Citometria de Fluxo, Imunocromatografia e Western blot

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Introdução
Citometria de Fluxo, Western Blot e Imunocromatografia são todas técnicas que exploram, em
seu cerne, a interação antígeno-anticorpo para identificar a presença de determinados antígenos em
soluções, células ou tecidos.
Todavia, anticorpos por si só são invisíveis e a detecção de fato dos antígenos ocorre, então, por
meio do uso de anticorpos marcados que possuem modificações em sua porção Fc que os tornam
visíveis/detectáveis.
Essas marcações podem ser tão simples quanto nanopartículas de ouro que quando
acumuladas ficam visíveis, como também mais complexas com o uso de moléculas fluorescentes
(fluoróforos ou fluorocromos) cuja fluorescência pode ser detectada e mensurada, ou até com o uso de
enzimas (Peroxidases ou Fosfatases Alcalinas) que após a adição de um substrato incolor, o convertem
em um produto colorido nas regiões que estão presentes, “pintando” a posição do antígeno.
Assim, esse princípio é utilizado para marcar e tornar visíveis o(s) antígeno(s) de desejo. Esses
antígenos podem ser: Proteínas virais em amostras de sangue indicando infecção, B-hCG na urina
indicando gravidez; Proteínas de superficie como CD4, CD8 quantificando e "tipando” (se é uma
TCD4, ou TCD8, nesse caso) as células; Marcadores tumorais em uma biópsia indicando a origem de
uma metástase; Anticorpos no sangue indicando imunização ou infecção prévia contra/de determinado
patógeno, dentre inúmeras outras possibilidades e marcações.
Com isso, os imunoensaios são extremamente amplos, cada um deles tendo suas vantagens e
desvantagens as quais favorecem ou desfavorecem seu uso em determinados contextos.
Citometria de Fluxo
Como o nome sugere, é um ensaio para contagem (metria) e determinação de uma
população heterogênea de células (Cito), mas, como?
As proteínas são as moléculas que exercem trabalho dentro da célula, as funções de uma
célula estão, portanto, intrinsecamente relacionadas às proteínas que elas expressam de modo que há
tipos celulares que possuem proteínas exclusivas delas, como as células T possuem o complexo de
transdução de sinal CD3, as células B podem ser marcadas por CD19, CD20 e, ainda mais, as TCD4+
e TCD8+, como o nome sugere, possuem CD8 e CD4 em suas membranas plasmáticas que
caracterizam sua função e, também, determinam seu grupo.
(!!Essa técnica não é restrita a proteínas, outras moléculas tanto de membrana quanto
intracitoplasmáticas, podem ser marcadas!!)
Dado isso, se você tivesse uma amostra com linfócitos e quisesse saber quais e quanto de cada
tipo estão na sua amostra, seria extremamente conveniente se você pudesse marcar cada uma dessas
moléculas, não?
E é justo isso que a Citometria de Fluxo faz,
as células são marcadas com anticorpos
acoplados a fluoróforos (moléculas
fluorescentes), são postas em uma suspensão
(não aderidas a nenhuma superfície) e passam
por um fino cilindro uma a uma e interagem com
um laser. (observe o esquema ao lado)
A interação com o laser, leva o fluorórofo a
emitir luz colorida, afinal, é fluorescência, e essa
luz é captada por sensores que detectam a cor.
Numa amostra com múltiplas marcações,
idealmente haverão fluoróforos que emitem cores
cujos comprimentos de onda não se sobrepõem,
por exemplo:
CD4 - Azul, CD8 - Vermelho
Com isso, os sensores conseguem indicar
cada cor que, por vir do fluoróforo acoplado ao
anticorpo, indica a presença do antígeno ao qual
aquele anticorpo se liga. Como o Fluoróforo do
Anti-CD8 é vermelho, a captação da luz vermelha vai sinalizar a presença de uma célula TCD8.
(O Citômetro de Fluxo também pode medir granulosidade e tamanho celular.)
Assim, o computador conta quantas células passaram e de qual tipo são.
INTERPRETAÇÃO
Os resultados podem ser apresentados tanto em um
histograma, identificando apenas uma variável, como
também em um gráfico com quatro quadrantes associando
duas variáveis.
Esse gráfico (a esquerda) é típico da citometria de fluxo e
cada ponto representa uma célula. A sensibilidade é
tamanha que a discreta autofluorescência de organelas
celulares pode ser detectada e, por isso, há essas linhas que
se juntam nos quadrantes, acima delas a célula apresenta
fluorescência expressiva indicando que veio do fluorórofo, abaixo é ruído como a anteriormente
mencionada autofluorescência das organelas.
Com isso, a interpretação do gráfico segue o seguinte padrão: No Quadrante a esquerda
embaixo (Q3) há células que não apresentam nenhum anticorpo marcado para CD4 nem CD8, portanto
carecem de ambas as moléculas e são CD4-/CD8-. No quadrante à esquerda acima (Q1) elas
apresentam fluorescência vinda do fluoroforo do anticorpo de CD4, mas não para CD8, logo são
CD4+/CD8-. A mesma lógica se aplica para Q4 onde são CD4-/CD8+ e Q2 onde são duplo positivas,
CD4+/CD8+.
Aplicações
Contagem e tipagem de células é algo com inúmeras aplicações a exemplo de acompanhar o
percentual de células TCD4 em indivíduos infectados com HIV. Todavia, a citometria de fluxo é
extremamente ampla e com muitas mais aplicações na pesquisa e diagnóstico, mas sempre seguindo
essa ideia de buscar e contar tipos celulares em uma amostra.
Imunocromatografia
Também conhecida como Teste de Fluxo Lateral, é, acima de tudo, uma cromatografia e
consiste na interação de uma fase móvel com uma fase estacionária, sendo a estacionária anticorpos
específicos para o antígeno que está sendo
procurado.
Assim, como no exemplo do teste de
gravidez, a fase móvel é a urina da pessoa
que está se suspeitando a gravidez e a
estacionária são anticorpos anti-B-hCG (que
se apresenta na urina de pessoas grávidas).
Quando a fase móvel (urina) passa pela fase
estacionária (linha de anticorpos), caso haja
B-hCG, ele ficará preso na linha teste.
O Antígeno se torna visível a olho nu, pois,
antes de chegar na linha teste, é marcado
com um anticorpo marcado com,
geralmente, Nanopartículas de Ouro que
se desloca junto da fase móvel, fixando-se
somente quando o antígeno se encontra
com a linha teste, formando uma espécie de
“Sanduíche” Anticorpo de marcação-
Antígeno -Anticorpo de Captura.
Há, também, uma segunda linha que é o controle e possui anticorpos específicos para os
anticorpos de marcação que sempre se apresentam em excesso e sempre se deslocarão para o
outro lado da fita independente da fase móvel ter ou não ter o antígeno, por isso servindo de controle.
É chamado também de Teste de Fluxo Lateral, pois utiliza os princípios de capilaridade (a
solução se espalhando pela superfície por capilaridade), então pode ser feito na lateral…
É um teste barato e conveniente, tendo sido amplamente utilizado na pandemia, mas
também servindo como princípio para os famosos testes de gravidez da farmácia.
Além do preço, também não requer um especialista para sua execução, tornando muito mais
viável e prático a realização desse teste que, mesmo não sendo o padrão-ouro, sua conveniência o
tornou vital em tempos de extrema necessidade.
Também pode ser utilizado para detectar a presença de Anticorpos no sangue de pacientes,
seguindo o mesmo princípio com algumas poucas alterações.
Western Blot
Ensaio para detectar a quantidade e peso molecular de proteínas em uma solução. As
proteínas da solução são tratadas com uma solução especial que as ioniza de acordo com seu
tamanho. Em seguida, passam por uma eletroforese, separando-se em grupos de acordo com o
tamanho (justo pela carga ser proporcional ao tamanho).
Logo depois, são transferidas para uma membrana, onde são marcadas com anticorpos
marcados, tornando visível a concentração das proteínas nessa membrana. Quanto mais intensa for a
coloração escura da linha, maior a concentração
daquela proteína.
É utilizado para, dentre outras coisas, a detecção de
anticorpos contra as proteínas do HIV:
Usando a técnica descrita para aplicar as proteínas
do HIV na membrana, depois aplicando o antisoro
(soro c/ anticorpos) do paciente sobre a membrana
e, em seguida, anticorpos secundários marcados
para marcar os anticorpos primários do paciente
(caso presentes) que ficariam ligados às proteínas.