Atividade antioxidante e anti-inflamatória das nanopartículas de óxido de zinco

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PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DISCIPLINA: PESQUISA E DESENVOLVIMENTO DE MEDICAMENTOS
Anderson Wilbur Lopes Andrade
Teresina-PI
2015
Atividade antioxidante e anti-inflamatória das nanopartículas de óxido de zinco
1
 	INTRODUÇÃO 
NANOTECNOLOGIA
NANOCIÊNCIA
Foca o projeto, caracterização, produção e aplicação de sistemas e componentes em nanoescala (nm).
NANOPARTÍCULAS (NPs)
(dimensão da ordem de 100nm ou menor)
Os materiais, dispositivos e sistemas apresentam propriedades antes não observadas quando em tamanho micro ou macroscópico e aplicações fundamentalmente novas.
PAULA et al., 2012
A nanotecnologia é um campo da ciência que tem se desenvolvido de maneira impressionante, juntamente com a biotecnologia, conectando conhecimento da ciência dos materiais e da química com os da biologia, gerando saberes e produtos nas áreas biotecnológicas, farmacêuticas, médicas, de diagnóstico, entre outras (PAULA et al., 2012).
A nanociência se refere ao estudo do fenômeno e da manipulação de sistemas físicos que produzam informações significativas (isto é, diferenças perceptíveis), em uma escala conhecida como nano (10-9 m= 1 nm) com comprimentos típicos que não excedam 100 nm em comprimento em pelo menos uma direção. Portanto, a nanotecnologia foca o projeto, caracterização, produção e aplicação de sistemas e componentes em nanoescala.
Nessa escala de tamanho, os materiais apresentam novas propriedades, antes não observadas quando em tamanho micro ou macroscópico, por exemplo, a tolerância à temperatura, a variedade de cores, as alterações da reatividade química e a condutividade elétrica.
Consiste na habilidade de se trabalhar em nível atômico, molecular e macromolecular a fim de criar materiais, dispositivos e sistemas com propriedades e aplicações fundamentalmente novas.
Não há uma definição internacional consensual do que é uma nanopartícula. Contudo, um resumo do novo documento PAS71 [1], desenvolvido no Reino Unido, menciona: "Uma nanopartícula é um corpo tendo uma dimensão da ordem de 100 nm [2] ou menor".
A nanotecnologia é uma ciência interdisciplinar e existe na natureza desde que a terra evoluiu. Ela atravessa as fronteiras tradicionais do conhecimento da física, química, engenharia, botânica, zoologia e ciências da terra sendo, assim, interdisciplinar. Essa tecnologia tem sido amplamente aceita pelos cientistas, em razão do surgimento de propriedades químicas, mecânicas, magnéticas, químicas, eletrônicas e óticas únicas, dependentes da nanoescala.
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 	INTRODUÇÃO 
NANOPARTÍCULAS
Suas propriedades dependem fortemente de tamanho e formato - atribui a estas grande potencial para aplicação nas mais diversas áreas. 
As técnicas de produção de nanopartículas podem ser divididas em duas classes de acordo com o método de formação das estruturas. 
Bottom-up ("de baixo para cima") - construindo os materiais a partir de átomos ou moléculas individuais. 
Top-down ("de cima para baixo") - por meio da ruptura de uma porção maior do material em nanopartículas. 
FERREIRA; RANGEL, 2009
Suas propriedades dependem fortemente de tamanho e formato, o que atribui a estas estruturas, grande potencial para aplicação nas mais diversas áreas da ciência e tecnologia. 
formação do material bulk fornece energia favorável para o crescimento da partícula, sendo que a remoção desta energia de ativação (pelo abaixamento da temperatura do sistema, por exemplo) resulta num crescimento “interrompido” e assim, permite o controle cinético do tamanho da partícula (5) . Um método de crescimento de partículas é o de evaporação de um metal por aquecimento ou com irradiação de laser, formando-se o chamado feixe de clusters. Uma desvantagem deste método é que as nanopartículas metálicas são geradas sem recobrimento, possuindo uma alta energia superficial, ocorrendo a sua imediata agregação na forma de um pó policristalino, favorecido termodinamicamente pela formação de ligações metal-meta
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 	INTRODUÇÃO 
As nanopartículas podem ser preparadas e estabilizadas por meio de métodos físicos e químicos, tais como:
ABLAÇÃO A LASER 
IRRADIAÇÃO DE ALTA ENERGIA
MÉTODOS TERMOELETROQUÍMICOS 
REDUÇÃO FOTOQUÍMICA 
Estes métodos são caros e tóxicos, por conseguinte, a utilização de extratos de plantas pode ser uma alternativa aos métodos de físico-químicos. 
De um modo geral, as nanopartículas podem ser preparadas e estabilizadas por meio de métodos físicos e químicos, tais como:
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 	INTRODUÇÃO 
 
SÍNTESE VERDE
SÍNTESE ECOLOGICAMENTE CORRETA DE NANOPARTÍCULAS. 
As sínteses físico-químicas possuem consumo intensivo de energia e às vezes podem envolver substâncias químicas tóxicas, enquanto as técnicas biológicas são rentáveis, limpas, atóxicas e ecologicamente corretas.
NANOPARTÍCULAS VERDE
RAI; BARATA, STÉFANI, 2013.
Síntese verde, síntese biológica e síntese biogênica são termos comumente usados para a síntese ecologicamente correta de nanopartículas. 
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DINORAH ERENO, 2014.
 	INTRODUÇÃO 
FAPESP Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP
A escolha da pesquisadora recaiu sobre o micélio, porque, na sua avaliação, ele apresenta vantagens em relação ao corpo frutífero, como o crescimento mais rápido. “Além disso, a produção dos componentes químicos presentes no micélio é mais homogênea, porque trabalhamos em condições controladas no meio de cultivo líquido, como nutrientes, pH, temperatura, oxigenação, entre outras. Com isso conseguimos manter a reprodutibilidade desse material biológico”, diz. A quantidade de compostos químicos presentes nesses organismos depende de fatores como a espécie e seleção de linhagens, a fase de desenvolvimento – corpo frutífero ou micélio – e o tipo de substrato utilizado.
Nesse caso, o estudo desenvolvido por Luciane Dias da Silva, mestranda orientada por Luciano Silva, tem como foco a síntese de nanopartículas de prata a partir de extratos de frutos e folhas da mangabeira (Hancornia speciosa).
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 	INTRODUÇÃO 
NPs de óxidos metálicos, dentre estes o óxido de zinco (ZnO), têm atraído a atenção dos pesquisadores pelas suas aplicações medicinais. 
ANDRADE; SOUSA, 2014.
NANOPARTÍCULAS METÁLICAS
A ação dos íons e metais reduzidos permite um efeito pronunciado aos compostos biotecnologicamente sintetizados, principalmente na sua interação com as células vivas (atividade biológica).
As nanopartículas metálicas, particularmente seus óxidos, dentre estes o óxido de zinco (ZnO), têm atraído a atenção dos pesquisadores pelas suas aplicações medicinais, uma vez suas propriedades diferem significativamente daquelas observadas no material macroscópico. A ação dos íons e metais reduzidos permite um efeito pronunciado aos compostos biotecnologicamente sintetizados, principalmente na sua interação com as células vivas (atividade biológica)
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Expressão gênica 
 	INTRODUÇÃO 
A INFLAMAÇÃO é uma resposta protetora para uma variedade de fatores, tais como, danos físico-químicos, reações imunológicas, infecções microbianas, toxinas, hipóxia e danos nos tecidos (estresse oxidativo).
SISTEMA IMUNOLÓGICO
LIBERAÇÃO DE MEDIADORES 
PRÓ-INFLAMATÓRIO 
Interleucina - IL-1β, IL-6, IL-12, IL-18, Fator de necrose tumoral (TNF), Interferon gama (IFN-γ) e fator estimulante de colônias granulócitos e macrófagos (GM-CSF).
FATOR NUCLEAR kapa β (NF-kβ) 
COX-2 
+
INDUTORES DA SÍNTESE 
DO ÓXIDO NÍTRICO (iNOS)
Lipopolissacarídeo
(LPS) 
ANTI-INFLAMATÓRIO
ANTI-INFLAMATÓRIO
ANTI-INFLAMATÓRIO
A inflamação é uma resposta protetora para uma variedade de fatores, tais como, danos físico-químicos, reações imunológicas, infecções microbianas, toxinas, hipóxia, e danos nos tecidos [23]. A resposta inflamatória é um processo complexo que inclui a ativação de células do sangue e a liberação de mediadores pró-inflamatório do sistema imunológico, dentre estas as citocinas interleucina
- IL-1, IL-6, IL-12, IL-18, Fator de necrose tumoral (TNF), Interferon gama (IFN-γ) e fator estimulante de colônias granulócitos e macrófagos (GM-CSF).
O fator nuclear kapa β (NF-kβ) é um fator de transcrição e desempenha um papel importante na resposta inflamatória através da regulação das expressões de vários genes que codificam para as citocinas pró-inflamatórias, moléculas de adesão, quimiocinas, fatores de crescimento, enzimas indutoras, tais como a COX-2 e indutores da síntese do óxido nítrico (iNOS), que estimulam a produção dos mediadores pró-inflamatórios.
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 	INTRODUÇÃO 
No metabolismo celular normal os níveis de radicais livres e antioxidantes são equilibrados. 
No entanto, o uso de antioxidantes sintéticos tem sido limitada devido aos seus efeitos tóxicos antioxidantes de origem natural 
 
 RADICAIS LIVRES
DANOS OXIDATIVOS
No entanto, o excesso de produção de radicais livres resulta em danos oxidativos, que conduz a uma variedade de doenças crónicas, tais como cancro, diabetes e a inflamação [19-21]. A ingestão de antioxidantes fornece protecção contra os danos causados por radicais livres. No entanto, o uso de antioxidantes sintéticos tem sido limitada devido aos seus efeitos tóxicos. Portanto investigação está agora voltada para antioxidantes de origem natural.
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 OBJETIVO
Neste estudo, as NPs de ZnO foram sintetizados utilizando-se extratos da raiz de Polygala tenuifolia W. (Família: Polygalaceae) e avaliou-se em ensaios in vitro suas atividades antioxidantes e anti-inflamatórios.
P. tenuifolia
Amnésia;
Neurastenia; 
Asma;
Rinite;
Insônia; 
Antitumoral;
Anti-inflamatório;
Atividades antimicrobianas.
Estudo demostraram que esta planta contém principalmente xantonas, saponinas, flavonoides e oligossacáridos. 
Podem quelar e reduzir íons metálicos em nanopartículas ativas.
utilizada na medicina tradicional no tratamento da amnésia, neurastenia (designar um quadro de exaustão física e psicológica, fraqueza, nervosismo e sensibilidade aumentada (principalmente irritabilidade e humor depressivo)), palpitações, asma, rinite e insónia [25,26]. Estudo demostraram que esta planta contém principalmente xantonas [27], saponinas [28] e oligossacáridos [29]. Xantonas demonstraram antitumoral [30], anti-inflamatório [31], anti-trombóticos [32] e atividades antimicrobianas [33].
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 METODOLOGIA
Raízes de P. tenuifolia 
10g (seca e pulverizada)
100mL de água
 deionizada 
extrato aquoso da raiz 
 Síntese Verde das NPs ZnO 
dissolução sob 
agitação constante
Estufa com agitação interna 
Agitação a 150°C 
durante 5h
Reatores
Produto sólido
 verde escuro 
centrifugado 2x 
a 4500 rpm (15min)
Lavado; secado a 80°C (7-8h)
3g Nitrato de zinco 
coletadas em um supermercado Oriental na Coreia do Sul
Os flavonoides podem reagir com o nitrato de zinco de modo a formar complexo de zinco-flavonoides. 
depois se deixou arrefecer até à temperatura ambiente, em seguida o sobrenadante foi descartado
secou-se as raízes pulverizando-as finamente obtendo-se 10g misturando-o com 100mL de água desionizada – filtração – dissolveu-se 3g de Nitrato de zinco no extrato de raiz sob agitação constante. Após a dissolução, a solução foi agitada a 150°C durante 5 h, e depois se deixou arrefecer até à temperatura ambiente, em seguida o sobrenadante foi descartado. O produto sólido verde escuro obtido foi centrifugado duas vezes a 4500 rpm durante 15 min, após lavagem completa e, em seguida secou-se a 80°C durante 7-8 h.
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 METODOLOGIA
Realizou-se a Caracterização das NPs de ZnO sintetizadas por:
Espectrofotômetro de Infravermelho
por Transformação de Fourier (FT-IR) 
Espectrômetro - UV visível
Analisador Termogravimétrico
Espectrômetro de Fluorescência de Raios X por Energia Dispersiva (EDX)
Microscopia Eletrônica
 de Varredura - MEV
Microscopia Eletrônica
 de Transmitância - MET
Difratômetro de Raios X 
DRX
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 ESPECTROSCOPIA - UV-Vis 
Um pico largo foi observado a 314nm devido à absorção de “Plasmon” na superfície das NPs de ZnO obtidas. 
Plasmons – oscilações quânticas. 
Figura 1. Espectros UV-Vis das NPs de ZnO sintetizados por meio do extrato da raiz de P. tenuifolia.
A.U. unidade de absorbancia
Em física, uma plasmon é um quantum de oscilação plasma a maioria de suas propriedades podem ser derivadas diretamente das equações de Maxwell. OS descrevem Fenômenos eletromagnéticos (Elétricos e magnéticos).
Agregação das NPs de ZnO – quanto maior for a quantização de oscilações de plasma maior sera a quantidade de eletrons livres na superficie das NPs e consequente maior sera atração entre os ions metalica o que aumentara o tamanha da particula sintetizada. 
Plasmons pode ser descrito como uma oscilação de densidade de elétrons livres no que diz respeito aos íons positivos fixos em um metal.
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 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Figura 2. (a) Espectros FT-IR do extrato da raiz de P. tenuifolia e (b) das NPs de ZnO verde sintetizadas.
Álcool
Fenol
 ESPECTROSCOPIA – FT-IR 
Alcanos
Alcenos
Aminas
– C=C– 
O–H 
– C – C– 
C–N 
O–H 
O aumento nos picos indica mudanca na estrutura física das moléculas por alongamento dos grupos funcionasO–H 
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 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 ANÁLISE TERMOGRAVIMÉTRICA 
Figura 3. (a) Análise termogravimétrica (TGA) das NPs de ZnO, (b) imagem MEV, (d) imagem MET e (e) padrão de DRX das NPS de ZnO sintetizadas a partir de extrato de raiz de P. tenuifolia (c) Espectro de EDX,.
Perda de peso inicial (a 100°C) - devido à remoção de água.
Perda de peso a 262°C - decomposição de compostos orgânicos.
Perda de peso a 567°C - decomposição de ZnO em Zn metálico e O2.
262°C
567°C
É a técnica termoanalítica que acompanha a perda e/ou ganho de massa da amostra em função do tempo ou temperatura, estuda se o material estudado sofreu processos de Decomposição, Desidratação e Oxidação
 TGA mostrou uma perda de peso em dois degraus de 262°C e 567°C.
. A perda de peso inicial de NPs de ZnO a 100°C foi devido à remoção de água. TGA mostrou uma perda de peso em dois degraus de 262°C e 567°C. A perda de peso a 262°C, foi considerada a decomposição de compostos orgânicos a partir de NPs de ZnO, enquanto que a 567C foi considerado como sendo o, decomposição de ZnO em Zn metálico e O2.
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 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 MEV e MET 
As NPs de ZnO maiores se deve à agregação, fenómeno quase sempre associada a nanopartículas.
esféricas
Figura 3. (a) Análise termogravimétrica (TGA) das NPs de ZnO, (b) imagem MEV, (d) imagem MET e (e) padrão de DRX das NPS de ZnO sintetizadas a partir de extrato de raiz de P. tenuifolia (c) Espectro de EDX,.
33,03 - 73,48nm. 
confirmando que as NPs de ZnO sintetizadas eram esféricas e as partículas estão na faixa de de 33,03-73,48nm. As NPs de ZnO maiores pode ser devida à agregação, fenómeno quase sempre associada a nanopartículas.
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 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 EDX 
Figura. 3. (a) Análise termogravimétrica (TGA) das NPs de ZnO, (b) imagem MEV, (d) imagem MET e (e) padrão de DRX das NPS de ZnO sintetizadas a partir de extrato de raiz de P. tenuifolia (c) Espectro de EDX,.
. 
0,49% 
36,45%
O EDX detecta, quanti e qualitativamente quais elementos estão presentes no material.
mostrou um pequeno pico de zinco (0,49%), oxigénio (36,45%), que revela a presença de NPs de ZnO. 
Os sinais restantes de C, P e S podem ser originadas a partir de biomoléculas de extrato de raiz de Polygala ligados à superfície das nanopartículas
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 cristais do tipo wurtzita (hexagonal)
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 DRX 
Figura 3. (a) Análise termogravimétrica (TGA) das NPs de ZnO, (b) imagem MEV, (d) imagem MET e (e) padrão de DRX das NPS de ZnO sintetizadas a partir de extrato de raiz de P. tenuifolia (c) Espectro de
EDX,.
Os picos de difração principal (100), (002), (101), (110) e (202) indicam a pureza e o bom grau de cristalinidade das NPs de ZnO.
confirma a presença das NPS de ZnO
A forma cristalida das NPs de ZnO são hexagonal do tipo wurtzita
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 METODOLOGIA
 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os procedimentos experimentais foram realizados em triplicata e todos os resultados são apresentados como média e ± desvio padrão. 
Para determinar as diferenças significativas entre os grupos foi utilizado o teste One-way ANOVA com teste post-hoc. 
Valores de p≤ 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
 METODOLOGIA
 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE 
100μL DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil)
cor púrpura 
difenil-picril-hidrazina
 cor amarela
redução
antioxidante
50μl NPs de ZnO
(1 - 0,5 - 0,25 - 0,125 mg/mL) 
517nm 
espectrofotômetro
microplacas
com conseqüente desaparecimento da absorção, podendo a mesma ser monitorada pelo decréscimo da absorvância. 
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 METODOLOGIA
 VIABILIDADE CELULAR 
ENSAIO XTT
microplacas
Células de macrófagos murinos - RAW 264.7 (2x104 células/poço) 
50μl NPs de ZnO
(1 - 0,5 - 0,1 mg/mL) 
50μL de solução XTT
2,3-bis-[2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil]-5- [(fenilamino) carbonil]-2-tetra-zolium hidróxido
atividade mitocondrial
redução
Formazan
espectrofotômetro
450nm
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE 
Figura 4. Eliminação da atividade dos radicais livres do DPPH pela NPS de ZnO.
40,58% 
44.66%
45,01%
45,47%
A atividade de eliminação de radicais livres das NPs de ZnO no DPPH aumentou à medida que se elevava a sua concentração (0,125 mg/mL-40,58%; 0,25 mg/ml - 44.66%; 0,5 mg/ml-45,01% e 1 mg/mL-45,47%).
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 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 VIABILIDADE CELULAR 
Figura 5. Viabilidade celular das células RAW 264.7 tratadas com diferentes concentrações de NPs de ZnO verde sintetizadas. Os dados representam a média ± DP de três experiências independentes.
No método deste estudo os produtos químicos tóxicos são substituídos por fitoquímicos não tóxicos. 
A P. tenuifolia, possui antioxidantes tais como triterpenóides, os quais inibem a produção de ROS, as NPs de ZnO sintetizadas menos tóxicas.
As células mostraram viabilidade excelente na presença de até 1mg/ml (Fig. 5), o que indica que as NPs de ZnO possuem nenhum efeito tóxico.
Literatura mostraram anteriormente que NPS de ZnO são tóxicos para as células e tecidos vivos, no entanto, as NPs de ZnO produzidas neste estudo não exibiram toxicidade apreciável de células RAW 264.7 de até 1 mg/mL. 
Ao utilizar outros métodos de síntese químicas, os produtos químicos utilizados aderem à superfície das NPs de ZnO os quais induzem algum nível de toxicidade em células vivas, principalmente pela produção de ROS. No entanto, no método utilizado neste estudo esses produtos químicos tóxicos são substituídos por fitoquímicos não tóxicos. Além disto, a P. tenuifolia, possuem potentes agentes redutores (antioxidantes) tais como triterpenóides, os quais inibem a produção de ROS, as NPs de ZnO sintetizadas menos tóxicas. 
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 METODOLOGIA
 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE NO
KIT DE DETECÇÃO DE NO
microplacas
meio de cultura (100μl)
incubou-se T ambiente 
(10min)
Nitrito de Sódio 1mM 
curva padrão
Kit de NO
Óxido Nítrico (2NO) Nitrito (2NO2-)
 
oxidação
espectrofotômetro
520nm
o2
50μl NPs de ZnO
(1 - 0,5 - 0,1 mg/mL) 
Células de macrófagos murinos 
 RAW 264.7
1μg/mL LPS
iNOS Intracelular
2h depois
Níveis de nitrito, que refletem as iNOS (atividade da óxido nítrico sintase intracelular) foram determinados utilizando um kit de detecção de NO. 
Níveis de nitrito, que refletem as iNOS (atividade da óxido nítrico sintase intracelular) foram determinados utilizando um kit de detecção de NO. Resumidamente, alíquotas de meio de cultura (100μl) foram misturadas com tampão de N1 (50μl) e incubou-se à temperatura ambiente durante 10 min. Tampão de N2 (50μl) foi então adicionada e incubada à temperatura ambiente durante mais 10 min. Finalmente, as concentrações de nitrito foram determinadas utilizando nitrito de sódio 1mM gerado curva padrão, medindo a absorbância a 520 nm.
O óxido nítrico (NO) é um mensageiro biológica chave, possui papel importante na neurotransmissão, regulação vascular, as respostas imunológicas e apoptose. A maior parte do NO na célula é oxidado em nitrito (NO2-) e nitrato (NO3-), e, por conseguinte, as concentrações destes íons são geralmente como uma medida quantitativa da produção de NO.
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 METODOLOGIA
 AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS PROSTAGLANDINA E2 (PGE2) E A PRODUÇÃO DE 
 CITOCINAS
sobrenadante sem células 
kits de ensaio imunoabsorvente
quantificação de IL-1β, IL-6,
 TNF-α, e a PGE2
leitor de microplacas 
automático
microplacas
meio de cultura (100μl)
incubou-se T ambiente 
(10min)
50μl NPs de ZnO
(1 - 0,5 - 0,1 mg/mL) 
Células de macrófagos murinos 
 RAW 264.7
após 24h o 
estimulo com LPS
1μg/mL LPS
Estimula 
a produção 
 ELISA 
Estimula produção mediadore
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 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Figura 6. (a) Efeito NPs de ZnO na produção de NO e (b) produção de PGE2 ativada por LPS.
 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE NO E PGE2
Inibição direta ou diminuição da 
produção de COX2 e iNOS
A exposição a 0,1, 0,5, ou 1mg/mL de nanoestruturas de ZnO NPs suprimiu de forma significativa e dependente da dose, a produção de NO induzida LPS (lipopolissacárido) (Fig. 6a).
NPs de ZnO não teve nenhum efeito significativo sobre a indução de PGE2 nas doses 0,1 e 0,5mg/mL (Fig. 6b) e um redução significativa na dose de 1mg/mL.
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 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Inibição direta ou diminuição da 
produção de COX2 e iNOS
 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE CITOCINAS
Figura 7. Efeito das NPs de ZnO sobre a produção de citocinas ativada pelo LPS nas células RAW264.7. (a) ELISA foi realizado para a determinação do nível de IL-1b, IL-6 e TNF-a. Os dados representam a média ± DP de três experiências independentes. p <0,05 contra LPS sozinho. (b) Western e RT-PCR foi realizada para a determinação do nível e o valores da expressão gênica de mRNA IL-1b, IL-6 e TNF-a .
TNF-α são regulados positivamente em condições inflamatórias agudas e crónicas e TNF-α, IL-1b e IL-6 coordenam a resposta inflamatória nas células imunes estando envolvidas em várias doenças inflamatórias.
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 ANÁLISE WESTERN BLOT 
As células foram recolhidas em gelo
Lavadas três vezes com tampão fosfato-salino 
Sonicada (lise celular)
Centrifugadas 
Preparo do Western blotting 
 METODOLOGIA
microplacas
meio de cultura (100μl)
incubou-se T ambiente 
(10min)
50μl NPs de ZnO
(1 - 0,5 - 0,1 mg/mL) 
Células de macrófagos murinos 
 RAW 264.7
1μg/mL LPS
anticorpos primários específicos, anticorpos secundários conjugados e quimioluminescência aumentada.
Anticorpos primários são produzidos contra um antígeno de interesse e são tipicamente não-conjugados (não-marcados), enquanto anticorpos secundários são produzidos contra anticorpos primários. Assim, anticorpos secundários reconhecem imunoglobulinas de uma espécie particular e são conjugados à biotina ou a uma enzima como fosfatase alcalina ou uma peroxidase. Alguns anticorpos secundários conjugados a agentes fluorescentes, como o Flúor Alexa ou Fluor DyLight, são também frequentemente usados para detecção de proteínas por método IHQ. A concentração da proteína é geralmente medida por análise de densitometria, em que a intensidade da coloração se correlaciona com a quantidade da proteína de interesse.
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 METODOLOGIA
microplacas
meio de cultura (100μl)
incubou-se T ambiente 
(10min)
50μl NPs de ZnO
(1 - 0,5 - 0,1 mg/mL) 
Células de macrófagos murinos 
 RAW 264.7
1μg/mL
LPS
 ANÁLISE DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE DA TRANSCRIÇÃO 
 REVERSA (RT-PCR)
Reagente TRIzol
kit de Síntese de cDNA 
de Primeira Cadeia 
INICIADORES 
GAPDH
IL-1b 
IL-6
TNF-α 
COX-2
iNOS
Os produtos finais de PCR foram separados em géis de 1% de agarose e visualizados por coloração com brometo de etídio. 
gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase 
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 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Figura 7. Efeito das NPs de ZnO sobre a produção de citocinas ativada pelo LPS nas células RAW264.7. (a) ELISA foi realizado para a determinação do nível de IL-1b, IL-6 e TNF-a. Os dados representam a média ± DP de três experiências independentes. p <0,05 contra LPS sozinho. (b) Western e RT-PCR foi realizada para a determinação do nível e o valores da expressão gênica de mRNA IL-1b, IL-6 e TNF-a .
 ANÁLISE WESTERN BLOT E RT-PCR
Inibição do 
FATOR NUCLEAR kapa β (NF-kβ) 
As NPs de ZnO não teve qualquer efeito observável sobre os níveis de mRNA das citocinas anti-inflamatórias (IL-1α, IL-6 e TNF-β)
estimuladas por LPS nas células RAW264.7 (Fig. 7b), mas houve inibição dependente da concentração na (– figura em cima) expressão de mRNA de citoquinas pró-inflamatórias, evitando assim a produção destas.
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 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 ANÁLISE WESTERN BLOT E RT-PCR
Figura 8. (a) Western foi realizada para determinar o nível de iNOS e COX-2 de proteína. (b) RT-PCR foi realizada para a determinação a expressão de RNAm de iNOS e COX-2. Os dados representam a média ± DP (triplicata). p < 0,05 contra LPS isolado.
Inibição do 
FATOR NUCLEAR kapa β (NF-kβ) 
LIBERAÇÃO DE MEDIADORES 
PRÓ-INFLAMATÓRIO 
Interleucina - IL-1β, IL-6 e Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) .
FATOR NUCLEAR kapa β (NF-kβ) 
COX-2 
+
INDUTORES DA SÍNTESE 
DO ÓXIDO NÍTRICO (iNOS)
Lipopolissacarídeo
(LPS) 
NPs de ZnO
NPs de ZnO
Expressão gênica 
Expressão gênica 
Durante os processos inflamatórios, as grandes quantidades de óxido nítrico e prostaglandina E2 (PGE2) são gerados pela iNOS e COX-2. Os resultados deste estudo mostram que as NPs de ZnO inibem de um modo dependente da dose a expressão de mRNA de COX-2 e iNOS induzida por LPS (Fig. 8a). PCR-RT assim como inibiram a expressão da proteína COX-2 e iNOS induzida por LPS.
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 	CONCLUSÃO 
Os autores descreveram um procedimento simples, barato e ecologicamente correto para a síntese de NPs de ZnO utilizando-se o extrato da raiz de P. tenuifolia. 
As nanoestruturas de ZnO verde sintetizadas exibiram propriedades antioxidantes moderada e excelentes atividades anti-inflamatórios o que destaca seu potencial para uso no tratamento de doenças inflamatórias crônicas ou agudas. 
OBRIGADO !