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BIOTECNOLOGIA Profa. Ms. Geísa Paes TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE Profa. Ms. Geísa Paes 1. Clonagem 2. Enzimas de restrição 3. Vetores de clonagem 4. Transformação celular TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE Tecnologia do DNA recombinante Conjunto de técnicas que permitem a manipulação de moléculas de DNA específicas (ou parte dela – gene), considerando as propriedades do DNA. TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE O que é um DNA recombinante? DNA recombinante é uma molécula de DNA que recebeu um fragmento (ou gene) de outro organismo. A técnica central da tecnologia do DNA recombinante é a clonagem molecular que permite pegar um “pedaço” do DNA e combiná-lo com outro, produzindo muitas cópias de diferentes combinações genéticas. CLONAGEM A clonagem molecular é um método que permite fazer várias cópias idênticas (clones) de um “pedaço” específico de DNA. O DNA de interesse chamado de inserto é ligado a uma outra molécula de DNA chamada de vetor para formar o que chamamos de DNA recombinante. CLONAGEM Plasmídeo: são moléculas de DNA circular presentes em bactérias, que se replicam separadamente do cromossomo bacteriano e são utilizados como vetores de clonagem. CLONAGEM Primeiro temos que cortar e abrir o plasmídeo que será utilizado como o nosso vetor para "inserir" o gene de interesse. Esse processo baseia-se em enzimas de restrição que cortam o DNA e na DNA ligase que “une” o DNA. Posteriormente devemos inserir o plasmídeo na bactéria e utilizar a seleção por antibiótico para identificar as bactérias que “pegaram” o plasmídeo. Finalmente cultivar lotes de bactérias portadoras de plasmídeo e usá-las como "fábricas" para fazer a proteína e colher a proteína das bactérias e purificá-la. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO O que é uma enzima de restrição? Uma enzima de restrição ou endonuclease de restrição é um tipo de nuclease que cliva fita dupla de DNA sempre que identificar uma sequência particular de nucleotídeos que seja o sítio de restrição da enzima. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Função natural: proteger o DNA bacteriano do DNA exógeno. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Reconhecem sequencias polindrômicas de DNA: Tem um eixo de simetria e a sequência de bases de uma fita é a mesma da fita complementar, quando lida na direção oposta. Tipos de corte: VETORES DE CLONAGEM Após o isolamento de uma informação genética, por exemplo, um fragmento de DNA obtido pela clivagem com enzimas de restrição, este fragmento deverá ser inserido numa outra molécula de DNA diferente, capaz de amplificar aquela informação genética em centenas de cópias. Este processo de amplificação é obtido através do uso de moléculas de DNA que são os chamados vetores de clonagem molecular. VETORES DE CLONAGEM Características essenciais: Origem de replicação Sítio múltiplo de clonagem Marca seletiva VETORES DE CLONAGEM VETORES DE CLONAGEM Plasmídeos: DNA circular; fita dupla; ocorrem naturalmente em bactérias e leveduras; clonagem de fragmentos de até 9Kb. Bacteriofágos: vírus que infectam bactérias; clonagem de fragmentos de 9 Kb a 15 Kb Cosmídeos: híbridos entre plasmídeos e bacteriofágos; clonagem de fragmentos de até 35 Kb. TRANSFORMAÇÃO CELULAR O processo de transformação consiste na introdução do DNA recombinante em células hospedeiras, como por exemplo, bactérias, podendo então ser replicado. As células hospedeiras copiam o DNA do vetor juntamente com o próprio DNA, criando múltiplas cópias do DNA inserido. TRANSFORMAÇÃO CELULAR Choque térmico: preparação das células para torná-las competentes, por tratamento com cloreto de cálcio que atuam neutralizando as cargas negativas da membrana e do DNA criando poros na membrana para que o DNA alcance o interior da célula. TRANSFORMAÇÃO CELULAR Eletroporação: As células são submetidas à alta voltagem (choque elétrico) que provoca uma desestabilização da membrana externa e a formação de poros, possibilitando a entrada do DNA para o interior da célula. Profa. Ms. Geisa Paes _ geisapaes@gmail.com UM FORTE ABRAÇO E ATÉ A PRÓXIMA AULA!!!