Testes para a confirmação de resistência bacteriana

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Leitura do antibiograma e 
Testes para a confirmação 
de resistência
Celio de Faria Junior
Farmacêutico-microbiologista
COMO LER AS ZONAS DE INIBIÇÃO?
Colônias dentro da zona de 
inibição
No caso de colônias diferentes dentro do halo, 
subcultivar, verificar a pureza e repetir o teste se 
necessário.
Colônias que não são contaminantes devem ser 
considerados.
Ler o halo onde tem inibição de crescimento, ignorar o
véu (ocorre mais em Proteus spp.)
Zonas com bordas nebulosas
Staphylococcus
Segurar a placa contra um fundo escuro e ler a olho
nú (30 com dos olhos) e estimar a onde o halo está.
Não segurar a placa na luz (luz transmitida) nem usar
lupa.
PONTOS CRÍTICOS EM STAPHYLOCOCCUS
1. Sensibilidade à PENICILINA,
• Teste de borda de halo
2. Resistência à OXACILINA,
• Triagem de cepas com mecA (disco de cefoxitina) 
3. Sensibilidade à Clindamicina (quando ERITROMICINA-R),
• D-teste
4. Determinação da MIC de vancomicina,
• Microdilução
5. Resistência à linezolida.
• Microdilução
S. AUREUS PEN-S - TESTE DE BORDA 
• Limite da zona de inibição Nítida 
• Limite da zona de inibição Difusa (e halo >=29mm) 
cliff
Beach
Reportar: 
Penicilina R 
(Produtor de β-lactamase ) 
Reportar: 
Penicilina S
*** Mais sensível do que o teste de nitrocefim.
MODSA (Modified S. aureus) com relevância clínica ainda obscura;
BORSA (Borderline oxacillin resistant) pouca relevância clínica (responde a PRP).
CONFIRMAÇÃO DE MRSA
(DISCO DIFUSÃO)
Cepa Mecanismo
Disco OXA
(≤ 10 mm)
Disco CFO
(≤ 21 mm)
MRSA Gene mecA, PBP2a R R
MODSA Perda de afinidade PBP R S/R
BORSA
Hiper-produção de ß-
lactamase
R S/R
Derek F. J. Brown. Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2005) 56, 1000–1018
CLSI padroniza o disco de 
cefoxitina. (SCN, ≤ 24 mm)
TESTE COM CEFOXITINA (S. AUREUS)
Halo <= 21mm R
Halo >= 22 mm R
CLSI padroniza o disco de 
cefoxitina. (SCN, ≤ 24 mm)
D-TESTE
(Disco de eritromicina 15 – 26 mm de distância do Disco de 
clindamicina) 
Falha terapêutica com
clindamicina em
infecções causadas
por MRSA MLSB
indusido (Clind. S).
Siberry et al. Clin Infect Dis. (2003) 
COMO LIBERAR OS RESULTADOS?
Bomba de efluxo
Fenótipo:
Macrolídio – R
Lincosamida - S
Metilase de rRNA induzida 
(gene erm)
Fenótipo:
Macrolídio – R
Lincosamida – R*
D-teste
Metilase de rRNA constitutiva 
(gene erm)
Fenótipo:
Macrolídio – R
Lincosamida – R
*** Diminuição de atividade de 
Quinupristina / Dalfopristina
PAINEL DE VANCOMICINA
Controle de crescimento (CC)
PROCEDIMENTO
PROCEDIMENTO
• Inoculação: Pipetar 100 mcL do tubo 3 nas cavidades. 
• Sentido CC → 64 mcL
• Incubação: Recolocar a placa de microtitulação na embalagem 
original e incubar por 24 horas em estufa aeróbia.
INTERPRETAÇÃO DO RESULTADO
• Primeiro poço onde não houver crescimento bacteriano
• Resultado em “mcg/mL"
PONTOS CRÍTICOS EM ENTEROCOCCUS
1. Resistência à AMPICILINA (Enterococcus “faecalis”!!!),
• Confirmação com disco de ampicilina
2. Avalição de sinergia (alto nível de R aos AMINOGLICOSÍDEOS),
• Confirmação com discos GEN120 e ET300
3. Resistência à VANCOMICINA,
• Microdilução
4. Confirmação de resistência à LINEZOLIDA,
• Microdilução
AVALIÇÃO DE SINERGIA
Aminoglicosídeos
Drogas ativas em parede celular
Sensível Resistente
Sensível Sinergia Não-sinergia
Resistente Não-sinergia Não-sinergia
PONTOS CRÍTICOS EM ENTEROBACTÉRIAS
1. Resistência às cefalosporinas de 3ª e 4ª geração,
• Confirmação com disco aproximação
2. Resistência aos carbapenens,
• Pesquisa de carbapenemase (INIBIDORES E CARBANP)
3. Resistência à polimixina
• Microdilução
DISCO APROXIMAÇÃO
CAZ – Cefotazidima
CRO – Ceftriaxona
AZT – Aztreonam
CPM – Cefepime
AMC – Amox. clav
Halo de antagonismo 
(achatado) → AmpC
Halo de sinergismo 
→ ESBL
Ambler Mecanismo Inibida IBL
Inibida 
EDTA
Induzida
Clav. IMP, 
CFO
A ESBL + - -
B MBL - + -
C AmpC - - +
D OXA - - -
CPMCAZ
AMC
CRO AZT
A distância entre os disco é crítica...
• Varia de 15 (alta-R) a 30 mm (baixa-R).
30 mm 25 mm 
Fotos cedidas pela Dra. Emilly Carneiro (Anchieta)
Diminuiu a 
distância
CONFIRMAÇÃO DE CARBAPENEMASES
IMP
IMP
IMP
IMP
MER
MER
MER
MER
ERT
Cloxacilina 10ul de 
solução 75 mg/mL
Sem aditivo
EDTA 10 ul de 
solução 0,1 M
Ác. Fenilborônico
10ul de solução 
40mg/mL
NOTA TÉCNICA Nº 01/2013
PROCEDIMENTO
1. Colocar 10µL da solução das soluções (fenilborônico,
cloxacilina e EDTA) separadamente nos discos de IMIPENEM
e MEROPENEM;
2. Preparar suspensão bacteriana de 0.5 de McFarland em
salina 0,9% estéril;
3. Umedecer o swab na suspensão, eliminar o excesso e
espalhar homogeneamente na placa;
4. Após evaporação do excesso de umidade aplicar os discos.
Característica das Carbapenemases
Ambler Mecanismo
Discos C/S 
AFB
Discos C/S 
EDTA
Discos C/S 
CLOXA
A KPC + - -
B Provável MBL - + -
C AmpC plasmidial + - +
D OXA48 - - -
Diferença ≥5mm entre o disco sem aditivo e disco combinado = POSITIVO 
Giske. Clinical Microbiology and Infection, April 2011
Bloqueio enzimático com EDTA (NDM)
Diferença de diâmetro ≥ 5 mm : Potencial produtor de metalo-betalactamase
(IMP, VIM, NDM)
Imipenem
Meropenem
10mm
09mm
29mm
28mm
= 19mm
= 19mm
POLICIMBAC
Controle de crescimento (CC)
PROCEDIMENTO
PROCEDIMENTO
• Inoculação: Pipetar 100 mcL do tubo 3 nas cavidades. 
• Sentido CC → 64 mcL
• Incubação: Recolocar a placa de microtitulação na embalagem 
original e incubar por 24 horas em estufa aeróbia.
INTERPRETAÇÃO DO RESULTADO
• Primeiro poço onde não houver crescimento bacteriano
• Resultado em “mcg/mL“
• Caso necessário, solução reveladora
PONTOS CRÍTICOS EM NFs
1. Resistência às cefalosporinas de 3ª (anti-pseudômonas) e 4ª 
geração,
• Confirmação com disco aproximação
2. Resistência aos carbapenens,
• Pesquisa de carbapenemase (CARBANP)
3. Resistência à polimixina
• Microdilução
PRODUÇÃO DE ESBL EM NFs
TIM – Ticarcilina-CLAV.
CAZ – Ceftazidima
ATM – Aztreonam
TZP – Piperacilina-TAZ
FEP - Cefepime
Pseudomonas aeruginosa
Dortet at el. 2014
TESTES COLORIMÉTRICOS (~2 HORAS)
(Detecção de carbapenemase em NÃO FERMENTADORES e enterobactérias)
100% sensível e 100% específico
Carba NP (CLSI – NFs e Enterobactérias)
1. Distribuir 100 mcL da solução de Carba NP e tubos eppendorf
(Tubo A);
2. Colocar 1000 mcL da solução de Carba NP em um eppendorf
contendo 6 mcg de Imipenem + cilastina.
• Desse tubo, distribuir 100 mcl em tubos eppendorf (tubo B).
Fotos: LACEN-DF
A B
A B
Dúvidas???