9a Aula A química dos acidos nucléicos 2018.1

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BUNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA
Apostila
Estruturas e funções biológicas dos nucleotídeos: Os ácidos nucléicos
Professor: Paulo de Tarso Gonçalves Leopoldo
			
São Cristóvão, 
2018
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I - Tema Central: Estruturas e funções biológicas dos nucleotídeos: Os ácidos nucléicos
II - Duração: Quatro horas/aulas
III - Estratégia: Aula Expositiva
IV - Meta
Identificar as funções biológicas, as propriedades químicas e as estruturas químicas de alguns nucleotídeos e nucleosídeos.
V Objetivos Específicos
Ao final desta aula você será capaz de:
5.1 Citar as funções biológicas dos nucleotídeos
5.2 Descrever as unidades fundamentais dos nucleotídeos
5.3 Diferenciar nucleotídeos de nucleosídeos.
5.4 Nomear nucleotídeos e nucleosídeos
5.5 Descrever a formação dos nucleotídeos
5.6 Citar experimentos que revelaram a função biológica do DNA
5.7 Descrever o modelo da dupla-hélice
5.8 Descrever propriedades do DNA
5.9 Descrever estruturas do RNA
5.10 Descrever estruturas e funções de nucleotídeos não poliméricos
VI - Conteúdo Programático:
6.1 Introdução
6.2 Estruturas dos nucleotídeos e nucleosídeos
6.3 Nomenclatura dos nucleotídeos e nucleosídeos
6.4 Formação dos nucleotídeos poliméricos, a ligação fosfodiéster
6.5 O DNA armazena a informação genética
6.5.1 O experimento de Oswald Thomas Avery e colaboradores
6.5.2 O experimento de Alfred Hershey e Martha Chase
6.6 A estrutura tridimensional do DNA
6.6.1 Regras de Chargaff
6.6.2 O padrão de difração de raios X
6.6.3 O modelo estrutural do DNA: A dupla-hélice
6.6.4 Conformações da molécula do DNA
6.7 Estruturas do RNA
6.8 Propriedades químicas dos ácidos nucléicos
6.9 Estruturas e funções biológicas de alguns nucleotídeos não poliméricos
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Capítulo 9
Estruturas e funções biológicas dos nucleotídeos: Os ácidos nucléicos
1. INTRODUÇÃO
Funções biológicas dos nucleotídeos
Os nucleotídeos desempenham uma pletora de funções no metabolismo celular como: 
Participam das reações de transferência de energia metabólica. O ATP é um nucleotídeo envolvido em reações de transferência de energia nas reações do metabolismo celular;
Atuam como segundo mensageiro na resposta hormonal. Os nucleotídeos AMP cíclico e o GMP cíclico são elos químicos essenciais na resposta das células aos hormônios e outros estímulos extracelulares; 
São componentes estruturais de cofatores enzimáticos e intermediários metabólicos. Exemplo disso são as coenzimas NAD (nucleotídeo Adenina Dinucleotídeo) e FAD (Flavina Adenina Dinucleotídeo), que participam de reações de transferência de elétrons do metabolismo celular;
Participam no armazenamento e na transmissão da informação genética. O ácido desoxirribonucléico (DNA). Em vírus de ácido ribonucléico (RNA) como flavivírus (vírus da dengue) arbovírus (vírus de plantas) retrovírus (HIV e HTLV-I), o RNA é a molécula repositória da informação genética. 
1.2 O Fluxo da informação genética ou dogma central da informação genética. 
O armazenamento e a transmissão da informação genética é a única função conhecida do DNA. A sequência do DNA de uma célula especifica uma sequência de RNA bem como uma sequência de aminoácidos. O gene é um segmento do DNA que contém a informação necessária para a síntese de um produto biológico funcional (proteína ou RNA). Cada célula do nosso organismo possui milhares de genes. O conjunto de todos os genes de um organismo é denominado genoma.
O fluxo da informação genética do DNA, em que uma sequência gênica apresenta uma informação para produzir uma proteína ou um RNA é conhecido como o dogma central da informação genética (Figura 1). O dogma central da informação genética, postulado por Francis Crick em 1957, envolve três etapas: replicação, transcrição e tradução.
Replicação. É o processo em que uma fita de DNA é copiada, ou duplicada. Esse processo corre antes da divisão celular, de forma que a nova célula possa herdar esta informação, preservando-a em uma fita de DNA. A replicação ocorre no núcleo da célula.
Transcrição: É o processo no qual uma informação contida na molécula de DNA é copiada na forma de RNA. O produto da transcrição é o RNA mensageiro (mRNA). Esse processo ocorre no núcleo da célula.
Tradução: É o processo no qual uma informação contida na molécula do RNA é traduzida na forma de uma cadeia polipeptídica. Esse processo ocorre nos ribossomos.
1.2.3 Variações ao dogma central da informação genética 
Variações ao dogma central são descritas a partir do conhecimento dos vírus de RNA como os flavivírus, arbovírus, retrovírus em que a molécula de RNA direciona a informação para a síntese de uma cópia de DNA. Nos retrovírus uma enzima denominada transcriptase reversa faz uma cópia de DNA a partir de uma molécula de RNA (Figura 1b). Outra variação ao dogma central é o conhecimento de pequenas partículas proteínáceas, resistentes aos métodos de inativação dos ácidos nucléicos, os príons PRPsc. Os príons PRPsc são autopropagáveis, podendo converter os príons PRPc fisiológicos em PRPsc, verificando-se assim uma replicação de proteínas (figura 1c).
Figura 1. A figura 1a descreve o dogma central da informação genética como proposto por Francis Crick em 1957 em que uma fita de DNA é copiada, ou duplicada. Quando a informação contida na molécula de DNA é copiada na forma de RNA, tem-se o processo da transcrição. A informação contida na molécula do RNA é traduzida na forma de uma cadeia polipeptídica em um processo denominado tradução. A figura 1b representa a variação do fluxo da informação genética em retrovírus (vírus de RNA, cuja informação genética é direcionada por transcrição reversa para fazer uma cópia de DNA) e a figura 1c em príons (partículas proteináceas autopropagáveis)
1.2.4 Tipos e funções do RNA
 
Os RNA possuem uma gama ampla de funções e várias classes são encontradas nas células, quais sejam; RNA ribossômico (rRNA), RNA mensageiros (mRNA) e os RNA de transferência (tRNA). 
RNA ribossômicos. Os RNA ribossômicos são componentes estruturais dos ribossomos, os complexos que realizam a síntese de proteínas. 
RNA mensageiro (mRNA) Os RNA mensageiro (mRNA) são intermediários que transportam a informação genética de um ou de uns poucos genes até o ribossomo, para a síntese das proteínas correspondentes. 
RNA de transferência (tRNA) Os RNA de transferência (tRNA) são moléculas adaptadoras, que traduzem fielmente a informação presente no mRNA numa seqüência específica de aminoácidos.
2. Estruturas dos nucleotídeos e nucleosídeos
Os nucleotídeos são moléculas orgânicas formadas por três componentes característicos: (1) uma base nitrogenada, (2) um monossacarídeo pentose e (3) um grupo fosfato. O nucleosídeo, por sua vez, é uma base nitrogenada ligada a uma pentose (Figura 2). As bases nitrogenadas são derivadas de dois compostos parentais, pirimidina e purina (figura 3). 
Figura 2. Esquematização das estruturas dos nucleotídeos e nucleosídeos de ribose. (a) Representa um ribonucleotídeo e (b) um ribonucleosídeo. O Símbolo β indica a configuração da ligação covalente que liga o carbono 1’ da pentose ao nitrogênio da base nitrogenada.
2.1 Pentoses do DNA e RNA
Os ácidos nucléicos possuem dois tipos de monossacarídeos com cinco átomos de carbono (pentose), que são ribose e desoxiborribose (Figura 3). A ribose é o açúcar do RNA, enquanto a desoxirribose é do DNA. Essas duas pentoses se diferenciam pela presença do grupo hidroxila (OH) no carbono-2 da ribose e pela presença de um átomo de H em vez de uma OH no C-2 da desoxirribose (Figura 3). Daí porque o RNA é um ácido ribonucléico e o DNA um ácido desoxirribonucléico. Em ambas as pentoses esse monossacarídeo é encontrado na forma (-furanosídica (anel fechado com cinco átomos e a OH do C-1 na configuração ().
Figura 3.Estruturas das pentoses ribose (RNA) e 2’D-desoxirribose (DNA)
Os anéis furanosídicos das pentoses ribose e 2’-desoxirribose não são estruturas planares (como demonstrado na Figura 3), mas ocorrem em conformações “pregueadas”, descritas como conformações C-2’ endo, C-2’ exo, C-3’ endo e C-3’ exo. A forma C-2’ endo apresenta a OH do carbono-2 (C-2) (Hidrogênio na 2’-desoxirribose) na mesma posição da OH do C-5, enquanto a forma exo apresenta a OH do C-2 em lado oposto a OH do C-5 (Figura 4). 
Figura 4. Conformação em pregas das pentoses dos ácidos nucléicos. A forma C-2’ endo apresenta a OH do C-2 (Hidrogênio no DNA) na mesma posição da OH do C-5, enquanto a forma exo apresenta a OH do C-2 em lado oposto a OH do C-5. Essas configurações endo e exo são encontradas também na posição da OH do C-3 dessas pentoses.
2.2 Bases do DNA e RNA
2.2.1 Bases principais do DNA e RNA
As bases dos nucleotídeos são compostos heterocíclicos. Os átomos de carbono e de nitrogênio nas estruturas parentais são numerados convencionalmente, para facilitar a nomeação e a identificação dos muitos compostos derivados. Nas pentoses dos nucleotídeos os números dos átomos de carbono recebem um apóstrofo (’) para distingui-los do número dos átomos de carbono das bases nitrogenadas. A base de um nucleotídeo se liga covalentemente pelo átomo de nitrogênio 1, (N-1) das pirimidinas e pelo nitrogênio 9 (N-9) das purinas por meio de uma ligação N-glicosídica ao carbono 1’ da pentose. Essa ligação covalente é denominada ligação N-β-glicosídica por que ocorre com o nitrogênio da base nitrogenada (N) e o açúcar ribose ou desoxirribose, cuja configuração é β (daí o termo β-glicosídica). A ligação N-(-glicosídica é formada por remoção de água (um grupo hidroxila da pentose e o hidrogênio da base). Como a OH do carbono um (C-1) da pentose apresenta configuração (, a ligação N-β-glicosídica apresenta configuração (. O grupo fosfato dos nucleotídeos se liga a OH do C-5 da pentose.
Tanto o DNA quanto o RNA contêm duas bases púricas principais, adenina (A) e guanina (G) e duas pirimidinas principais. Em ambos, DNA e RNA, uma das pirimidinas é a citosina (C), mas a segunda pirimidina principal é a timina (T) no DNA e a uracila (U) no RNA. Apenas raramente a timina ocorre no RNA ou a uracila no DNA. As estruturas das cinco principais bases são mostradas na figura 3 e a nomenclatura dos nucleotídeos e nucleosídeos correspondentes estão resumidas no quadro 1 e figura 4.
Figura 5. Bases purínicas e pirimidínicas.
2.2.2 A desaminação oxidativa da Citosina do DNA em uracila
A citosina do DNA pode sofrer perda espontânea do seu grupo amino exocíclico (fora da estrutura cíclica) produzindo uracila por meio de uma reação de desaminação oxidativa. A desaminação (perda do grupo amino) oxidativa ( e adição de oxigênio) da citosina em uracila ocorre em cerca de uma em cada 107 citosinas em um período de24h, o que corresponde a cerca de 100 eventos espontâneos por dia. 
A reação da desaminação oxidativa da citosina parece inócua, entretanto, é quase certamente a razão pela qual o DNA contém timina ao invés de uracila. O produto da desaminação oxidativa da citosina (a uracila) é facilmente reconhecido como DNA estranho e é removido por um sistema de reparo. Se o DNA normalmente contivesse uracila o reconhecimento das uracilas resultantes da desaminação oxidativa da citosina seria mais difícil e as uracilas não-reparadas levariam às alterações permanentes de seqüência, quando fossem pareadas com adeninas durante a replicação. 
A desaminação oxidativa da citosina levaria gradualmente a um decréscimo nos pares de bases G(C e num aumento nos pares de bases A(U no DNA de todas as células. Ao longo dos milênios, a desaminação oxidativa da citosina eliminaria os pares de bases G(C assim como o código genético que dependesse deles. Dessa forma, estabelecer a timina como uma das quatro bases a entrar na composição do DNA, pode bem ter sido um dos pontos-chave na evolução, tornando possível o armazenamento, por longo prazo, da informação genética. 
2.2.3 Nomenclatura das bases nitrogenadas, nucleosídeos e nucleotídeos
A nomenclatura utilizada para nomear as bases dos DNA e RNA, os quatro principais desoxirribonucleotídeos (desoxirribonucleosídeos 5’-monofosfato) e os quatro principais ribonucleotídeos (ribonucleosídeos 5’-monofosfato) é destacada na Tabela 1.
Tabela1: Nomenclatura das bases, ácidos nucléicos e nucleotídeos de DNA e RNA
	Base
	Nucleosídeo
	Nucleotídeo
	Ácido nucléico
	Adenina
	Adenosina
Desoxiadenosina
	Adenilato
Desoxiadenilato
	RNA
DNA
	Guanina
	Guanosina
Desoxiguanosina
	Guanilato
Desoxiguanilato
	RNA
DNA
	Citosina
	Citidina
Desoxocitidina
	Citidilato
Desoxicitidilato
	RNA
DNA
	Timina
	Timidina
Desoxitimidina
	Timidilato
Desoxitimidilato
	RNA
DNA
	Uracila
	Uridina
	Uridilato
	RNA
Na Figura 6 estão destacadas as estruturas químicas e a nomenclatura dos desoxinucleotídeos, ribonucleotídeos e seus respectivos nucleosídeos.
Figura 6. Estruturas químicas e nomenclatura dos desoxinucleotídeos, ribonucleotídeos e seus respectivos nucleosídeos.
2.2.2 Bases minoritárias do DNA e RNA
Tanto o DNA quanto o RNA possuem também algumas bases minoritárias (Figura 7). No DNA dos eucariotos as bases minoritárias são derivados metilados das bases principais, mas em alguns DNA virais certas bases podem ser hidroximetiladas ou glicosiladas. Tais bases alteradas nas moléculas do DNA são em muitos casos sinais específicos para a regulação ou a proteção da informação genética. Nos RNA, especialmente no tRNA são também encontradas bases minoritárias de diferentes tipos (Figura 7)
Como as bases principais, muitas possuem nomes comuns - como a hipoxantina, por exemplo, mostrada como seu nucleosídeo inosina. Quando um átomo no anel purínico ou pirimídico é substituído, a convenção usual é simplesmente indicar a posição da substituição no anel pelo seu número, por exemplo, 5-metilcitosina, 7-metilguanina e 5-hidroximetilcitosina, mostradas como nucleosídeos na figura 6. O elemento ao qual o substituinte é ligado (N, C, etc.) não é identificado. A convenção muda quando o átomo substituído é exocíclico (não dentro da estrutura do anel), neste caso o tipo de átomo é identificado e a posição do anel onde ele está ligado é anotada com um sobrescrito. O grupo amino ligado ao C-6 na adenina torna-se N6; semelhantemente, o oxigênio da carbonila e o grupo amino em C-6 e C-2 da guanina tornam-se O6 e N2, respectivamente. Exemplos desta nomenclatura são a N6-metiladenosina e a N2-metilguanosina.
Figura 7. Bases minoritárias e seus nucleosídeos de DNA e RNA A base minoritária do DNA Metilguanina, ligada a ribose forma o nucleosídeo deDNA denominado 1-Metilguanosina.A hipoxantina é uma base purínica derivada da guanina, que ligada a ribose forma o nucleosídeo inosina (encontrado no RNA transportador. Esse nucleosídeo é representado pela letra I. A 4-tiouracila é uma base derivada de RNA, derivada da uracila. Os nucleosídeos de 4-tiouracila são denominados 4-tiuridina. São encontrados no RNA transportador e são representados por S4U. A uracila ainda forma duas bases derivadas do RNA denominadas Pseudouracila e Diidrouracila, que formam os nucleosídeos Pseudouridina (() e diidrouridina (UH2 ou D0, respectivamente. A ribotimina é uma base modificada de timina, encontrada no RNA transportador. Ligado a ribose, a ribotimina forma o nucleosídeo ribotimidina.
2.2.3 Propriedades das bases púricas e pirimídicas dos nucleotídeos. 
a) Caráter básico. As purinas e pirimidinas livres são bases fracas. Apresentam uma variedade de propriedades químicas que afetam a estrutura e, finalmente, a função dos ácidos nucléicos. 
b) Ressonância. As purinas e as pirimidinas usuais no DNA e RNA são moléculas que apresentam ligações duplas conjugadas, uma propriedade com importantes conseqüências para a estrutura, a distribuição eletrônica e a absorção da luz dosácidos nucléicos. A ressonância envolvendo muitos átomos no anel confere à maioria das ligações um caráter parcial de dupla ligação. Um resultado é que as pirimidinas são moléculas planares e as purinas quase planares, com uma leve ruga. As bases purínicas e pirimidínicas livres podem existir em duas ou mais formas tautoméricas dependendo do pH. A uracila, por exemplo, ocorre tanto nas formas lactâmica quanto lactímica (Figura 8).
c) Absorção de luz no ultravioleta. Devido às bases apresentarem grupos cromóforos (capazes de absorver luz), como o anel aromático, todas as bases absorvem luz ultravioleta (UV) no comprimento de onda de 260nm. 
Figura 8. Formas ressonantes das bases nitrogenadas guanina e uracila.
c) Caráter apolar. As purinas e pirimidinas são moléculas apolares (hidrofóbicas) e relativamente insolúveis em água no pH em torno de 7,0. Em pH ácido ou alcalino as purinas e pirimidinas tornam-se carregadas e a sua solubilidade na água aumenta. Interações hidrofóbicas de empilhamento, em que duas ou mais bases são posicionadas com os planos dos seus anéis em paralelo (semelhantemente ao empilhamento de moedas), representam uma de duas maneiras importantes de interação entre duas bases. O empilhamento envolve uma combinação de interações van der Walls e dipolo-dipolo entre as bases. Essas interações de empilhamento das bases ajudam a minimizar o contato com a água e são muito importantes na estabilização da estrutura tridimensional dos ácidos nucléicos, como será descrito posteriormente.
d) Pareamento por pontes de hidrogênio. Os grupos funcionais mais importantes das pirimidinas e purinas são os nitrogênios do anel, os grupos carbonila e amino exocíclicos. As pontes de hidrogênio envolvendo os grupos amino e carbonila é o segundo modo de interação mais importante entre as bases. As pontes de hidrogênio entre as bases permitem uma associação complementar de duas e ocasionalmente três fitas de ácido nucléico. Os padrões de pontes de hidrogênio mais comuns na estrutura do DNA são os definidos por James Watson e Francis Crick em 1953 em que a adenina (A) liga-se especificamente a timina (T) ou Uracila (U) e guanina (G) liga-se a citosina (C) (Figura 9). Estes dois tipos de pares de bases predominam nas fitas duplas de DNA e RNA. É este pareamento específico de bases que permite a duplicação da informação genética.
Figura 9. Pareamento de bases entre purinas e pirimidinas
3. Formação dos nucleotídeos poliméricos – A ligação fosfodiéster
Os nucleotídeos no DNA e RNA são ligados covalentemente por “pontes” de grupos fosfato, numa reação catalisada na célula por DNA polimerases (na replicação do DNA) e por RNA polimerases (na síntese de RNA). Essa reação ocorre com a OH do grupo fosfato ligado ao C-5’ de uma pentose de uma unidade nucleotídica com a OH do C-3’ da pentose do nucleotídeo seguinte, produzindo uma reação covalente denominada ligação fosfodiéster (Figura 10a). 
3.1 Polaridade do esqueleto covalente dos ácidos nucléicos.
O esqueleto covalente dos ácidos nucléicos consiste de resíduos fosfatos (carregados negativamente no pH 7,0) e pentose alternados (fosfodesoxirribose no DNA e fosforribose no RNA), daí porque esse esqueleto covalente é hidrofílico. As bases nitrogenadas são grupos laterais unidos ao esqueleto covalente desses nucleotídeos a intervalos regulares. Os grupos hidroxila dos resíduos de açúcar formam pontes de hidrogênio com a água. Os grupos fosfato são carregados negativamente em pH 7,0, permitindo a esses grupos interagirem por meio de ligações iônicas com grupo com cargas positivas nas proteínas, com íons metálicos e com poliaminas. 
Todas as ligações fosfodiésteres possuem a mesma orientação ao longo da cadeia, conferindo a cada fita linear do ácido nucléico uma polaridade específica e distinta nas extremidades 5’ e 3’. A extremidade 5’ contém uma hidroxila (OH) livre ligada ao fosfato do C-5’ da pentose e a extremidade 3’ contém uma OH do carbono 3’ da pentose (Figura 10a). Por convenção estabeleceu-se que a extremidade 5’ apresenta o primeiro nucleotídeo e a extremidade 3’ o último nucleotídeo do ácido nucleico.
3.1 A estrutura primária dos ácidos nucléicos
A estrutura primária do DNA é a sua sequência de desoxirribonucleotídeos, enquanto a do RNA é a seqüência de ribonucleotídeos. A estrutura primária de um segmento de DNA contendo cinco unidades de desoxirribonucleotídeos é representada na Figura 10b. Nessa sequência as ligações fosfato são simbolizadas por P e cada desoxirribose por uma linha vertical, do C-1’, no topo, até o C-5’ na base. As linhas que ligam os nucleotídeos (por meio de P) são desenhadas diagonalmente a partir do meio (3’) da desoxirribose de um nucleotídeo até a base (5’) do nucleotídeo seguinte. Por convenção, a estrutura de uma fita simples do ácido nucléico é sempre escrita com a extremidade 5’ na esquerda e a extremidade 3’ na direita; isto é, na direção 5’→3’. 
Algumas representações mais simples deste penta desoxirribonucleotídeo são pA-C-G-T-AOH, pApCpGpTpA ou pACGTA. Um ácido nucléico pequeno é referido como um oligonucleotídeo. A definição de “pequeno” é algo arbitrária, entretanto polímeros contendo 50 nucleotídeos ou menos são geralmente denominados oligonucleotídeos. Um ácido nucléico mais longo é denominado polinucleotídeo.
Figura 10. (a) Ligação covalente fosfodiéster que une os nucleotídeos e (b) representação da estrutura primária de um oligonucleotídeo.
3.2 Hidrólise alcalina de RNA
O esqueleto covalente do DNA e RNA está sujeito a hidrólise lenta, não-enzimática, da ligação fosfodiéster. No tubo de ensaio o RNA é hidrolisado rapidamente quando em condições alcalinas, mas o DNA não. Essa hidrólise alcalina do RNA se deve a presença do grupo hidroxila (OH) no C-2’ da ribose do RNA. Como o DNA é um desoxiaçúcar, não apresentando essa OH no C´-2, o DNA não sofre hidrólise alcalina. A hidrólise alcalina do RNA produz compostos monofosfato 2’, 3’ cíclico e uma mistura de nucleosídeos 2’-monofosfato e 3’-monofosfato, resultantes da hidrólise espontânea do monofosfato 2’, 3’ cíclico (Figura 11).
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Figura 11. Hidrólise alcalina do RNA produzindo um RNA encurtado de uma derivado 2’ 3’ monofosfatos cíclicos, que em meio aquoso podem sofrer hidrólise, produzindo misturas de nucleotídeos 2’ e 3’-monofosfatos.
5. O DNA armazena a informação genética
A investigação bioquímica do DNA começou com Friedrich Miescher, que realizou os primeiros estudos químicos sistemáticos do núcleo da célula. Em 1868, Miescher isolou uma substância contendo fósforo de pus (leucócitos) que denominou “nucleína”. A nucleína consiste de uma porção ácida, (o grupo fosfato do DNA) e de uma porção básica (proteínas histonas). Miescher descobriu depois uma substância com caráter ácido (semelhante à nucleína) no esperma do salmão.
Miescher e muitos outros suspeitavam que a nucleína (ácido nucléico) estava associada com a herança celular, mas a primeira evidência direta de que o DNA é a molécula repositória da informação genética só foi proposta em 1944 por Oswald T. Avery, Colin MacLeod e Maclyn McCarty. Esses pesquisadores encontraram que o DNA extraído de uma cepa virulenta (causadora de doença) da bactéria Streptococcus pneumoniae, também conhecida como pneumococo, transformava geneticamente uma cepa não-virulenta deste organismo numa forma virulenta (Figura 12). Avery e seus colegas concluíram que o DNA extraído da cepa virulenta transportava a mensagem da virulência transmitida geneticamente. Nem todos aceitaram essas conclusões, porque alegavam que traços de impurezas protéicas presentes no DNA poderiam ter sido o transportador real da informação genética. Esta possibilidade logo foi eliminada pelo achado de que o tratamento do DNA com enzimas proteolíticas não interferia na atividade transformadora, mas o tratamento com desoxirribonucleases (enzimas que hidrolisam o DNA) sim.
Um segundo experimento importante forneceu a evidência independente de que o DNA transportava a informação genética. Em1952, Alfred D. Hershey e Martha Chase usaram o rastreamento com o fósforo radioativo (32P) e o enxofre radioativo (35S) para mostrar que quando o vírus bacteriano (bacteriófago T2) infecta sua célula hospedeira, a Escherichia coli, é o fósforo contido no DNA da partícula viral, e não o enxofre contido na proteína da capa viral, que entra na célula hospedeira e fornece a informação genética para a replicação viral (figura 13). Esses importantes experimentos e muitas outras evidências mostraram que o DNA é definitivamente o componente cromossômico que possui a informação genética das células vivas.
Figura 12. O experimento de Oswald T. Avery e colaboradores. Em 1928, Frederick Griffth, um médico londrino, em experimentos com Pneumococcus, células bacterianas causadoras de pneumonia, descobriu o fenômeno da transformação, observando inicialmente (a) que peneumococos encapsulados, patogênicos, quando inoculados em camundongos são letais, diferentemente de cepas de pneumococos não encapsuladas (b), que não são patogênicas. As cepas de pneumococos patogênicos quando destruídas (c) quando inoculadas em camundongos não são letais. Pneumococcus patogênicos, portadores de cápsulas, quando mortos por calor e colocados em contato com células de uma linhagem não encapsulada, e não patogênica (d), era capaz de transformar as células não patogênicas em células patogênicas encapsuladas e letais Avery e colaboradores, baseados no experimento de Griffith, separaram o extrato celular em várias frações (proteínas, DNA, RNA, lipídeos e carboidratos) e repetiram o experimento com os Pneumococcus (e). Apenas a fração contendo DNA recuperou a capacidade das bactérias formarem novamente a cápsula. A fração de DNA não perdia a sua capacidade transformante quando tratada com proteases ou quando era aquecido, todavia, o mesmo não valia para o tratamento com DNAse.
Figura 13. O experimento de Hershey e Martha Chase. Para esse experimento marcaram-se duas culturas de fagos T2, uma com fosfato radioativo (32P) e outra com enxofre radioativo (35S), sendo que o fosfato se incorporaria ao DNA e o enxofre às proteínas. De infecções paralelas de E. coli com fagos marcados com enxofre e fosfato radioativos foram tiradas amostras em diferentes tempos e estas, foram agitadas em um liquidificador de forma a separar as cápsulas dos fagos das bactérias. Após isso, as culturas foram centrifugadas, pois as cápsulas virais ficariam no sobrenadante e as células ficariam no precipitado. Foi constatado que grande parte do 32P ficava na fração bacteriana, enquanto que a maior parte da fração protéica ficava no sobrenadante. Dessa forma, Hershey e Chase constataram que o que passava para dentro da bactéria, e que era responsável pela formação dos outros fagos, era o DNA e não as proteínas.
6 A estrutura secundária do DNA: O modelo da dupla-hélice
A estrutura secundária do DNA é a estrutura regular, estável, adotada por alguns ou todos os nucleotídeos de um ácido nucléico. No DNA a estrutura secundária é a dupla hélice. Dois experimentos realizados de forma independente, o primeiro por Chargaff e o segundo por Rosalind Franklin e Maurice Wilkins forneceram as pistas mais importantes na determinação da estrutura do DNA em 1953 por James Watson e Francis Crick. 
6.1 Regras de Chargaff.
Em 1940 Erwin Chargaff e colaboradores trabalhando com DNA extraído de diferentes espécies fizeram às seguintes conclusões:
1. A composição de bases do DNA varia de uma espécie para outra;
2. Espécimes de DNA isoladas de diferentes tecidos da mesma espécie possuem a mesma composição de bases;
3. A composição de bases do DNA numa dada espécie não se altera com a idade do organismo, estado nutricional ou alteração ambiental;
4. Em todos os DNA celulares, independente da espécie, o número de resíduos de adenosina é igual ao número de resíduos de timidina (ou seja, A = T) e o número de resíduos de guanosina é igual ao número de resíduos de citidina (G = C). A partir dessas relações segue-se que a soma dos resíduos das purinas é igual à soma dos resíduos de pirimidina, ou seja, A + G = T + C.
Essa relação quantitativa em que a soma de purina é igual à soma de pirimidina é denominada “regra de Chargaff”. Esse achado foi crucial na elucidação da estrutura tridimensional do DNA, além disso, forneceu pistas de como a informação genética é codificada e passa de uma geração para a outra.
6.2 Experimentos de difração de Raios X do DNA
Rosalind Franklin e Maurice Wilkins mostraram, no início da década de 50 que o DNA produzia um padrão de difração de raios-X característico (Figura 14). A partir desse padrão eles deduziram que os polímeros de DNA são helicoidais com duas periodicidades ao longo do seu eixo maior, uma primeira de 3,4 Å e uma segunda de 34 Å. O problema era então formular um modelo tridimensional da molécula do DNA que poderia considerar não apenas os dados da difração dos raios-X, mas também as equivalências de bases específicas A = T e G = C, propostas por Chargaff.
Figura 14. Padrão de difração de raios x do DNA
6.3 A Dupla-hélice do DNA
Em 1953, o norte americano James Watson e o britânico Francis Crick, propuseram um modelo teórico para explicar a estrutura secundária do DNA, a dupla hélice. Na proposição desse modelo eles utilizaram os seguintes dados:
1. A natureza química dos desoxinucleotídeos;
2. A relação quantitativa entre as bases nitrogenadas descritas por Chargaff;
3. Os dados de difração de raios-X obtidos por Rosalind Franklin e Maurice Wilkins.
O modelo teórico para a estrutura secundária do DNA (dupla hélice), proposto por James Watson e Francis Crick, consiste de duas cadeias helicoidais de DNA enroladas ao redor do mesmo eixo formando uma dupla hélice que gira no sentido da mão direita (Figura 15). O esqueleto hidrofílico de grupos alternantes desoxirribose e fosfatos carregados negativamente estão na parte externa da dupla hélice, voltado para a água circundante. As bases purínicas e pirimidínicas de ambas as fitas estão empilhadas na parte interna da dupla hélice, com suas estruturas hidrofóbicas de anel quase planar muito próximas e perpendiculares ao longo eixo da hélice. 
O pareamento das bases entre as duas fitas cria um sulco principal e um sulco secundário na superfície da fita dupla (Figura 15a). A formação desses sulcos se devem ao fato de que a ligação N-β-glicosídica de um par de base não ser diametralmente oposta uma a outra. Cada base de uma fita está pareada no mesmo plano com uma base da outra fita, por formação de pontes de hidrogênio. Esse pareamento das pares ocorre entre uma guanina de uma fita com uma citosina de outra fita (G(C) e entre adenina de uma fita com a timina de outa fita (A=T). Esse pareamento é o clássico pareamento de base, proposto por Watson e Crick, e daí ser denominado pareamento do tipo Watson e Crick.
É importante observar que três pontes de hidrogênio são formadas entre os pares G e C (G(C), mas apenas duas se formam entre os pares A e T, (A(T). Isso explica o porquê da separação das fitas pareadas do DNA requerer mais energia quanto maior for o quociente entre as bases G(C e A(T. 
Para explicar as periodicidades observadas por Rosalind Frankin e Maurice Wilkins no padrão da difração de raios-X das fibras de DNA, Watson e Crick usaram modelos moleculares para mostrar que as bases empilhadas verticalmente dentro da dupla hélice estariam separadas por 3,4 Å e que a repetição secundária de 34 Å seria devido à presença de 10 resíduos de nucleotídeos em cada volta completa da dupla hélice. Em solução aquosa a estrutura difere ligeiramente daquelas das fibras, possuindo 10,5 pares de bases por volta da hélice (Figura 15a).
As duas cadeias polinucleotídicas antiparalelas da dupla hélice não são idênticas nem na composição nem na seqüência de bases. Na verdade elas são complementares entre si. Para cada adenina de uma fita, na outra fita será encontrada timina. O mesmo é observado para os resíduos de guanina, que fazem pareamentocom citosina. A dupla hélice do DNA ou dúplex é mantida unida por duas interações químicas não covalentes: pontes de hidrogênio (entre os pares de bases complementares) e as interações de empilhamento das bases (Figuras 15 b e 15c). A complementaridade entre as fitas de DNA é atribuída às pontes de hidrogênio entre pares de bases. As interações de empilhamento das bases, que são em grande parte inespecíficas com respeito à identidade das bases empilhadas, dão a maior contribuição para a estabilidade da dupla hélice. As interações químicas de empilhamento das bases são ligações não covalentes fracas como van der Walls, dipolo-dipolo e hidrofóbica. A interação hidrofóbica é a que mais contribui no empilhamento dessas bases.
As características importantes do modelo de estrutura da dupla hélice do DNA são apoiadas por muita evidência química e biológica. Além disto, o modelo imediatamente sugere um mecanismo para a transmissão da informação genética. A característica essencial do modelo é a complementaridade das duas fitas do DNA. Como Watson e Crick foram capazes de ver, muito antes que os dados confirmatórios se tornassem disponíveis, esta estrutura poderia logicamente ser replicada pela (1) separação das duas fitas e (2) síntese de uma fita complementar para cada uma. 
Figura 14. (a) Estrutura secundária do DNA, a dupla hélice e (b) pareamento de bases entre as fitas antiparalelas. (c) Modelo espaço cheio da dupla hélice destacando o esqueleto covalente hidrofílico de fosfodesoxirribose em azul e amarelo e o empilhamento das bases hidrofóbicas no interior da hélice.
Pelo fato dos nucleotídeos em cada nova fita estarem unidos numa seqüência especificada pelas regras de pareamento de bases expressas acima, cada fita pré-existente poderia funcionar como um molde para guiar a síntese de uma fita complementar (Figura 16). Estas expectativas foram confirmadas experimentalmente, inaugurando uma revolução na compreensão da herança genética.
Figura 16. Replicação do DNA semiconservativa, em que a fita parental serve de molde para a síntese de uma fita nova.
6.4 Conformações variantes do DNA
O DNA é uma molécula notavelmente flexível devido à rotação em torno de várias ligações do esqueleto de fosfodesoxirribose e a flutuação térmica que produz curvatura, estiramento e despareamento (fusão) das fitas. Muitos desvios significativos da estrutura Watson-Crick do DNA são encontrados no DNA celular e alguns, ou todos eles, podem desempenhar papéis importantes no metabolismo do DNA. Essas variações estruturais geralmente não afetam as propriedades do DNA definidas por Watson e Crick: complementaridade das fitas, fitas antiparalelas e o requerimento de pares de bases A(T e G(C.
As variações estruturais do DNA são explicadas por três fatores:
As possíveis conformações diferentes do esqueleto fosfodesoxirribose (Figura 17a); 
Rotação nas ligações covalentes contíguas que compõe o esqueleto covalente de fosfodesoxirribose (Figura 16a);
A rotação livre sobre a ligação N-glicosídica entre o C-1 da desoxirribose e o N-1 da pirimidina ou N-9 das purinas. Por causa de impedimentos estéricos, os nucleotídeos purínicos e pirimidínicos são restritos a duas conformações estáveis com respeito à desoxirribose, denominadas sin e anti (Figura 17b). As pirimidinas são geralmente restritas à conformação anti por causa do impedimento estérico entre o açúcar e o oxigênio da carbonila no C-2 da pirimidina. 
Figura 17. a) Rotação em torno de 7 ligações covalentes no esqueleto fosfodesoxirrbose do DNA. (b) Conformações anti e sin da ligação N-glicosídica.
O DNA pode apresentar três diferentes conformações com as formas A, B e Z (Figura 18). A estrutura Watson-Crick é também referida como forma B do DNA, ou B-DNA. A forma B é a estrutura mais estável para uma seqüência ao acaso da molécula do DNA em condições fisiológicas e é, portanto, o padrão de referência em qualquer estudo das propriedades do DNA. Duas variantes estruturais do DNA, que foram bem caracterizadas em estruturas de cristais, são as formas A e Z. Estas três conformações do DNA são mostradas na figura 17. 
6.4.1 A conformação A do DNA
A forma A do DNA ocorre em soluções que contém reagentes que promovam sua desidratação. O DNA arranja-se em uma dupla hélice com enrolamento à direita. Essa conformação apresenta um hélice mais larga, com onze pares de bases por volta da hélice. O plano dos pares de bases no DNA A é inclinado cerca de 20( com respeito ao eixo da hélice (Figura 18). Estas alterações estruturais aprofundam o sulco principal enquanto tornam o sulco secundário mais raso. Os reagentes utilizados para promover a cristalização do DNA causam eliminação de água, e desta forma a maioria das moléculas de DNA cristaliza na forma A (Tabela 2).
6.4.2 A conformação Z do DNA
A forma Z do DNA apresenta uma hélice com enrolamento à esquerda, tendo doze pares de bases por volta. Essa estrutura é mais delgada e alongada do que as formas A e B do DNA (Figura 18). O esqueleto de fosfodesoxirribose do DNA toma a aparência de um ziguezague. Certas seqüências de nucleotídeos dobram-se em hélices Z, de sentido da mão esquerda, mais facilmente que outras. Exemplos proeminentes são as seqüências onde pirimidinas se alternam com purinas, especialmente alternando os resíduos C e G ou 5-metil-C e G. Para formar a hélice no sentido da mão esquerda no DNA Z, os resíduos de purinas movem se para a conformação sin, alternando com as pirimidinas na conformação anti. O sulco principal dificilmente é aparente no DNA Z, e o sulco secundário é estreito e fundo. 
Se a ocorrência do DNA A em células é incerta, há evidência para alguns pedaços curtos (trechos) de DNA Z tanto em procariotos e eucariotos. Estes trechos de DNA Z podem desempenhar um papel (ainda não definido) na regulação da expressão de alguns genes ou na recombinação genética.
Figura 18. Estruturas secundárias do DNA
Tabela 2 Comparação entre as diferentes conformações do DNA
	Tipo de Hélice
	
	DNA A
	DNA B
	DNA Z
	Forma
	Mais larga
	Intermediária
	Mais estreita
	Sentido da hélice
	Direita
	Direita 
	Esquerda 
	Diâmetro da hélice
	26Å
	20Å
	18Å
	Número de par de bases por giro da hélice
	11
	10,5
	12
	Distância entre par de bases
	2,6Å
	3,4Å
	3,7 Å
	Inclinação do par de bases em relação ao eixo
	20Å
	6 Å
	7 Å
	Conformação da ligação glicosídica
	Anti
	Anti
	Anti (pirimidina) e 
Sin (purinas)
7. Alterações estruturais do DNA 
Diferentes alterações estruturais foram detectadas em cromossomos grandes, e podem afetar a função e o metabolismo de segmentos de DNA, como curvaturas, palíndromo, repetição espelho, entre outras.
7.1 Curvaturas. Curvaturas ocorrem na hélice do DNA toda vez que quatro ou mais resíduos de adenosina aparecem sequencialmente numa fita. Seis adenosinas em fila produzem uma curvatura de 18(. A curvatura observada com esta e outras seqüências podem ser importantes para a ligação de algumas proteínas ao DNA.
7.2 Palíndromo. O termo palíndromo é aplicado a regiões do DNA em que há repetições invertidas da seqüência de bases com simetria dupla ocorrendo nas duas fitas do DNA (Figura 19). Tais seqüências são autocomplementares dentro de cada uma das fitas e, portanto, têm o potencial de formar estruturas tipo grampo ou cruciforme (Figura 20). 
7.3 Repetição espelho. Quando a repetição invertida ocorre dentro de cada fita individual do DNA, a seqüência é chamada de repetição espelho. Repetições espelho não possuem seqüências complementares dentro da mesma fita e não conseguem formar estruturas grampo ou cruciforme. Seqüências deste tipo são encontradas em toda molécula grande de DNA e podem envolver de alguns até milhares de pares de bases. 
.
Figura 19. Estruturas poucos comuns do DNA, palíndromo e espelho invertido.
Figura 20. Estruturas em grampo e cruciforme do DNA formada a partir de segmentos do tipo palíndromo e espelho invertido
8. A estrutura do RNA
Aforma estrutural básica dos nucleotídeos de RNA é uma fita simples em espiral que se arranja, na maioria das vezes, formando estruturas secundárias denominadas hastes. A formação dessas hastes se deve às pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas dos nucleotídeos da própria cadeia que dobra sobre ela mesma, proporcionando a formação dessas estruturas. Nas regiões do RNA em que não ocorre pareamento de bases são encontradas as alças. As moléculas de RNA pode também formar estruturas em forma de pregas que dão a conformação desse nucleotídeo um aspecto de grampo de cabelo. Essas estruturas em grampo de cabelo são características das moléculas de tRNA e rRNA (Figura 21).
O RNA não possui uma estrutura secundária regular e simples que sirva como um ponto de referência, como é a dupla hélice do DNA. As estruturas tridimensionais dos RNA são complexas e únicas. Interações fracas, especialmente interações de empilhamento de bases desempenham um papel principal na estabilização das estruturas do RNA. Quando seqüências complementares estão presentes, a estrutura de fita dupla predominante é uma forma de dupla hélice do tipo A, que se enrola no sentido da mão direita. Hélices de forma Z têm sido obtidas no laboratório (sob alta concentração salina ou temperatura elevada). A forma B do RNA não tem sido observada. Quebras na hélice regular da forma A causadas por bases mal ou não-pareadas em uma ou em ambas as fitas são comuns, resultam em saliências ou alças internas (Figura 21). Alças em grampo formam-se entre seqüências quase autocomplementares na fita do RNA. Hastes são estruturas helicoidais pareadas por bases em muitos RNAs (Figura 21) e os grampos resultantes podem ser considerados o tipo mais comum de estrutura secundária no RNA. Seqüências de bases curtas (por exemplo, UUCG) são freqüentemente encontradas nas extremidades dos grampos de RNA, podendo formar alças. Essas seqüências podem desempenhar um papel importante no enrolamento de uma molécula de RNA na sua estrutura tridimensional precisa. Importantes contribuições estruturais adicionais são feitas pelas pontes de hidrogênio que não fazem parte do pareamento de bases padrão de Watson-Crick. Por exemplo, o grupo OH do C-2’ da ribose pode formar uma ponte de hidrogênio com outros grupos. Algumas destas propriedades são evidentes na estrutura do tRNA.
Figura 21. Seqüências codificadoras e não codificadoras do RNA: RNA monocistrônico e RNA policistrônico. (a) Estrutura do RNA
8.1 RNA mensageiro. A molécula de mRNA não possui tais grampos, devido à necessidade ser uma fita linear para que possa ser “lida” pelos ribossomos durante a síntese protéica. O mRNA é responsável pelo código genético para a síntese protéica, estabelecido entre ele e o DNA, sendo que a seqüência de três nucleotídeos do DNA corresponde à seqüência de três nucleotídeos do mRNA (códon) que, por sua vez, corresponde a um aminoácido específico no processo de síntese protéica. O seu processo de síntese é denominado transcrição e é um dos processos mais importantes para a manutenção das características celulares, uma vez que qualquer erro que haja pode ocorrer em erro na tradução do código genético e o conseqüente erro na síntese protéica. 
Nos procariotos uma única molécula de mRNA pode codificar uma ou várias cadeias polipeptídicas. Se ela transporta o código para apenas um polipeptídio, o mRNA é monocistrônico, se ela codifica dois ou mais polipeptídios, o mRNA é policistrônico (Figura 22). Nos eucariotos, a maioria dos mRNA são monocistrônicos. O comprimento mínimo de um mRNA é determinado pelo comprimento da cadeia polipeptídica que ele codifica. Por exemplo, a cadeia polipeptídica de 100 resíduos de aminoácidos requer uma seqüência codificadora de mRNA de pelo menos 300 nucleotídeos, pelo fato de cada aminoácido ser codificado por uma trinca de nucleotídeos. Entretanto, os mRNA transcritos do DNA são sempre um pouco mais longos do que o simplesmente necessário para especificar a seqüência do polipeptídio (ou seqüências). O RNA adicional, não-codificador, inclui seqüências que regulam a síntese de proteínas.
Figura 22. Seqüências codificadoras e não codificadoras do RNA: RNA monocistrônico e RNA policistrônico. 
8.2 O tRNA de transferência. O tRNA transporta os aminoácidos para a síntese protéica mediada pelo mRNA. Existem 20 tipos de tRNA (um para cada aminoácido), possuindo quatro domínios comuns: 
O ponto de ligação com o aminoácido que transporta, sempre a seqüência ACC na extremidade 3’;
Alça D, com a presença do nucleotídeo diidrouridina (formado por hidroxilação da uracila); 
Alça T com a presença de timina formada por metilação da uracila (ribotimidina); e 
Alça do anticódon, que possui a seqüência que se ligará ao mRNA no ribossomo durante a síntese protéica (Figura 23). Na molécula de tRNA é observada a presença de outras bases modificadas como a pseudouridina (Ψ) e, algumas vezes, um mesmo tipo de tRNA pode apresentar ou C ou G em áreas em que não há formação de pregas, representado na estrutura simplesmente como uma pirimidina (Y).
Figura 23. Estrutura secundária do tRNA do aminoácido fenilalanina.
8.3 RNA ribossômico. O rRNA tem função estrutural, sendo um dos componentes moleculares que entra na composição molecular dos ribossomos, local da síntese protéica. O rRNA possui uma estrutura extremamente pregueada onde se revelam domínios responsáveis pela estrutura tridimensional final dos ribossomos. Os ribossomos são compostos por duas subunidades de rRNA que diferem de acordo com o coeficiente de sedimentação obtido por ultracentrifugação (S). Em ribossomos dos eucariotos, o rRNA é uma organela de 80S, composto pelas subunidades 40S e 60S. Na fração 80S o rRNA se liga a 33 proteínas e na fração 60S ele se liga a 49 proteínas. O rRNA dos procariotos é menos complexo, possuindo duas subunidades de 30S e 50S. Na fração 30S o rRNA se liga a 21 proteínas e na fração 50S a 31 proteínas, constituindo uma unidade de 70S (Figuras 24 e 25).
Figura 24. Representação esquemática de uma molécula de rRNA 16s de E. coli e seus quatro domínios.
Estruturas em grampos são freqüentes nessa molécula.
Figura 25. Representação esquemática da conformação de um rRNA de um eucarioto.
9. A química do ácido nucléico
Para compreender como os ácidos nucléicos funcionam precisamos entender tanto sua estruturas quanto suas propriedades químicas. O DNA funciona bem como reservatório da informação genética, em parte por causa da sua inerente estabilidade. As transformações químicas que ocorrem são geralmente muito lentas na ausência de um catalisador enzimático. O armazenamento da informação por longos períodos sem alteração é tão importante para uma célula, que mesmo reações muito lentas que alteram a estrutura do DNA podem ser fisiologicamente significantes. Processos como carcinogênese e envelhecimento podem estar intimamente ligados ao lento acúmulo de alterações irreversíveis do DNA. Outras alterações não-destrutivas, como a separação das fitas que devem preceder a replicação ou a transcrição, são também importantes. Além de fornecer estes discernimentos nos processos fisiológicos, nossa compreensão da química do ácido nucléico tem-nos dado um conjunto poderoso de tecnologias que têm aplicações na biologia molecular, medicina e ciência forense. Examinamos agora as propriedades químicas do DNA e algumas destas tecnologias.
9.1 Desnaturação (fusão) e anelamento do DNA
Soluções de DNA nativo cuidadosamente isoladas são altamente viscosas em pH 7 e à temperatura ambiente (25oC). Quando tal solução é submetida a soluções que apresentam valores extremos de pH ou a temperaturas acima de 80oC, sua viscosidade diminui rapidamente, indicando que o DNA sofreu uma alteração física. A exposição de DNA a calor e extremos de pH causa desnaturação ou fusão da dupla hélice do DNA, que se dá com a ruptura das pontes de hidrogênio entre o pareamento das bases e no desenrolamento e separação da dupla hélice para formar duas fitassimples, completamente separadas entre si ao longo de toda a extensão, ou parte da extensão (fusão parcial). No processo da fusão nenhuma ligação covalente no DNA é quebrada, mas apenas as interações não covalentes como pontes de hidrogênio entre as bases e interação van der Waals, dipolo-dipolo e hidrofóbica que proporciona o empilhamento das bases no interior da hélice (Figura 26).
Figura 26. Fusão e anelamento do DNA.
A interação íntima entre as bases empilhadas num ácido nucléico diminui a sua absorção da luz UV, em relação àquela de uma solução com a mesma concentração de nucleotídeos livres, e a absorção é menor quando dois ácidos nucléicos complementares são pareados. Isto é denominado efeito hipocrômico. A fusão de uma fita dupla de ácidos nucléicos produz o resultado oposto, um aumento na absorção chamada de efeito hipercrômico. A transição de uma fita dupla de DNA a uma fita simples, forma em que as fitas estão separadas, pode, portanto ser detectada pelo monitoramento da absorção da luz UV (Figura 27).
Figura 27. Efeito hipercrômico observado na fusão do DNA.
Moléculas de DNA viral ou bacteriano em solução sofrem fusão a temperaturas características quando elas são aquecidas lentamente. Cada espécie de DNA possui uma temperatura de fusão característica ou ponto de fusão (tm): quanto maior o seu conteúdo de pares de bases G(C maior o ponto de fusão do DNA. Isto porque os pares de bases G(C, com três pontes de hidrogênio, são mais estáveis e requerem mais energia calorífica para dissociar do que os pares de bases A(T. A determinação cuidadosa do ponto de fusão de um espécime de DNA, em condições fixas de pH e força iônica, pode fornecer uma estimativa da sua composição em bases. Se as condições que favorecem a fusão do DNA forem cuidadosamente controladas, as regiões que são ricas em pares de bases A(T serão especificamente desfeitas, enquanto a maioria do restante do DNA permanecerá como fita dupla. Essas regiões do DNA que tiveram rupturas dos pares de bases A=T (denominadas bolhas) podem ser visualizadas com a microscopia eletrônica. A separação das fitas do DNA ocorre in vivo durante a replicação e a transcrição. As regiões do DNA em que esses processos se iniciam são freqüentemente ricos em pares de bases A(T.
Duplex de duas fitas de RNA, ou com uma fita de RNA e uma fita de DNA (híbridos RNA-DNA), podem também sofrer fusão. Os dúplex de RNA são mais estáveis que os dúplex de DNA. Em pH neutro, uma dupla hélice de RNA sempre fundirá a temperaturas 20oC ou mais altas que uma fusão de um molécula de DNA com uma seqüência comparável. A estabilidade de um híbrido RNA-DNA é geralmente intermediária entre aquela do RNA e a do DNA. A base física para estas diferenças de estabilidade não é conhecida.
9.2 Ácidos nucléicos de diferentes espécies podem formar híbridos
A capacidade de duas fitas complementares de DNA formarem pares de bases uma com a outra pode ser usada para detectar seqüências de DNA semelhantes em duas espécies diferentes ou dentro do genoma da mesma espécie. Se os dúplex de DNA isolados de células humanas e de células de camundongos forem completamente separados pelo calor, e misturados e mantidos a 65oC por muitas horas, muitos seguimentos do DNA se anelarão. A maioria das fitas do DNA de camundongo se anelará com fitas complementares do DNA de camundongo; da mesma forma que muitos seguimentos das fitas do DNA humano se anelarão com fitas complementares do DNA humano. Entretanto, algumas fitas do DNA de camundongo se associarão com fitas de DNA humano produzindo dúplex híbridos, em que segmentos da fita do DNA de camundongo formam regiões de pares de bases com segmentos da fita do DNA humano (Figura 28). Isto reflete o fato de que diferentes organismos possuem uma herança evolucionária comum; eles geralmente possuem algumas proteínas e RNA com funções semelhantes e, freqüentemente, estruturas similares. Em muitos casos o DNA que codifica estas proteínas e RNA terá seqüências semelhantes. Quanto mais próxima a relação evolucionária entre as espécies mais extensamente seus DNA se hibridizarão. Por exemplo, o DNA humano hibridiza muito mais extensamente com o DNA do camundongo do que com o DNA da levedura.
A hibridização das fitas de DNA de diferentes fontes forma a base de um conjunto de técnicas poderosas, essenciais à prática moderna da genética molecular. É possível detectar uma seqüência específica de DNA ou gene na presença de muitas outras seqüências, se já tivermos uma fita de DNA complementar apropriada (usualmente marcada de alguma forma) para hibridizarmos com ela. O DNA complementar pode ser de uma espécie diferente ou da mesma espécie; em alguns casos ele é sintetizado no laboratório, usando técnicas descritas posteriormente neste capítulo. Técnicas de hibridização podem variar para detectar um RNA específico ao invés de um DNA. O isolamento e a identificação de genes específicos e RNA baseiam-se nestas técnicas e novas aplicações desta tecnologia têm permitido identificar acuradamente um indivíduo, baseando-se num único cabelo deixado na cena do crime, ou predizer o início de alguma doença num indivíduo décadas antes dos sintomas aparecerem.
Figura 28. Propriedade da hibridação do DNA. As fitas separadas de DNA humano formarão preferencialmente dúplices com elas mesmas, mas podem também formar pareamentos com regiões complementares do DNA de camundongos, formando fitas híbridas.
10. Nucleotídeos e ácidos nucléicos sofrem transformações não-enzimáticas
Purinas e pirimidinas, junto com os nucleotídeos dos quais fazem parte, sofrem algumas reações envolvendo a alteração espontânea da sua estrutura covalente. A velocidade destas reações é geralmente muito lenta, mas elas são fisiologicamente significantes, por causa da tolerância muito baixa da célula para alterações na informação genética. Alterações na estrutura do DNA que levam a alterações permanentes na informação genética codificada são chamadas de mutações e muita evidência sugere uma ligação íntima entre o acúmulo de mutações e os processos de envelhecimento e do câncer.
Várias bases sofrem perda espontânea dos seus grupos amino exocíclicos. Por exemplo, em condições encontradas numa célula típica, a desaminação da citosina (no DNA) em uracila ocorrerá em cerca de uma em cada 107 citosinas em 24h. Isto corresponde a cerca de 100 eventos espontâneos por dia, numa célula média de mamíferos. A desaminação da adenina e da guanina é cerca de 100 vezes mais lenta.
A reação da desaminação da citosina parece inócua, entretanto, é quase certamente a razão pela qual o DNA contém timina ao invés de uracila. O produto da desaminação da citosina (a uracila) é facilmente reconhecido como DNA estranho e é removido por um sistema de reparo. Se o DNA normalmente contivesse uracila o reconhecimento das uracilas resultantes da desaminação da citosina seria mais difícil e as uracilas não-reparadas levariam às alterações permanentes de seqüência, quando fossem pareadas com adeninas durante a replicação. A desaminação da citosina levaria gradualmente a um decréscimo nos pares de bases G(C e num aumento nos pares de bases A(U no DNA de todas as células. Ao longo dos milênios, a desaminação da citosina eliminaria os pares de bases G(C assim como código genético que dependesse deles. Estabelecer a timina como uma das quatro bases no DNA pode bem ter sido um dos pontos-chave na evolução, tornando possível o armazenamento em longo prazo da informação genética.
10. Nucleotídeos não poliméricos
10.1 O ATP e seus produtos de hidrólise são nucleotídeos
O grupo fosfato ligado covalentemente à OH do C-5’ de um ribonucleotídeo pode possuir um ou dois fosfatos adicionais ligados. As moléculas resultantes são referidas como nucleosídeos mono, di e trifosfatos, respectivamente. Os três fosfatos são geralmente nomeados como (, ( e (. A hidrólise dos nucleosídeo trifosfatos (ATP) fornece a energia química para direcionar uma grande variedade de reações bioquímicas. O nucleotídeo adenosina 5’-trifosfato(ATP) é de longe o mais largamente usado para este propósito, mas o UTP, o GTP e o CTP são também usados em algumas reações. Os nucleosídeos trifosfatos também funcionam como precursores ativados da síntese do DNA e do RNA.
A energia liberada pela hidrólise do ATP e outros nucleosídeos trifosfatos provem da estrutura do grupo trifosfato. A ligação entre a ribose e o fosfato ( é uma ligação éster. As ligações (,( e (,( são anidridos do ácido fosfórico (Figura 29). A hidrólise da ligação éster produz cerca de 14 kj/mol, sob condições padrões, enquanto a hidrólise de cada uma das ligações anidrídicas produz cerca de 30 kj/mol. A hidrólise do ATP freqüentemente desempenha um papel termodinâmico importante nas reações de biossíntese de biomoléculas. Quando acoplada a uma reação energeticamente desfavorável (endergônica), que apresenta uma variação de energia livre positiva, a hidrólise do ATP desloca o equilíbrio do processo global, dirigindo a reação no sentido da formação do produto.
Figura 29. Estrutura dos nucleotídeos trifosfatos (NTP), difosfatos (NDP) e monofosfato (NMP)
10.2 Nucleotídeos com função coenzimática: Acetil coenzima A, Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo (NAD) e Flavina Adenina Dinucleotídeo (FAD).
Uma grande variedade de cofatores enzimáticos que exercem um amplo espectro de funções químicas inclui a adenosina como parte da sua estrutura (Figura 30). Eles são estruturalmente não relacionados exceto pela presença da adenosina. Nesses cofatores a porção adenosina não participa diretamente da função primária, mas a sua remoção dessas estruturas resulta numa drástica redução de suas atividades biológicas. Por exemplo, a remoção do nucleotídeo da adenosina (3’-Fosfoadenosina difosfato) do acetoacetil-CoA, derivativo da coenzima A do acetoacetato, reduz sua reatividade como substrato para a (-cetoacil-CoA transferase (uma enzima do metabolismo dos lipídios) por um fator de 106. Embora a razão para este requerimento da adenosina não tenha sido examinada minuciosamente ele deve envolver a energia de ligação entre a enzima e o substrato (ou cofator) que é usado tanto na catálise quanto para estabilizar o complexo inicial enzima-substrato. No caso da (-cetoacil-CoA transferase a porção nucleotídeo da coenzima A parece ser uma “alavanca” que ajuda a puxar o substrato (acetoacetil-CoA) para dentro do sítio ativo. Papéis semelhantes podem ser encontrados para a porção nucleosídica de outros co-fatores nucleotídeos.
A adenosina certamente não é ímpar na quantidade de energia de ligação potencial que possa oferecer. A importância da adenosina provavelmente está não tanto em alguma característica química especial, mas sim na vantagem existente em tornar um composto para papéis múltiplos. Desde que o ATP se tornou a fonte universal da energia química, os sistemas evoluíram para sintetizar ATP em maior abundância do que outros nucleotídeos; pelo fato de ele ser abundante, tornou-se a escolha lógica para ser incorporado numa variedade de estruturas. A economia se estende para a estrutura protéica. Um domínio protéico que liga adenosina pode ser usado numa grande variedade de estruturas. Tal estrutura, chamada de a dobra de ligação dos nucleotídeos, é encontrada em muitas enzimas que ligam o ATP e co-fatores nucleotídicos.
Figura 30. Estruturas da Acetil coenzima A, Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo e Flavina Adenina Dinucleotídeo.
10.3 Nucleotídeos reguladores
As células respondem ao seu ambiente retirando informação de hormônios e outros sinais químicos no meio circundante. A interação destes sinais químicos extracelulares (primeiro mensageiro) com receptores na superfície celular freqüentemente leva à produção de segundos mensageiros dentro da célula que, por sua vez, leva às alterações adaptativas no interior celular. Freqüentemente, o segundo mensageiro é um nucleotídeo (Figura 32). Um dos segundo mensageiro mais comuns é a adenosina 3’, 5’-monofosfato cíclico (AMP cíclico, ou cAMP), formado a partir do ATP numa reação catalisada pela adenilato ciclase, uma enzima associada com a face interna da membrana plasmática. O AMP cíclico desempenha funções regulatórias quase em toda célula animal. O nucleotídeo Guanosina 3’, 5’-monofosfato cíclico (cGMP) ocorre em muitas células e possui também funções regulatórias.
Figura 31. Estruturas dos nucleotídeos cíclicos: Guanosina monofosfato 3’5’cíclico e Guanosina 3’difosfato 5’difosfato.
Conclusão
Os nucleotídeos são moléculas orgânicas formadas por uma base nitrogenada, um açúcar pentose e uma ligação fosfato. Desempenham diversas funções biológicas como a do armazenamento e a transmissão da informação genética, participam em reações de transferência de energia. Os nucleotídeos de DNA são denominados desoxirribonucleotideos por serem formados por 2’-Desoxirribose (a pentose) e os do RNA são denominados ribonucleotídeos por conter ribose (pentose). As bases de purina do DNA e RNA são adenina e guanina e a pirimidina comum é a citosina. Enquanto o DNA apresenta a pirimidina timina o RNA apresenta uracila. Os nucleotídeos são unidos por uma ligação covalente denominada fosfodiester formando os polímeros de DNA e RNA. A estrutura primária dos ácidos nucléicos (DNA e RNA) é a sua seqüência de nucleotídeos. A estrutura secundária do DNA é a dupla hélice, proposta por James Watson e Francis Crick em 1953. Há vários tipos de RNA como o RNA de transferência (tRNA), RNA mensageiro (mRNA) e RNA ribossômico (rRNA) Esses RNA apresentam estrutura bem complexas que a estrutura do DNA. Além dos nucleotídeos poliméricos podem ser encontrados na células nucleotídeos que não formam polímero como ATP (participando em reações de transferência de energia), AMP cíclico e GMP cíclico (nucleotídeos com função reguladora).
Resumo 
Os nucleotídeos desempenham diversas funções biológicas. São as unidades do DNA e RNA, participando no armazenamento e na transmissão da informação genética. Atuam nas reações de transferência de energia química nas células, são componentes estruturais de cofatores enzimáticos e atuam como segundos mensageiros. Os nucleotídeos são unidades formadas por uma base nitrogenada (purina ou pirimidina), uma pentose e uma ligação fosfato. Os nucleosídeos diferem dos nucleotídeos por não apresentar a ligação fosfato. Os ácidos nucléicos são polímeros de nucleotídeos, unidos por ligações fosfodiésteres entre a OH do C-5’ de uma pentose e a OH do C-3’ da ribose do nucleotídeo seguinte. O esqueleto covalente do DNA e RNA é hidrofílico, sendo formado por fosfato e pentose. Os nucleotídeos de RNA contêm ribose e as bases de pirimidinas uracila e citosina. Os desoxinucleotídeos do DNA contêm a 2’-desoxirribose e as bases de pirimidinas timina e citosina. Tanto no RNA quanto no DNA as purinas são adenina e guanina. A estrutura primária dos ácidos nucléicos é a sua seqüência de nucleotídeos. Em 1953 James Watson e Francis Crick apresentaram um modelo estrutural para o DNA, denominando-o dupla hélice. A dupla hélice é a estrutura secundária do DNA. Ela consiste em duas cadeias antiparalelas enroladas no sentido da mão direita. Pareamentos de bases complementares A(T e G(C são formados por pontes de hidrogênio dentro da hélice e os esqueletos hidrofílicos açúcar-fosfato são localizados na superfície da dupla hélice. Os pares de bases são empilhados no interior da hélice. Cada volta completa da dupla hélice apresenta cerca de 10,5 pares de bases. O DNA sofre desnaturação reversível sob aquecimento ou quando exposto a extremos de pH. Pelo fato de os pares de bases G(C serem mais estáveis que os pares A(T, o ponto de fusão dos DNA ricos em pares de G(C é maior que o dos DNA ricos em pares A(T. O RNA mensageiro é o veículo pelo qual a informação genética é transferida do DNA aos ribossomos para a síntese de proteínas. O RNA de transferência e o RNA ribossômico são também envolvidos na síntese protéica. O RNA pode ser estruturalmente complexo, com fitas de RNA simples freqüentemente dobradas em grampos, regiões de fitas duplasdenominadas hastes e regiões em que não ocorrem pareamentos de bases. O ATP é a moeda energética das reações do metabolismo celular. O AMP cíclico, formado a partir do ATP em uma reação catalisada pela adenilato ciclase, é um mensageiro secundário comum, produzido em resposta a hormônios e outros sinais químicos.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
1. LEHNINGER, A, NELSON, D.L, COX, M. M. Princípios de Bioquímica. 3a edição, São Paulo, Sarvier, 2003.
2. LEHNINGER, A, NELSON, D.L, COX, M. M. Princípios de Bioquímica. 2a edição, São Paulo, Sarvier, 1995.
3. BERG, J. M, TYMOCZKO, J. L., STRYER, L. Bioquímica. 5a edição, Rio de Janeiro, Guanabara-Koogan, 1992.
4. STRYER, L. Bioquímica. 4a edição, Rio de Janeiro, Guanabara-Koogan, 1996.
5. DEVLIN, T. M. Manual de Bioquímica com Correlações Clínicas. Editora Edgard Blücher LTDA, 1998.
Exercícios
1. Desenhe as estruturas das seguintes nucleotídeos
a) adenilato b) deoxiguanilato c)deoxicitidilato 
d) uridilato 	 e) deoxitimidilato f) hipoxantina 
2. Nucleotídeos são compostos que contêm uma ______________, uma __________ e um _____________________. As purinas encontradas no DNA são _______________ e ____________________.  No DNA o par de bases _____________:_____________ é mantido unido por três pontes de H, enquanto que o par _____________:_____________ forma apenas duas pontes de H.  Em uma solução aquosa de DNA, as purinas e pirimidinas empilham-se devido ao seu caráter ___________..Quando uma solução contendo DNA é aquecida, o empilhamento de bases é rompido e a absorbância ótica da solução a 260nm  aumenta; este fenômeno é denominado ______________________
3. O que são formas lactâmicas e lactímicas das bases nitrogenadas?
4. Indique se as alternativas abaixo são verdadeiras (V) ou falsas (F): 
a) ___ as formas A e B do DNA são hélices dextrógiras (sentido horário) enquanto que a forma Z é sinistrógira (sentido anti-horário) e encontrada apenas em DNA de fita simples.
b)___ seqüências palindrômicas podem formar estruturas cruciformes
c)___ a desoxirribose liga-se ao C-1 da base nitrogenada das pirimidinas
d)___ uma pirimidina em uma das fitas do DNA sempre pareia com uma purina na fita complementar
e)___ pares GC formam três ligações glicosídicas
f)___ todas as pentoses dos ácidos nucléicos são desprovidas de -OH na posição C-2
g)___ as ligações fosfodiéster que unem nucleotídeos adjacentes ligam a extremidade 3´-OH de um nucleotídeo à extremidade 5´-OH do próximo nucleotídeo
h) ___ No DNA as duas fitas são alinhadas em paralelo
i)___ as ligações fosfodiéster entre nucleotídeos adjacentes apresentam-se sem carga em condições fisiológicas (pH 7,0)
j)___ o DNA na forma B predomina em soluções aquosas; a desidratação favorece a foma A
l)___ o DNA na forma A é encurtado e apresenta diâmetro maior que o DNA B 
5) Por quê a forma A apresenta um maior diâmetro dos que as formas B e Z do DNA?
6) Ácidos nucléicos foram isolados de três organismos distintos.  Esses ácidos nucléicos têm as seguintes proporções relativas de bases: 
	 
	A
	T
	U
	G
	C
	Amostra 1
	29
	19
	0
	22
	30
	Amostra 2
	24
	0
	16
	24
	36
	Amostra 3
	17
	17
	0
	33
	33
Quais amostras são DNA? 
Que amostra deverá apresentar o maior valor para o ponto de fusão (Tm) ?
7. Por que o DNA contém Timina e não Uracila? 
8. Por que o DNA é uma molécula mais estável do que o RNA?
9. Por que o RNA não apresenta estrutura secundárias regulares como o DNA?