ELISA: Teste Imunoenzimático

Prévia do material em texto

ELISA: Enzyme Linked Immuno-Sorbet Assay-
Teste imunológico que utiliza uma enzima como MARCADOR para determinar a 
presença de proteínas (que podem ser ANTÍGENOS ou ANTICORPOS)
○
É um ensaio imunoenzimático-
Fluidos corporais○
Sobrenadante de cultura celular○
Pode mostrar a presença do antígeno ou anticorpo em:-
Pode ser qualitativo ou quantitativo-
Baseado na interação antígeno-anticorpo detectável por meio de reação enzimática-
Especificidade Ag-Ac○
Sensibilidade de reações enzimáticas○
Une as propriedades de:-
É uma enzima ligada COVALENTEMENTE a um anticorpo (este que se liga ao 
antígeno(
○
A enzima reage com o substrato, oxidando um cromógeno que muda de cor de 
acordo com a concentração do antígeno pesquisado
○
Enzima Conjugada-
Antígenos○
Anticorpos○
Controles○
Padrões○
Amostras○
Placa de poliestireno○
Lavagem▪
Bloqueio▪
Diluente▪
Tampões:○
Anticorpo conjugado à enzima○
Cromógeno ou substrato para a enzima○
Ácido para interromper a reação enzimática○
Espectrofotômetro○
Elementos necessários para o teste:-
A maioria das biomoléculas (proteínas) são absorvidas por absorção passiva, que 
consiste em interações hidrofóbicas entre a superfície e a molécula
○
A superfície de poliestireno pode ser modificada○
O tipo de técnica de ELISA empregada é o que determinará se anticorpos ou 
antígenos serão absorvidos pela superfície
○
Placa de Poliestireno-
Isso evita ligações proteicas não específicas, já que essa proteína irrelevante 
preenche os "espaços vazios" na placa de ELISA
▪
Utilizar uma proteína que seja irrelevante ao ensaio (por exemplo Albumina 
Bovina ou leite em pó desnatado)
○
Bloqueio no ELISA-
ELISA
quarta-feira, 28 de novembro de 2018 22:57
 Página 1 de Imunologia 
TIPOS DE ELISA
Antígeno de interesse ligado a placa○
Anticorpo de detecção específico ao Antígeno de interesse é adicionado○
É utilizado para detecção de antígeno em uma amostra teste○
ELISA DIRETO-
Anticorpo primário ligado à placa○
Detecta o antígeno presente na amostra
ELISA SANDUÍCHE-
 Página 2 de Imunologia 
Detecta o antígeno presente na amostra○
Anticorpo de detecção específico ao Antígeno de interesse○
Antígeno purificado ligado à placa▪
Detecta o anticorpo da amostra que liga-se ao antígeno▪
Anticorpo de detecção liga-se ao outro anticorpo▪
Indireto para detectar anticorpos○
Amostra contendo antígenos é adicionada à placa▪
Proteínas presentas na amostra se ligam a placa▪
Anticorpo primário específico ao antígeno de interesse é adicionado▪
Anticorpo secundário (ou de detecção), específico para o anticorpo 
primário e marcado com a enzima, se liga ao anticorpo primário
▪
Indireto para detectar um antígeno da amostra○
ELISA INDIRETO-
 Página 3 de Imunologia 
PROCEDIMENTO ELISA INDIRETO
As microplacas são sensibilizadas com antígeno correspondente ao anticorpo alvo-
Depois são lavadas para retirar o excesso de antígeno não ligado-
Adicionando e incubando uma solução proteica irrelevante ao ensaio, que irá 
ocupar os espaços vazios do poço (que não estão ocupados pelo reagente de 
sensibilização, ou seja, que não estão ocupados pelo antígeno)
○
Depois há o bloquei de sítios inespecíficos-
Se isso acontecer, um complexo antígeno-anticorpo será formado○
Caso o anticorpo esteja presente na amostra teste, ele vai se ligar ao antígeno-
Este segundo anticorpo é reativo CONTRA imunoglobulinas da espécie em que ele 
busca detectar os anticorpos (um anticorpo que reconhece outro anticorpo)
○
Este segundo anticorpo adicionado está ligado a enzima = é um anticorpo 
conjugado (Anticorpo secundário + Enzima)
○
Para detectar esse complexo Ag-Ac formado, há a adição de um segundo anticorpo-
Há a reação, e a enzima catalisa sua transformação dando cor a reação○
Com emissão de luz no comprimento de onda adequado para cada 
cromógeno
▪
A concentração do anticorpo presente na amostra testada pode ser 
determinada por comparação da coloração do produto da reação de uma 
curva-padrão conhecida
▪
A atividade enzimática (intensidade da cor) é proporcional a concentração de 
antígeno ou anticorpo ligado e medido por espectrofotômetro
○
Em seguida, é adicionado o substrato correspondente à enzima (que está 
covalentemente ligada ao segundo anticorpo) e cromógeno
-
 Página 4 de Imunologia 
GERAL
As microplacas são sensibilizadas com anticorpo específico, lavadas e bloqueadas-
Depois, é adicionada a amostra teste (antígeno de interesse)-
Depois o conjugado é adicionado-
Adiciona a solução reveladora (enzima + cromógeno)-
Por fim a solução ácida (solução stop)-
Os resultados podem ser analisados qualitativamente (comparando as colorações 
obtidas com os controles positivo e negativo) ou quantitativamente (através da leitura 
da absorbância em espectrofotômetro e usando uma curva padrão)
-
 Página 5 de Imunologia