Segunda parte de Biologia Molecular

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Segunda parte de Biologia Molecular
Epigenetica e controle da expressão genica
Genotipo e a constituição genética do organismo
Fenótipo e o conjunto de características observáveis – pode ser resultado do genótipo, fatores ambientais ( como uma cidade altamente poluída) e da interação entre eles – pode tornar o animal eficiente ou não 
Exemplo: artrogripose multiplex – leva a ma formação do animal, tendo seu fenótipo exclusivamente genético F=G
Gêmeos univitelinicos : podem apresentar fenótipo diferente mesmo tendo o mesmo genótipo, devido a fatores ambientais F=A
Organismos multicelulares : como células se diferenciam com base em seu microambiente, no entanto,tem o mesmo genótipo – regulação da expressão vai ser modulada F=A+GxA
Epigenetica
Quando o ambiente altera o fenótipo do animal . E as vezes seu genótipo 
Ex: nascer em ambiente, no qual existe falta de alimento, faz com que esse animal nasca menor que os demais – crescimento retardado devido a alimentação da mae 
Alguns efeitos podem ser passados para mais de uma geração – fenótipo transgeracional epigenetico
Ex: uma mae em fase gestacional que fuma afetara seu filho presente na barriga e também a células germinativas desse bebe que assim afetara a terceira geração
Comportamento materno x efeito na prole
Femeas que tem meljor comportamento materno fazem com que seus bebes na vida adulta sejam mais calmos, isso acontece devido a metilacao de alguns genes, expressando receptor glicocorticoide - ocorre essa expressão devido a descondensacão de determinadas partes da cromatina 
Ex: plantas de régioes temperadas – vernalizacao – so ocorre a floração após a exposição ao frio – existe um gene que inibe a floração, após o frio esse gene e inibido e assim ocorre a floração 
Gene imprinted: deveria expressar alelos do pai e da mae, no entanto, as vezes so o alelo determinado da mae e expresso, e o receptor do pai não , assim a mae a passa a expressar o receptor ( que deveria ser feito pelo pai ) Tambem , tendo ambas as funções expressar e ser um receptor para esse.
Definicao da Epigenetica
E o estudo das mudanças herdáveis na expressão genica sem alteração na estrutura do DNA. Podem ser estáveis toda a vida e ate transgeracionais – sem ser uma mutação 
Epigenoma: conjunto de marcas epigeneticas globais de uma celila - Essas marcas são feitas por enzimas que podem marcar e ler essas, e também apagar do código epigenetico 
Mecanismos epigeneticos que regulam a expressão do gene
Metilacao do DNA (ilhas de CPG): Pre-transcricao, regulação antes da formação do mRNA 
Metilacao do DNA nas ilhas CPG – silenciar as regiões promotoras dos genes – ligação d eum metil nessas ilhas colocados por enzimas 
Enzimas : Dna N-Metil Transferase 
DNMTs `` de novo `` - novas metilacoes ao longo da vida da célula 
DNMTs ``manutenção `` - mantem o perfil após a replicação do DNA – fitas metade metilados – fitas novas replicadas tem que ser iguais a fita mae ( o perfil) assim a enzima DNMT de manutenção coloca metil nessas fitas replicadas também ficando igual o DNA mae
De – Metil : retira metil caso seja necessário 
Modificacao das histonas : responsável pela condensação. Alteracoes das caudas das histonas apresenta amnoacidos que podem sofrer alterações pos – traducionais ira aumentar ou diminuir o nível de condensação 
- metilado a cromatina fica mais condensada – genes não expresso 
- acetilado a cromatina fica mais separada, menos condensada – assim o gene e expresso 
Metilacao e acetilacao dao reações competitivas
Quem controla ? fatores regulatórios da expressão genica ativam ou reprimem : histonas acetil- transferase, complexos proteicos de acetilase, histonas metil- transferase, histonas de metilase
Complexos de remodelamento de cromativa – varias proteínas juntas que deslizaram pelo DNA
Degradacao do mRNA por RNAs não codificadores : controle da expressão genica pos- traducional
Conhecida como : interferência por RNA ou silenciamento por RNA
Vantagem: produção de terapias
- Micro RNAs: importa para a regulação da expressão do genica . São oriundos de genes endógenos, transcritos pelo RNA pol 2, muito pequenos
Formação : tem Cap e Poli-A e sofre autopareamento, sodre a acao da RNAse 2, no citoplasma sofre influencia do RNAse 3 que fara cortes, depois dera reconhecido e acopla a esse o complexo RISC – corta, e degrada esse mRNA para que não forme proteína ( devido não ter mais proteção nas pontas)
Dependendo o quanto pareis degrada RNA rapidamente ou atrasa a tradução 
-Si RNA – importante para respostas ao vírus , geralmente exógenos, originários do RNA dupla fita
Variabilidade genética do ponto de vista molecular
Genotipo : constituição genética do individuo 
Fenótipo : características observáveis de um organismo ou população 
Melhoramento genético – baseado no fenótipo do animal e sua herdabilidade que pode variar com o ambiente 
- fenótipos podem variar conforme as pessoas e sua população
Variabilidade genética 
E a tendência de genótipo individuais numa população variar entre os indivíduos – feito através do sequenciamento 
Medida pela frequência alelica ou genotípica 
Ex: humanos – existe uma variação genotípica de 0,1 a 0,4% de variação de bases do DNA entre dois humanos distintos isso mais as variações ambientais que podem alterar os indivíduos
Causas da variabilidade – mutações em células germinativas , recombinação homologa durante a meiose ( reprodução sexual), epigenetica ( por algumas gerações – como uma mae fumante)
Células somáticas com variação como mutação so e importante para o individuo não passara para seus descendentes. Em células germinativas em animais e importante analise do DNA, pedigree, paternidade e sexagem
Doencas podem ser causadas por alterações genéticas – muitas são multiespecies 
Condições genéticas: ex o fenótipo de dupla musculatura do boi, devido a mutação do gene de miostatina – gene que perde a função causando o aumento da musculatura 
- função da miostatina : controla ativação das células tronco no musculo e regula a homeostase – não deixa proliferar tanto esse tipo de célula, se ela perde sua função não existe controle sobre essas células tronco 
Mutação recessiva passada para os descendentes 
-Biodiversidade = analise genética para fazer acasalamentos
Maior variação de alelo, conservação de espécies, maior variabilidade 
-selecao de DNA – melhoramento genético, seleção dos alelos favoráveis 
-marcadores moleculares
Uma variação no DNA pode existir entre os animais e e associado a expressão de uma característica, seja quantitativa ( ex: mais de um gene e responsável pela característica como produção de leite) ou qualitativa (ex: mutações altera o fenótipo )
Marcadores torna possível marcar uma característica 
Polimorfismo de nucleotídeo único = mais de uma forma de nucleotídeo, uma pessoa pode ter um e o outro pessoa um nucleotídeo diferente = 1 base
Variações estruturais 
Variações no numero de copias de genes (SNPs) = são sempre herdados ( todas as células ), quando a variação de frequência e >1%, constitui 90 % da fonte de variação 
A cada 100 a 300 bases uma variação. Deveria ser, mas não são aleatórios no genoma, mais frequentes em regiões não codificantes – assim menor pressão de seleção 
Exemplo :variação do gene calpaina 3 ( um único gene) deixa a carne do boi mais mascia – tem que combinar com uma dieta adequada e manejo 
Variação estrutural :variação do numero de copias, pedaços maiores de cromossomos, sua duplicação ao longo do tempo ou sua deleção que serão selecionados como o tempo .
Ex: CNVs associados com fenótipo de crescimento de bos Indicus. Outras variações : deleção, inserção, translocação, inversão, duplicação.
Variacao de sequencias repetitivas : régios do genoma que tem uma sequencia repetitiva ( ATATAT...) 
- microsatelites ( <6bp) - minissatélite ( >6bp)
Usa essa técnica para distinguir indidviduos, mas não estão relacionados a variabilidade
Classificacao das variantes alélicas do ponto de vista molecular 
Funcionais: são causais e podem alterar proteínas formadas( na estrutura ou quantidade) e podem também afetar a expressão do gene - Obs: causais – faz mudanças fenotípicas
Geralmente nas regiões codificantes e regulatórios 
Não funcionais : não são causais, assim não alteram as proteínas e a expressão genica, geralmente nas régios não codificantes. 
Ponto de vista nos efeitos nos genes
Funcionais : perde a função do gene, ganho de função e deminante negativo
Não funcionais: sem função 
Efeitos na proteína 
Funcionais : altera a frequência proteica, sem sentido ( quando se coloca um códon de para antes) e troca de sentido ( altera as bases mudando o sentido)
Não funcionais : sem função 
Marcacao que passam de geração para geração sem alterar a sequncia de DNA – Epigenetica
Marcadores moleculares e genotipagem
Variação do DNA – alelos diferentes que variam de um para o outro 
Alelos são sempre herdados – esse tem quantidade variada para cada gene
O que faz eles serem diferentes e o que eles causam 
Marcadores diretos : e a aquele funcional, portanto, causal aquela alteração leva ao fenótipo 
Marcadores indiretos : aquele não causais, mas marcam a característica, por desequilíbrio de ligação ( associado a variação responsável pela característica – linkage)
Ligação = ao longo das meioses causal e não causal então próximas que não sofrem crossing over mantendo esses marcadores ligados, sendo o não causal um marcador indireto ligado a um marcador direto que condiciona a característica – importante para a seleção 
Sendo sempre esse pedaço de DNA passado por gerações 
Desequilibrio de ligação – e a associação não aleatória de alelos em loci diferentes em determinada população – selecionados ao longo da evolução 
Cria bloco haplotipicos = pedaços de DNA mantidos ao longo das gerações . São pedaços importantes qur não podem ser perdido e não podem ser quebrados ou variados . Tendo sempre um marcador indireto ligado a um variante causal, que através desses poderam ser selecionados para que não ocorra crossing over 
Quando uma mutação vai para frente e algo não aleatório 
Marcadores são usados para descobrir características, no entanto, características poligênicas se usa vários marcadores ao mesmo tempo – tipo o ganho de peso 
Ex: calpaina – maciez – essa e ativada pela cálcio quando se rompe no reticulo sarcoplasmático, essa calpaina ira degradar as fibras musculares
Marcadores são usados para = diagnostico de doenças, genealogia ( pedrigree), detecção de portadores de alelos responsáveis por doenças genéticas, e teste de paternidade de animais , seleção assistida ( decisão sobre acasalamento, semem de touro, avaliar doadoras de embrião ), seleção de características de difícil mensuração ( eficiência alimentar, maciez), manejo assistido por marcadores (decisões de otimizacao de decisão de manejo), marketing assistifo ( decisões de compra e venda de animais)
Para analisar marcadores moleculares tem técnicas de biologia molecular = genotipagem de SNPs e CNVs
Genotipagem = identificar marcadores, pedaços de DNA que distingue os animais. Determina o genótipo, mostrando que alelos se tem , qual herda de cada pai, uso da sequencia de DNA, para características biológicas
Métodos baseado em enzimas – PCR e suas variações 
Tecnica de biologia molecular aplicada MV
Servem para o diagnóstico e prognostico (saber se o animal irá melhorar ou piorar em relação a uma doença). 
Diagnóstico: determinar por examinação e natureza e circunstância de uma condição patologica. E tomar uma decisão a partir da examinação --> determinação cientifica ou nalise da causa ou natureza do problema. 
Prognóstico: previsão do curso clínico da doença para determinado paciente, podendo ser uma previsão boa, ruim ou reservado (duvidoso, não se tem certeza do que vai ocorrer) 
Usado hoje para o diagnóstico de microorganismos 
Pode ser usado tecnicas convencionais, no entanto, são mais lentas e de baixo custo beneficio 
Aplicacoes das tecnicas de biologia molecular na medicina veterinaria 
* Presença ou ausência de microorganismos 
* Respostas do organismos frente à doença 
* Sucetibilidade à doença 
* Oncologia/ cancerologia 
Testes comerciais --> métodos científicos que possibilitam a caracterização da presença ou forma de macromoleculas – avaliar casos de câncer, modificações de proteínas 
Elas irão avaliar = DNA > presença ou ausência de DNA (- ou +) ou usar tecnicas de variantes de sequência de DNA. RNA > presença ou ausência, quantidade da expressão gênica . Proteinas > presença ou ausência 
DNA 
1. Reações enzimáticas ( PCR e variações) 
2. Hibridização ( cheps de DNA) 
3. Sequencialmente ? - raramente usado para diagnóstico metódo científico que permite amplificar (replicar) milhões de copias de um fragmento de DNA escolhido 
A pessoa escolhe os primers para assim copiar o fragmento que deseja 
Metodo de detecção do DNA, sequenciamento... 
Exemplo de onde é aplicado : clonagem 
* Primer dá especificidade a reação, portanto, é importante saber qual o pedaço de DNA vai que vai ser amplificado 
PCR= repeticao de passos especificos (ciclos com temperaturas diferentes parta realizar replicações) - reação em cadeia - replicação de forma exponencial. Conformação do DNA é diferente em temperaturas diferentes 
Fez uso de uma polimerase que não denaturam a altas temperaturas – através da polimerase de bactérias resistentes a meios com altas temperaturas sem ter problemas 
O que precisa? 1- Extrair DNA genômico ou mitocondrias 2- primers (desenhar e mandar sintetizar) 3- Nucleotideos livres 4- DNA polimerase 5- Magnesio 6- Tampão 7- Água 
Passos: 1- Denaturação do DNA ( abertura da dupla fita a altas temperaturas) 2- Anelamento dos primers ( pareamento dos oligos na sequência especifica ) 55 C – 65 C – temperatura no qual ele se pareia 3- Extensão da fita pela DNA pol, em torno de 68 C – 72C melhor temperatura para essa enzima, esse se liga aos primers e polimeriza a nova fita. 
Apenas a fita de DNA específica vai amplificar em exponencial, aquela fita replicada, mas que não era a específica aumenta de forma linear – devido a replicação senso e anti-senso 
Usado para extração de DNA, quantificar o DNA, realizar a PCR (amplificação) e visualização do resultado (em eletroforese em gel de agarose) - separação de fragmentos de DNA – sendo esse eletronegativo. Se fizer no teste a mesma banda que o controle positivo, significa que esse testado também é positivo para a doença 
Variações de PCR 
VNTR, PCR- RFLP, PCR em tempo real, Multiplex (vários produtos ao mesmo tempo ) 
* PCR VNTR = faz estudo dos microssatélites (variações repetitivas). Faz primers que flanqueiam as regiões. Mais pesado essas regiões de DNA mais próximos do Negativo irá ser 
* PCR-RFLP = polimorfismo de comprimentos de fragmentos de restrição, o produto é digerido posteriormente com enzima de restrição - Enzimas reconhece o polimorfismo - separa por letras de nucleotideos – mutação Pontual 
* PCR em temnpo real, detecção em tempo real do produto formado durante a região. Coloca-se fragmentos de DNA que pareiam e irá fluorecer o produto. Analise ao longo dos ciclos, apresentação em Graficos. Resultado quantitativo – com aplicacao na genotipagem de SNPs
*genotipagem por chips de DNA – Hibridizacao para achar determinado fragmento – pode ser usado para varias características ao mesmo tempo. Tem uso no âmbito comercial. Esses chips apresentam bolinhas de sílica que apresenta bases de nucleotídeos que irão parear com o DNA ate o marcador, a esse ira se ligar uma base que ira imitir uma cor dependendo dos pares lidos – assim genotipando o animal
Vantagens e diferenças 
Baseado em hibridização e amplificação : o DNA extraído e fragmentado em pedaços pequenos. O DNA denaturado em fita simples que hibridiza na lamina. Amplificacao da base de SNP com fluoroforo. E o software analisa qual e o SNP para cada posição 
Tecnincas para proteínas ( reação antígeno anticorpo) 
Elisa ( mais disponível): ensaio de imunoadsorcao enzimática – adsorçãoe captura algo e mantem ela próxima, moléculas ou ions são retidos na superfície de sólidos por meio de interações químicas e físicas. Objetivo : detecção de anticorpos de patógenos ou antígenos . Em geral feito por meio de soro ou plasma do animal. Existe três tipos diferentes de Elisa= direto, indireto ou sanduiche.
Elisa sanduiche : uma cama de mesmos anticorpos que capturam ( adsorção) antígenos específicos – proteínas de interesse. Após isso coloca-se outro anticorpo ANTI que ira se ligar a proteína que apresenta enzimas – alterando a cor ao reagir com o substrato ( essa pode avaliar quanto da molécula apresenta ). Incubacao com amostra, incubação do anticorpo conjugado com a enzima, enzima reage com o crmogeno mudando de cor.
Elisa direto: analise de forma quilitativa e quantitativa. Ele identifica o antígeno por meio da ligação de anticorpos que irão se ligar o proteína especifica. Incubacao do anticorpo com a enzima após ligar-se ao antígeno 
Elisa indireto : adsorção de antígeno.É feita a incubação do anticorpo primeiro, incubação como anticorpo, enzima reage com o cromógeno. Respota ao patógeno , analise quantitativa e qualitativo
sensibilidade não especifico, capta varias proteínas – falso positivo
inespecificidade : especifico
Imunohistoquimica 
Objetivo de determinar presença e localização de proteínas especificas em tecido coletado e fixado – em amostras teciduais 
Reacao antígeno X anticorpo 
Lamina histológica ‘ branca’. 2 vai ser colocado o anticorpo primário que vai reconhecer a proteína alvo ( apenas elas). 3 Anticorpo secundário ( Anti- Ac primário) vai ser colocado para reconhecer apenas o anticorpo primário, esse estará conjugado com a enzima 4. Enzima catalisa a reação química com o substrato. 5. O substrato muda de cor onde tem proteína. 
- E usado para prognostico para descobrir cancers e tumores, por meio de marcadores mastocitoma – maior ou menor expressão 
Imunofluorescencia 
Semelhante ao IHQ pode usar corte de tecido 
Diferencas : anticorpo 1 conjugado com substancia fluorescente ou no anticorpo 2 conjugado 
Western blot
Objetivo de detecção semi-quantitativa de proteína 
Amostras variadas: tecido, sangue, urina...
Tres etapas : estracao de proteínas de amostras, pega as proteínas e faz separação em gel por peso molecular ( eletroforese), devera colocar outra membrana ( plástica) próxima ao gel, fazendo uma corrente elétrica, portanto, transferência de proteínas. E no plástico coloca-se os anticorpos específicos para essa proteína . Coloca-se depois um anticorpo secundário com enzimas que reagem como cromógeno
Pode ver o nível de expressão das proteínas 
Ex: HIV- teste confirmatório : de cara usa-se o teste de elisa, caso de positivo usa-se wertern blot mais especifico 
Usado na veterinária – doença da vaca louca ( teste confirmatório), tenia soliun em porcos. Servem para auxiliar o diagnostico.
Organismos geneticamente modificados
Conab: maior produtora de grãos – sendo a maior parte para animais 
Obs: feed: alimentação animal 
Grãos : milho, soja – quase 100% são geneticamente modificados. Beneficios : obtem maior produção numa áreas plantada menor, beneficia os pequenos produtores, reduz a emissão do gas carbônico > + sustentável, são mais resistentes
Transgenia : e biotecnologia, que sera o fragmento de DNA de uma espécie e colocar em outra – normalmente um gene 
No brasil existe regras e leis = normas de segurança
OGM: definição 
Um organismo cujo o material genético ( DNA ou RNA) e modificado por técnicas de engenharia genética ( produzir ou manipular sequencias de DNA/ RNA – recombinante)
DNA/ RNA recombinante: moléculas manipuladas fora da célula mediante a modificações dos segmentos de DNA/ RNA natural ou sintético, que tem capacidade de se replicar dentro da célula do organismo. OGM – transgênicos – Brasil
Exemplos: plantas – milho, soja, algodão, feijão, eucalipto e cana de açúcar. Coloca-se nessas plantas resistência a insetos ( diminui o agrotóxico), e tolerância a herbicidas.
Soja e milho ‘ piramidado’ : mais de uma característica no mesmo vegetal, assim BT( resistência a insetos) + RR ( tolerância a herbicidas)
Feijao GM: feijão resistente ao vírus do mosaico dourado , tecnologia de dcRNA ( RNA i) – modificações pos transcricionais – no entanto tem baixa produtividade em relação ao normal – escolha ruim do feijão 
Eucalipto – característica : cresce mais rápido, mais madeira ( +papel) – aumento da biomassa, produzir mais.
Cana GM : resistência a pragas, aumento de biomassa, tolerância ao estresse hídrico, maior teor de açúcar – cada característica uma planta diferente
Etapas para a produção de um trangenero: descoberta, desenvolvimento e regulamentos
Bactérias e leveduras GM: produção de biofarmacos, vacinas, enzimas...
Ex: insulina recombinante, GH – somatotropina – aumento da produtividade
- Uso de biorreatores: microorganismos, animais ou plantas geneticamente modificados para a produção de proteínas heterologas de interesse farmacêutico. Ex : etanol de segunda geração 
Animais GM : EX : Aedes GM – introduziu um gene letal, apenas faz a liberação de machos, os filhotes do cruzamento desses com femea normais vao nascer filhotes com o gene, assim não irão sobreviver
Bicho da seda : produção de roupa florecente 
Vaca resistente a mastite: adição do gene listotafina 
Edição genômica: menor custo, modificações genética – a edição de um gene, modificando, que induz a mutação – editar o genoma de forma pontual
Biotecnologia agrega produtividade e sustentabilidade ao setor 
Biosseguranca 
Funcao : avalia se não houve disseminação de genes heterologos, não pode contaminar espécies selvagens, não pode interferir na cadeia alimentar, não pode deixar resíduos ambientais, condição de fazes alimentos e remédios seguros.
Analise de pontos críticos de cada meio usado – cuidados . Ex: microorganismos não podem ser disseminados no ambiente, tem que ter certeza que não esta liberando esporos 
Protocolo- necessidade de apresentar área de refugio – área no entorno da plantação – para evitar a pressão de seleção resistentes – áreas com plantas convencionais quais não são resistentes as pragas – manutenção de animais não resistentes
Area de co-existencia : manter distancia de outras culturas que não geneticamente modificadas, além de ter que apresentar bordas 
• Manutenção dos animais: • Ambientes isolados de não OGM ́s • Local identificado e responsável • Genotipagem e acasalamentos controlados . Manipulação: • Incineração de materiais que contenham DNA• Riscos de biossegurança variável
Biologia de DNA recombinante e edição genômica
DNA recombinante: É um DNA criado artificialmente, podendo conter sequências de uma, duas ou mais espécies distintas
Tecnologia do DNA recombinante: Inserção de DNA exógeno relevante em um vetor de DNA de outra espécie que possua sequência de DNA replicadora, como um plasmídeo de bactéria, e que depois de inoculado em um organismo hospedeiro, faça com que o DNA exógeno seja replicado juntamente ao do Hospedeiro.
DNA de todas as espécies tem a mesma estrutura so varia a sequencia 
E usado essa recombinação para a clonagem de DNA, com objetivo de estudo da sequencia, e para a produção das OGMs – transgênicos, pode vir a expressar algo especifico
Clonagem de DNA
Clonar grandes fragmentos de DNA, estudo e caracterização de amostras pequenas/ raras: parasita, microoganismos... – Determinacao filogenética da espécie. E a transgenia : plantas, animais, insetos..
Tecnologia do DNA recombinante 
Pega- se um plasmídeo, acha a região promotora e antes dela faz um corte com uma tesoura molecular, que são enzimas de restrição, nesse local se insere um fragmento de DNA no plasmídeo e depois colocar na bactéria 
Isolar o fragmento de DNA 2. Escolher qual o modelo de clonagem utilizado o vetor . 3. Iserir genes nos vetores. 4 Inserir vetor nas células 5. Transformacao ( inserir e replicar o vetor ) – ao colocar em outro organismo 6. Expressao da proteínas 7. Purificação da proteína 
Escolher qualo modelo de clonagem: Dependendo da proteína tem que se usar modelos eucariontes devido muitas vezes a necessidade de mudanças pos traducionais . Ex: bactérias, fungos, leveduras, algas, células humanas imortalizadas ( feitas em laboratório, expressando a telomerase)
Vetor – plasmídeos bacterianos, vírus modificado ( bacteriófago, etc..) cromossomos artificiais de bactérias 
Plasmideo = DNA circular extracromossomal de bactérias, regiões importantes – ORI ( região promotora), gene de resistência (AMP, N e O), MCS ( onde e cortado e colocado o fragmento de interesse ) – sitio de multiclonagem, promotor de expressão 
Inserir Genes nos vetores : tesoura molecular – enzimas de restrição ( DNAses) reconhece sítios de restrição e corta a dupla fita, formação de pontas coesivas ( para ser possível a ligação )
Corta mesma sequencia no vetor e no fragmento de DNA
Ligação dos fragmentos entre as pontas coesivas por meio da enzima ligase
8- Expressao da proteína: verificar no cultivo a presença da proteína , técnicas que usam detecção imunoenzimatica, elina western blot
Edicao genética
Tipo de engenharia genética no qual DNA é inserido, deletado ou trocado usando "nucleases engenheiradas" ou "tesouras moleculares”.
Princípio geral: 1. Nucleases criam quebras de fita dupla específicas no genoma
2. As quebras são reparadas por reparo de DNA: recombinação não homóloga ou homóloga – pode levar a deleção ou inserção – pequena ou de todos os genes
 Resultam em mutação, inserção de fragmento, etc
Crispr –CAS 9 – tesoura
Crispr e a sequencia que indica onde o Cas 9 ( enzima da bactéria) corta o DNA
Crispr direciona onde devera ser cortafo e quem faz o corte da dupla fita e por meio da Cas 9. Esse e uma sequencia homologa da região que deve ser cortado
Pode corrigir alelos doentes, pode modificar alelos para efeitos fenótipos 
 A edição genômica pode modificar o genoma sem deixar marcas para a identificação