diluições

Prévia do material em texto

Curso de Engenharia de Alimentos 
Disciplina de Microbiologia 
Prof. Márcia R. F. G. Perdoncini 
 
AULA PRÁTICA n° 
 
DILUIÇÃO DE AMOSTRA 
 
INTRODUÇÂO 
O processo de diluição da amostra para 
realização de análises microbiológicas de 
alimentos bem como o procedimento técnico 
utilizado durante esse processo constitui fatores 
importantes de interferência nos resultados finais 
da análise microbiológica. 
Diluição é o procedimento de adição de 
uma substância a outra para reduzir a 
concentração de uma das substâncias. Expressa 
de outra forma, uma diluição indica a quantidade 
relativa de substâncias em uma solução. 
O uso mais comum da palavra diluição 
ocorre no sentido de que “tantas partes de um 
material estão sendo diluídas em um número 
total de partes do produto final (diluente + 
material)”. 
“Uma diluição é uma expressão de 
concentração ou proporção, não de volume”. 
Exemplo: 
“Fazer uma diluição 1 para 10 de leite 
em solução salina peptonada”. 
Esta frase poderia ser escrita de outras 
formas, com o mesmo significado: 
• “Fazer uma diluição 1 em 10, de leite em 
solução salina peptonada”. 
• “Fazer uma diluição 1 para 10, de leite 
com solução salina peptonada”. 
• “Fazer uma diluição 1/10, de leite com 
solução salina peptonada”. 
• “Fazer uma diluição 1:10, de leite usando 
solução salina peptonada”. 
• “Fazer uma diluição de 1 parte de leite e 9 
partes de solução salina peptonada”. 
 
Em microbiologia de alimentos, comumente 
são utilizadas diluições decimais da amostra, 
adotando-se rotineiramente dois critérios: massa 
por unidade de volume (m/v) e volume por 
unidade de volume (v/v). 
Diluições decimais são diluições em que a 
quantidade de substância a ser diluída 
corresponde à unidade, ou múltiplos da unidade 
e o volume final da solução diluída é igual a 10 
ou múltiplo de 10 (diluições de base 10). 
Diluições decimais seriadas são diluições 
decimais preparadas em série e que possuem 
um fator de diluição único e igual a 10. 
Exemplo: 
Preparar diluições decimais de uma 
cultura bacteriana em fase estacionária até 10-3: 
a) Preparar uma diluição 1:10 da cultura em fase 
estacionária em solução salina peptonada, isto é, 
misturar 1 mL da cultura em fase estacionária 
com 9 mL de solução salina peptonada (10-1). 
 
 
 
A partir da diluição 1:10 preparada e após 
homogeneização em agitador de tubos, tomar 1 
mL e misturar com 9 mL de solução salina 
peptonada, de forma a obter a diluição 1:100 da 
cultura em fase estacionária (10-2). 
A partir da diluição 1:100 preparada e 
após homogeneização em agitador de tubos, 
tomar 1 mL e misturar com 9 mL de solução 
salina peptonada, de forma a obter a diluição 
1:1000 da cultura em fase estacionária (10-3). 
 
Para preparar uma diluição 1:10 de uma 
amostra de queijo, pode proceder da seguinte 
forma: 
• 1g de queijo + 9mL de diluente, ou 
• 10g de queijo + 90mL de diluente ou 
• 20g de queijo + 180mL de diluente, ou 
• 25g de queijo + 225mL de diluente. 
 
 
 
 OBJETIVO 
Aprender a preparar diluições seriadas 
para posteriores análises microbiológicas. 
Observações: 
• Com o alimento diluído, fica mais fácil 
encontrar uma placa ideal para se fazer a 
contagem de microrganismos; 
• A homogeneização das diluições pode ser 
realizada manualmente (1 minuto, mas 
tenta-se sempre evitar este método pela 
imprecisão), com agitador de tubos (até 1 
minuto) ou com “stomacher” (30segundos 
a 2 minutos); 
• Não utilizar pipetas cuja capacidade for 
superior a 10 vezes o volume a ser 
medido; 
• Sempre utilizar uma pipeta para cada 
diluição; 
• A mesma pipeta poderá ser utilizada para 
semeadura de diluições de amostras, 
desde que se parta da maior diluição 
(amostra mais diluída) para a menor 
diluição (amostra menos diluída). 
 
 
 
 
MATERIAIS 
- Azul de metileno (corante); 
- Tubos com 9 ml de diluente (água destilada e 
solução salina peptonada 0,1%); 
- Tubos com 9,9 ml de diluente (solução salina 
peptonada 0,1%); 
- Frascos com 225 mL de solução salina 
peptonada 0,1%); 
- Homogeneizador de tubos e de amostra, 
balança; 
- Micropipetas de 10-100µL e 100-1000µL. 
 
PROCEDIMENTO 
 
A) Visualização de uma diluição seriada: 
 
- Preparo de diluição seriada de 10-1 até 10-4 de 
uma solução de azul de metileno. 
 
• Pipetar 1 mL de azul de metileno a um 
tubo contendo 9 mL de água destilada; 
• A partir deste primeiro tubo, que é a 
diluição1:10, após a homogeneização, 
pipetar 1 mL para outro tubo contendo 
9mL de água destilada. Esta é a diluição 
1:100 ou 10-2. 
• Proceder da mesma forma até a diluição 
10-5. 
 
B) Preparo de amostra sólida: 
 
ASSEPTICAMENTE 
 
• Preparo de diluição seriada de 10-1 a 10-
4, de uma amostra de alimento iniciando 
por 25 gramas de amostra. 
• Pesar assepticamente 25g do alimento a 
ser analisado e adicionar em 225 mL de 
diluente. Esta é a diluição 10-1. 
• A partir da diluição 10-1, preparar a 
diluição 10-2, pipetando 1 mL deste a um 
tubo contendo 9mL do diluente; 
• Proceder da mesma forma para preparar 
as demais diluições, sempre de forma 
asséptica ( próximo ao Bico de Bunsen). 
 
C) Preparo de amostra líquida: 
 
ASSEPTICAMENTE 
 
- Preparo de diluição seriada de 100 a 10-3, 
sempre de forma asséptica (próximo ao bico de 
Bunsen). 
• A partir da amostra pura, que é a diluição 
100, pipetar 1ml e passar para tubo 
contendo 9mL de diluente; 
• A partir da diluição 10-1, pipetar 1mL para 
tubo contendo 9ml do diluente. Este é o 
tubo 10-2; 
• A partir da diluição 10-2, pipetar 1mL para 
tubo contendo 9ml do diluente. Este é o 
tubo 10-3. 
 
REFERÊNCIAS 
BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e 
Abastecimento. Secretaria de Defesa 
Agropecuária (Dispoa). Instrução Normativa n° 
62, de 26 de agosto de 2003, que aprova os 
métodos analíticos oficiais para análises 
microbiológicas para controle de produtos de 
origem animal e água. ANEXO 2- Diluição e 
soluções. Disponível em: 
http://extranet.agricultura.gov.br/sislegis-
consulta/consultarLegislacao.do?operacao=visual
izar&id=2851 . Acesso em: 02 de Novembro, 
2008.