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BIOTECNOLOGIA Profa. Ms. Geísa Paes EXTRAÇÃO DE DNA, PCR E ELETROFORESE Profa. Ms. Geísa Paes 1. Extração de DNA 2. Polymerase Chain Reaction (PCR) 3. Eletroforese EXTRAÇÃO DE DNA - Exposição do ácido nucléico por rompimento da membrana e da parede celular. 1) Coleta da amostra 2) Extração - mecânica; enzimática e química. 3) Purificação - fenol clorofórmio, coluna e beads. 4) Controle de qualidade - quantidade, pureza e integridade. EXTRAÇÃO DE DNA 1) Coleta de amostras - Tipo de PCR? - Armazenamento (resfriar, congelar ou nitrogênio liquido) EXTRAÇÃO DE DNA 2) Extração: Exposição do ácido nucléico através do rompimento da membrana e parede celular Mecânica membranas celulares são rompidas por forca mecânica Enzimática Enzimas são adicionadas para digerir proteínas e estruturas celulares Química Utiliza-se detergente para romper os lipídeos da membrana celular junto com sais caotrópicos EXTRAÇÃO DE DNA 3) Purificação: Após extração o ácido nucléico é separado de tudo que não interessa (componentes celulares, proteínas, reagentes), concentrado e armazenado em água ou tampão. Fenol/clorofórmio Coluna Beads EXTRAÇÃO DE DNA Fenol/clorofórmio ✓ Purificação – fenol/clorofórmio EXTRAÇÃO DE DNA ✓Purificação - coluna Coluna EXTRAÇÃO DE DNA ✓ Purificação - beads magnéticas Beads EXTRAÇÃO DE DNA 4) Controle de qualidade - 3 pontos Qual foi o rendimento do processo de extração e purificação (fluorometria) Quão eficiente foi o processo de purificação (espectrometria) Quão integro está o seu DNA/RNA EXTRAÇÃO DE DNA ✓ Quantificação – Fluorometria - Agente fluorescente – emite fluorescência baixa e quando junta a molécula de DNA/RNA emite fluorescência alta. O nível de fluorescência é quantificado. - Especifico para cada ácido nucleico – DNA dupla fita, molécula de RNA, proteína. Vantagens: rápido e fácil; equipamento barato; discrimina DNA/RNA; pode quantificar a integridade do RNA. Desvantagens: utiliza reagentes – custo; não mensura pureza; técnica menos utilizada. EXTRAÇÃO DE DNA ✓ Pureza (espectrometria) - Um feixe de luz é emitido através da amostra . A quantidade de luz absorvida é quantificada. EXTRAÇÃO DE DNA ✓ Pureza (espectrometria) - Um feixe de luz é emitido através da amostra . A quantidade de luz absorvida é quantificada. A luz tem diferentes comprimentos de onda! EXTRAÇÃO DE DNA - DNA / RNA = 260 nm; Proteína = 280 nm; Contaminantes (fenol, sais, EDTA, carboidratos) = 230 nm ✓ Pureza (espectrometria) EXTRAÇÃO DE DNA ✓Métrica de pureza - Ácido nucleico em a relação a proteína: A260/280 nm ➢ DNA = 1,8 a 2,0 ➢ RNA = 1,9 a 2,1 - Ácido nucleico em relação a outros contaminantes (fenol, sais, EDTA, carboidratos, ureia): A 260/230 nm ➢ Entre 1,5 e 1,8 EXTRAÇÃO DE DNA ✓ Integridade - Amostra integra – vários fragmentos do mesmo tamanho - Amostra degradada – enzimas cortam a amostra fragmentos de diferentes tamanhos Como visualizar ? Qual técnica separa fragmentos? -Eletrofose - Eletrofose capilar (fluorescência) – Bioanalyzer da Agilent EXTRAÇÃO DE DNA 1. Extração de DNA 2. Polymerase Chain Reaction (PCR) 3. Eletroforese POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) PCR = Cópias in vitro usando elementos básicos do processo de replicação de DNA POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) DNA molde POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Etapa 1 - Desnaturação POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Etapa 2 - Anelamento Primers: pequenos fragmentos de DNA sintéticos complementares a minha sequencia alvo. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Etapa 3 – Extensão POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Etapa 3 – Extensão POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Etapa 3 – Extensão POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) ✓ O fragmento de DNA sintetizado em um dado ciclo, serve como molde para formação de novos fragmentos no ciclo seguinte. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) ELETROFORESE ✓ Utilizada para visualização dos produtos de amplificação da PCR Profa. Ms. Geisa Paes _ geisapaes@gmail.com UM FORTE ABRAÇO E ATÉ A PRÓXIMA AULA!!!