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* * Professor: Christian Reis Disciplina: Biologia Molecular EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS * * O que é extração/purificação? * * Quais são os requisitos essenciais para a obtenção dos ácidos nucléicos? quantidade (rendimento) – Que quantidade/concentração foi obtida de ácidos nucléicos na extração? pureza – os ácidos nucléicos foram obtidos com alto grau de pureza ou existem contaminantes na amostra? integridade – as moléculas de ácidos nucléicos estão integras ou houve degradação? * * Quais são as etapas na extração/obtenção de ácidos nucléicos? 1a Etapa: Ruptura ou lise celular 2a Etapa: Desnaturação ou inativação de proteínas 3a Etapa: Separação dos ácidos nucléicos * * 1a Etapa: Ruptura ou lise celular Liberar os componentes citoplasmáticos e/ou nucleares intracelulares. * * * * 2a Etapa: Desnaturação ou inativação de proteínas. Lisados celulares Mistura de macromoléculas, incluindo fragmentos de membrana lipídicas e proteínas intracelulares. * * 2. Desnaturando proteínas celulares: Lisados celulares contêm mistura complexa de macromoléculas: - DNA / RNA; proteínas, lipídeos, carboidratos. Fragmentos de membrana lipídica Proteínas intracelulares: enzimas nucleases degradativas – DNAses / RNAses interferem no rendimento dos ácidos nucléicos Soluções/reagentes desnaturantes proteínas: Tampão acetato de K pH 4.8, Proteinases, Fenol, Clorofórmio * * 3a Etapa: Separação dos ácidos nucléicos de macromoléculas contaminantes celulares (proteínas) Solubilização em solventes orgânicos, seguida de precipitação. * * Separação com fenol: Baseia-se na solubilidade diferencial das proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos, no solvente orgânico desproteinizante fenol. * * Extração de ácidos nucléicos com fenol DNA RNA Camada aquosa (RNA) Interface (proteínas) Camada de fenol (DNA) Fenol pH neutro/alc. Fenol pH ácido DNA precipitado RNA precipitado * * Precipitação com álcool Precipitação com álcool (Etanol ou Isopropanol) DNA: Ressuspender DNA em TE pH 8,0 – (10mMTris-HCl / 1mM EDTA), até completa dissolução - Armazenar -20º C DNA precipitado * * Melhora na recuperação dos ácidos nucléicos: Extração em baixas temperaturas (gelo) Incubação dos lisados com reagentes desnaturantes de proteínas Agentes que retardam atividade das nucleases * * Extração de ácidos nucléicos Agentes que retardam atividade das nucleases: tampões de extração com agentes quelantes Mg ++ (EDTA – ácido etileno diaminotetracético) necessários às atividades de nucleases. Solução de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico desnaturam nucleases e coagulam proteínas durante a extração Inibição de RNAses (proteinase K; DEPC – dietil pirocarbonato) * * Como fazer a quantificação do DNA? Princípio – Ác. nucléicos absorvem luz UV num padrão específico. Em um espectrofotômetro a amostra é exposta a luz no comprimento de onda de 260nm e um detector faz a medição da luz que atravessa a amostra. Quanto mais a luz é absorvida, maior será a concentração de ác. nucléico na amostra. * * Espectrofotometria * * Quantificação Leitura da absorbância a 260 e 280 nm OD260 = 1.0, dsDNA = 50 µg/mL; RNA = 40 µg/mL Desvantagem: interferência com material para extração, inabilidade de diferenciar entre DNA e RNA, sensibilidade: 50-250 ng DNA/ mL * * Quantificação do DNA Reagentes e Equipamento - Espectrofotômetro UV, cubetas de quartzo, ddH20 1 Zerar o aparelho com ddH20 2 Diluir um volume conhecido de ácido nucléico em água. 3 Realizar a leitura em OD260 e OD280. 4 Calcular a concentração. * * EXEMPLO Ex.: 3µl de DNA + 97µl H20; OD260 =0,1 * * Espectrofotômetro Ac.nucléicos moderno -Nanodrop * * Espectrofotômetro Ac.nucléicos moderno -Nanodrop 104,5ng/l = 0,104g/ l * * PUREZA Ácidos nucléicos podem estar contaminados com outras moléculas (ex. proteínas, compostos orgânicos etc). A razão entre a absorbância de 260 e 280nm (A260/280) é usada para acessar a pureza dos ácidos nucléicos. DNA: Razão A260/A280 ~ 1,8 – puro < 1,8 contaminação proteínas RNA: Razão A260/A280 ~ 2,0 – puro < 2,0 contaminação proteínas > 2,0 contaminação com fenol ou clorofórmio * * Determinação da concentração do DNA através de gel de agarose O DNA pode ser quantificado e analisado quanto à sua qualidade, por meio da análise em gel de agarose ( gel de agarose entre 0,8% e 1% ) Com as amostras de DNA, é aplicada também uma amostra cuja concentração e tamanhos é conhecidos. Após a eletroforese, o gel é corado com intercalante de DNA e visualizado em luz ultravioleta. As amostras são comparadas aos padrões, determinando-se dessa maneira as concentrações aproximadas de DNA em cada amostra. * * Determinação da concentração do DNA através de gel de agarose 1650pb – 40ng MM 0,1 0,3 0,5 0,1 0,3 0,5 DNA1 ul DNA2 ul DNA 1 – 55 ng/ul DNA 2 – 150 ng/ul Análise da imagem – comparação com amostra conhecida * * MATERIAIS EXTRAÇÃO - MICROTUBOS 2 ml 1,5 ml 200 l MATERIAIS EXTRAÇÃO MICROPIPETAS PONTEIRAS EPI – JALECOS/LUVAS LABORATÓRIO - SOLUCÕES Escherichia coli EXTRAÇÃO DNA * * * * * * * * * * *
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