aulas de Hemoglobinopatias

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Hemoglobinopatias
Hemoglobina
Cada eritrócito contém
cerca de 600 milhões de
moléculas de Hb
Crom. 16p13.3
p
q
2 1  1 2 1  HS48 40 33 10 
Cluster 
LCR
Crom. 11p15.5
p
q 5'
 G A   
LCR
Cluster 
HS5 4 3 2 1 
Embrionário
22 - Hb Gower I
22 - Hb Gower II
22 - Hb Portland I
22 - Hb Portland II 
Fetal
22 - Hb F
22 - Hb A
Adulto
22 - Hb A
2 2 - Hb A2
22 - Hb F
Clusteres dos genes de globina
5'
3'
3'
β
δ
α
α
α γ
α2γ
2
Hb Fetal = 0 - 2%
α2δ
2
α2β2 Hb A = 96 - 98%
Hb A2 = 2,0 - 3,5%
Perfil
Adulto
γ
β
α
α
α δ
α2γ2 Hb Fetal = 70 - 90%
α2β2 Hb A = 6,5 - 28%
Perfil RN
α2δ2 Hb A2 = 2,0 - 3,5%
Hemoglobinas normais
Hemoglobinopatias
• São doenças hereditárias causadas por mutações nos genes das globinas ou em seus
elementos regulatórios levando a alterações na síntese ou na estrutura das cadeias
polipeptídicas.
• Alterações estruturais hemoglobinas anômalas
• Alterações no rítmo de síntese talassemias
• Persistência Hereditária de Hb Fetal (PHHF)
Variantes Estruturais
• Existem 1327 variantes, sendo a maioria com substituição de aminoácidos na cadeia beta
(http://globin.cse.psu.edu/) (23/09/2018);
• No Brasil as variantes mais comuns são as Hb S e Hb C;
• Mutação na globina   Hb S - 2 2
S
6 GAG  GTG Glu--6Val0
• Mutação na globina   Hb C - 2 2
C
6 GAG  AAG Glu--6Lis++
Traço Falciforme:
• Não tem anemia
• Não tem alterações físicas
Traço ou anemia falciforme?
↓ Biodisponibilidade NO
Inflamação crônica
Estresse oxidativo
Adesão ao endotélio de células brancas e vermelhas
Formação de agregados de célula-célula
Vaso-constrição
Redução do fluxo sanguíneo 
Aprisionamento de hemácias 
Propagação das placas de fibrina
Obstrução
Vaso-oclusão
Fisiopatologia das Doenças Falciformes
Anemia Falciforme
• Anemia hemolítica crônica
• Crises dolorosas
• Sequestro esplênico
• Síndrome Torácica Aguda
• AVC
• Úlceras de perna
Normal Tal. AlfaTal. Beta
   
• Classificadas de acordo com tipo de cadeia cuja produção
está afetada;
• Maior frequência: talassemia α e talassemia β.
Talassemias - classificação
Talassemias
Desequilíbrio na síntese de uma ou mais cadeias globínicas
Produção deficiente 
de 
hemoglobina
Excesso da(s) cadeia(s) com síntese 
preservada 
Hemácias hipocrômicas
e microcíticas
Danos aos eritrócitos/precursores 
Hemólise
Talassemia α - Classificação 
Cadeias α Cadeias βCadeias α Cadeias βCadeias α Cadeias β
+: síntese reduzida de globinas alfa 
0: ausência de síntese de globinas alfa 
Crom. 16p13.3
p
q
2 1  1 2 1  HS48 40 33 10 
Cluster 
LCR
5' 3'
• Hb: hemácias hipocrômicas e microcíticas
•Feto/RN: Hb Bart’s  elevada afinidade pelo O2
•Adulto: Hb H (instável) precipitação  hemólise
Talassemia α – Fisiopatologia 
No feto: Hb Bart’s (γ4) No adulto: Hb H (β4)
Genótipos x Fenótipos 
HETEROZIGOTO +
0-3% de Hb Bart’s ao nascimento;
alterações hematológicas mínimas ou
ausentes no adulto.
-MRE 2 1
-MRE 2 1
/+
HOMOZIGOTO +
HETEROZIGOTO 0
5-10% de Hb Bart’s ao nascimento;
discretas microcitose e hipocromia no
adulto; sem anemia.
-MRE 2 1
-MRE 2 1
+/+
-MRE 2 1
-MRE 2 1
/0
-MRE 2 1
-MRE 2 1
NORMAL
DOENÇA DA Hb H
Anemia moderada a grave;
Hipocromia e microcitose;
Reticulocitose;
25-50 % de Hb Bart’s ao nascimento;
5-30 % de Hb H na vida adulta.
-MRE
-MRE
2 1
2 1
 
 
 
 
 
 
 
  
 
0/ +
-MRE 2 1
2 1
 
 
 
 
 
 
 
  
 
SÍNDROME DE HIDROPISIA 
FETAL POR Hb BART’S
Anemia grave;
Cerca de 80% de Hb Bart’s ao
nascimento: hipóxia tecidual.
0/ 0-MRE
Genótipos x Fenótipos 
Talassemia  - Fisiopatologia
22
22
22
22
Normal
 ~ 
Agregados
Lesão na membrana dos 
eritroblastos e eritrócitos
Destruição dos eritroblastos na MO
ERITROPOESE INEFICAZ
Produção deficiente de globinas 
 hipocromia, microcitose
Hemólise
+
Eritropoese ineficaz
Sobrecarga de 
Ferro
22
22



Talassemia 
 < 
Anemia

Genótipos x Diagnóstico laboratorial



 


Anemia moderada microcítica-hipocrômica (++)
Reticulocitose
Hb A diminuida
Hb Fetal aumentada (40-70%)
Transfusão (?)
+/+ ou +/0 (Tal.  intermediária)







Tendência à poliglobulia
Hipocromia e microcitose
Sem anemia (traço) ou com anemia (menor) (+)
Hb A2 aumentada
Hb Fetal (0-5%)
/+ ou /0 (Traço  / Tal.  menor) 
+/0 ou 0/0 (Tal.  maior)
Dependência transfusional
Anemia grave microcítica-hipocrômica (+++)
Reticulocitose
Hb A muito diminuída ou ausente
Hb Fetal ~ 98%






Testes Diagnósticos
• Hemograma
• HLPC - Cromatografia líquida de alta eficiência
• Eletroforese de Hb
• Teste de Solubilidade
• Pesquisa Hb H/Teste de Estabilidade Térmica
• PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
• Sequenciamento
• MLPA – Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification
HPLC - normal
HPLC
Eletroforese em pH alcalino
• Separação de substâncias carregadas eletricamente, considerando
sua diferença de migração em uma corrente elétrica.
TEB - pH 8,9 (alcalino) 
Teste de Solubilidade
O2  formação de agregados de Hb que são insolúveis no tampão
Pesquisa de Corpos de Heinz/Corpos de 
Inclusão
Corpos de Heinz -
violeta de metila 0,5% 
em BM à 37°C
Corpos de Inclusão -
azul brilhante de cresil 
incubado em BM à 37°C
Componentes Necessários da PCR
MgCl2
DNA: molde para a reação
dNTPs: nucleotídeos livres
Co-fatores enzimáticos
Taq DNA polimerase: extensão
Tampão
Primers (iniciadores): início da polimerização. 
Determinam os limites do fragmento que será 
amplificado
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
Esquema da PCR
1º ciclo
2º ciclo
22 = 4 cópias
4º ciclo
23 = 8 cópias23 = 8 cópias
24 = 16 cópias24 
= 32 cópias25 
DNA alvoDNA alvoDNA alvo
3º ciclo
35 ciclos
60 bilhões de cópias
Desnaturação
95ºC
Anelamento
~ 55ºC
Extensão
72ºC
Reação
Eletroforese
Banda de interesse
Multiplex PCR – Talassemia α
M. Ladder 250 pb
1. Controle normal (αα / αα) 
2. Genótipo - α3.7 / αα
3. Genótipo - α3.7 / - - MED
4. Genótipo - -SEA/ αHphI α
5. Genótipo - α3.7 / -(α)20.5
M 1 2 3 4 5 M
Multiplex PCR
Sequenciamento de DNA
Processo que determina a ordem de nucleotídeos em uma amostra de DNA.
Sequenciamento de DNA
Mutante IVS I -6 (TC)
Fita Sense – IVS I -6 (TC)Fita Sense - Normal
Sequenciamento - Resultado