cromatina é mais delicada e o citoplasma mais abundante e de coloração azul clara. Os NK são semelhantes aos linfócitos grandes, mas o citoplasma exibe alguns grânulos bem visíveis de coloração vermelho- arroxeada, não muito numerosos. Podem representar de 10 a 20% dos linfócitos em indivíduos normais. A diferenciação morfológica visual entre LB e LT é impossível, sendo que estas células somente podem ser diferenciadas através de técnicas de imunofenotipagem. Morfologia CAPÍTULO 6 LINFÓCITOS REATIVOS Através do reconhecimento do antígeno, os linfócitos são ativados, proliferam e sofrem modificações estruturais, morfológicas e imunofenotípicas para efetuar a resposta imune. Morfologicamente, tanto o LT como o LB, aumentam de tamanho, adquirem aspecto de linfócitos jovens assemelhando- se à linfoblastos, com 20 a 40 µm de diâmetro, apresentado o citoplasma irregular e basófilo devido a síntese acelerada de ácidos nucléicos. O citoplasma pode, as vezes, apresentar vacúolos e o retículo endoplasmático rugoso pode ser visualizado como microcanalículos. O núcleo torna-se maior, com a rede de cromatina mais delicada, sendo visível muitas vezes os nucléolos. Após algum tempo esse linfócito, assim modificado, entra em mitose, dando a um clone celular idêntico, espalhando a resposta para todo o organismo. A semelhança com linfoblastos é meramente morfológica, visto que LR não apresenta relação com processo neoplásico. O tamanho aumentado é algo que se espera em um LR, mas não é requisito para sua definição. Morfologia LINFÓCITOS REATIVOS A recomendação morfológica básica para reconhecimento é uma cromatina nuclear frouxa, geralmente em algumas regiões nucleares, e também basofilia citoplasmática, que pode ser difusa por todo o citoplasma, ou somente restrita a membrana celular. Além disso pode-se relatar o aumento de tamanho (nem sempre ocorre), núcleo com presença de nucléolo (o que pode acontecer também em linfócitos normais), contorno nuclear irregular, lobulação nuclear e contorno irregular da célula. No caso dos LB, por exemplo, algumas células se diferenciam e adquirem propriedades intermediárias entre LB e o plasmócito, conhecidos como linfócitos plasmocitóides, entretanto ainda não possuem o núcleo excêntrico e o halo perinuclear mais claro, característica do plasmócito. Já os LT reativos são originados após a apresentação de antígenos à célula T, provocando alterações na constituição e na morfologia destas células, que evidenciam sua ativação. Morfologia LINFÓCITOS REATIVOS As características morfologias proposta por Downey sugerem três tipos de LR: Tipo I – Monocitóide – Trata-se de um linfócito grande, núcleo convoluto, citoplasma abundante com basofilia variável, podendo apresentar vacúolos e grânulos. Se assemelha com um monócito, entretanto a basofilia do citoplasma ajuda a diferenciação. Tipo II – Linfoblastóide ou plasmocitóide – Possui citoplasma escasso, basofilia difusa, geralmente intensa e núcleo podendo apresentar nucléolos. Tipo III – Amebóide – Apresenta um citoplasma mais abundante, com projeções citoplasmáticas irregulares, com basofilia restrita a membrana plasmática geralmente. A diferenciação do subtipo de linfócito reativo não precisa ser descrita no laudo, visto que todas as formas remetem para a mesma interpretação clínica. A nomenclatura para estes linfócitos é variada e confusa com muitos termos para descrever a mesma célula. Linfócitos variantes, reativos, ativados, anormais ou atípicos. Células de Downey Tipo 1, 2 ou 3, Células de Turk, Imunoblastos ou mesmo combinações de células como linfócitos monocitóides. Se faz necessária a padronização desta terminologia e a recomendação é que o termo “linfócito reativo” seja utilizado. Morfologia LINFÓCITOS REATIVOS Recentemente o PNCQ publicou um documento que descreve três morfologias distintas para reconhecimento de LR, sendo: 1) Linfócito Linfoplasmocitóide, o qual apresentam núcleo redondo ou oval com cromatina moderadamente densa e raramente exibem nucléolo. O citoplasma é abundante de coloração azul cinzenta e por vezes exibe uma região clara perinuclear. 2) Imunoblasto que se caracteriza como uma célula grandes, com citoplasma amebóide que envolve parcialmente as células vizinhas exibindo coloração mais intensa nas margens. 3) Grande Linfócito Granular, apresentando um núcleo redondo, cromatina densa sem nucléolo aparente. O citoplasma é moderado ou abundante, claro ou levemente basofílico e contém grânulos azurofílicos grandes e distribuídos de modo desigual. Estas células são encontradas em pequena quantidade em indivíduos normais, mas podem estar aumentadas quando associadas à outras formas reativas. Está forma somente é descrita como LR se apresentar uma contagem superior a 3%. Morfologia CAPÍTULO 7 LINFÓCITOS REATIVOS Os LR podem ser vistos no sangue periférico em qualquer situação em que haja produção de anticorpos, como por exemplo as doenças virais, e sempre devem ser contados na diferencial como uma população distinta dos linfócitos normais. Geralmente aparecem acompanhando as linfocitoses, sendo que, antigamente, era relacionado a presença de LR em doenças que manifestavam febre. Um adulto, em situações normais, pode apresentar de até 2% de linfócitos reativos no sangue periférico, e em crianças esse percentual pode ser um pouco maior. A presença de linfócitos reativos em pacientes de 4 meses a 4 anos é considerado um achado normal mesmo em ausência de doença, desde que em valores até 6%, e deve ser relatado no hemograma, mesmo que em baixas quantidades. Embora presentes e largamente descritos na mononucleose infecciosa, os LR não são exclusividade desta doença e, como descrito a seguir, estas células aparecem vários outros quadros infecciosos. Interpretação LINFÓCITOS REATIVOS Na mononucleose infecciosa a contagem de linfócitos reativos pode ser superior a 20% do total de linfócitos, e correspondem predominantemente linfócitos T, embora o vírus Epstein-Barr infecte apenas linfócitos B. Esta doença é considerada maior causa de reatividade linfocitária. Já na dengue, os LR estão presentes desde a fase aguda da doença, e a sua contagem aumenta ao redor do quinto dia de manifestações clínicas quando a febre cessa, podendo ter uma contagem ainda maior em pacientes que manifestam choque. Particularmente na dengue, a leucocitose é um fator que pode ser associado ao desenvolvimento de complicações. Já os LR aparecem no momento do diagnóstico desta patologia, sendo um bom indicador diagnóstico. Também predominam na febre hemorrágica, e são mais frequentes no dia da alta que na admissão do paciente, o que nos permite relacionar os LR com o início da fase de convalescença da doença. Esta informação já havia sido levantada em 1979, aonde se observou a presença de LR em paciente com dengue, e o aumento destes após o desaparecimento da febre. Interpretação LINFÓCITOSREATIVOS Na caxumba, em um quadro clínico com ausência de manifestação extra-salivar, espera-se uma leucopenia com linfocitose, e podem aparecer LR. Em casos de doenças inflamatórias crônicas, pode ser visto LR na hematoscopia, embora não seja um achado esperado. Pacientes com coqueluche apresentam, geralmente, uma leucocitose eu pode chegar até 100.000 leucócitos/µL, as custas de uma linfocitose, com presença de LR, que são produzidos pela grande quantidade e variedade de toxinas antigênicas produzidas pela bactéria. Quadros de hepatites virais, no período ictérico da doença, é esperado leucocitose às custas de linfocitose com presença de 40% ou mais de LR. Mesmo após a convalescença da doença, aonde os leucócitos retornam aos níveis normais, os LR podem permanecer por 2 a 3 meses. No período exantemático do sarampo, os LR também se fazem presentes, geralmente com leucocitose e linfocitose. Igualmente aos quadros de hepatites virais, mesmo após normalização do leucograma, os LR permanecem por algum tempo. Interpretação LINFÓCITOS REATIVOS Em casos de SIDA há relatos de aparecimento de LR de 12 à 20% dos pacientes infectados. Outras causas são: Infecção por Citomegalovirus, Adenovírus, Rubéola, Varicela, Herpes (simples e zoster), Meningite linfocitária, Infecções bacterianas como brucelose, tuberculose e sífilis, Infecção por protozoários: Toxoplasmose, Malária, Babesiose, Hipersensibilidade a drogas como fenotiazimas ácido-aminosalísilico, mensantonia, sulfasalazina, etc. Interpretação CAPÍTULO 8 CONSIDERAÇÕES FINAIS A aparição de LR ainda é motivo de dúvidas em analistas clínicos, o que revela a necessidade de se estabelecer critérios para identificação destas células. A cromatina frouxa e a basofilia de citoplasma são importantes para a definição dos LR. Quando presentes, os LR não devem ser negligenciados, e sim relatados no hemograma como uma população leucocitária distinta dos linfócitos normais. Mesmo em crianças, aonde se espera o aparecimento de LR, estas células devem ser relatadas no laudo. A interpretação dos LR não difere de acordo com sua morfologia específica de Downey, não sendo então necessário o relato do subtipo de atipia presente. Todo analista clínico deve adotar critérios firmes para identificação de LR, e os mesmos critérios devem ser utilizados por todos os analistas de um mesmo laboratório. Assim sendo, a hematoscopia terá resultados mais uniformes e confiáveis, aumentando a credibilidade do laboratório. CAPÍTULO 9 MINI ATLAS Linfócitos Reativos Plasmocitóides Grandes Linfócitos Granulares – NK (não são reativos) MINI ATLAS Linfócitos Reativos Downey tipo III - Amebóide Linfócitos Reativos Downley tipo II - Linfoblastóide MINI ATLAS Linfócitos Reativos Downey tipo I - Monocitóide MINI ATLAS Outros exemplos de Linfócitos Reativos MINI ATLAS Outros exemplos de Linfócitos Reativos CAPÍTULO 10 REFERÊNCIAS MacDonald HR. Development and function of natural killer 1+ T-cells. Biochem Soc Trans 1997; 25(2):696-9. 136. Yokoyama WM. Betting on NKT and NK cells. Immunity 2004; 20(4):363-5 Azeredo EL, Zagne S, Alvarenga A, Nogueira RMR, Kubelka CF, Oliveira-Pinto LM. Activated peripheral lymphocytes with increased expression of cell adhesion molecules and cytotoxic markers are associated with dengue fever disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 101:437-449, 2006. Homchampa P, Sarasombath S, Suvatte V, Vongskul M.. Natural killer cells in dengue hemorrhagic fever/dengue choque syndrome. 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