Sequenciamento de DNA: Importância e Método

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TGTGAACACACGTGTGGATTGG... 
Professor: Christian Reis 
Disciplina: Biologia Molecular 
Sequenciamento de DNA 
Sequenciamento do DNA 
Definição 
Identificação da ordem exata dos pares de bases (A, T, G e C) em um 
segmento de DNA. 
Importância 
O conhecimento da seqüência de bases de um gene fornece 
importantes informações sobre sua estrutura, função e relação 
evolutiva com outros genes (de um mesmo organismo ou de 
organismos diferentes). 
Watson & Crick 
Nobel 1962 
Histórico – O sequenciamento de DNA no tempo 
Histórico – O sequenciamento de DNA no tempo 
Frederick Sanger 
Prêmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980 
J. Mol. Biol. v.94, p. 441-448, 1975 
Walter Gilbert 
Prêmio Nobel de medicina e fisiologia em 
1980 
PNAS, vol. 74 No. 2 p. 560-564, 1977 
Método de Sanger 
• Reação de sequenciamento 
– amplificação linear 
• Eletroforese em gel de acrilamida 
– em placa 
– capilar 
• Leitura da sequência 
– manual 
– automática 
Reação de sequenciamento 
• fragmento de DNA (fita simples) 
• 1 primer 
• DNA polimerase 
• dNTPs 
• ddNTPs 
 
 
OH 
 H 
SEQUENCIAMENTO DE DNA (Sanger) 
Raio-X 
pTZSL2
EcoR I
EcoR I*
C
T
T
A
A
C
G
T
T
A
T
T
T
C
A
T
G
T
C
T
T
T
T
T
T
G
A
C
T
A
T
G
A
A
T
A
T
A
T
G
C
A
A
T
C
A
A
C
T
T
A
A
G
pTZSL1
EcoR I
EcoR I*
C
T
T
A
A
G
T
T
G
A
T
T
G
C
G
A
T
A
T
A
T
T
C
A
T
A
G
T
C
A
A
A
A
A
A
G
A
C
A
T
G
A
A
A
T
A
A
C
G
T
T
A
A
G
Leitura da sequência de DNA 
• Manual 
G A T C 
Sequenciamento de DNA 
Projeto Genoma 
Humano 
Leitura da sequência de DNA automática 
em gel 
Fluorocromo único em 
tubos separados. 
Leitura das sequências - 
automática 
Leitura das sequências -
Automática 
Fluorocromos 
diferentes no mesmo 
tubo 
Como ocorre a reação de 
sequenciamento? 
 
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 
||||||| 
5’ 3’ 
ATGCTTC 
5’ 3’ 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
T 
T T T 
T T 
T 
T 
T 
T 
T 
G 
G 
G 
G 
G 
G 
G 
G 
G 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
 
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 
||||||||| 
5’ 3’ 
ATGCTTC 
5’ 3’ 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
T T T T 
T T 
T 
T 
T 
T 
T 
G 
G 
G 
G 
G 
G 
G 
G 
G 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
 
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 
|||||||||| 
3’ 
ATGCTTCTG 
5’ 3’ 
A 
A 
A 
A 
A A 
A 
A 
A 
A 
T 
T 
T 
T 
T T 
T 
T 
T 
T 
T 
G 
G 
G 
G 
G 
G 
G 
G 
G 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
 
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 
||||||||||||||||| 
5’ 3’ 
ATGCTTCTGGCAGATCT 
5’ 3’ 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
A A 
T T 
T 
T 
T 
T T 
T 
T 
T T G 
G 
G 
G G 
G 
G 
G G 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
 
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 
||||||||||||||| 
5’ 3’ 
ATGCTTCTGGCAGAT 
5’ 3’ 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
T 
T 
T 
T 
T 
T 
T T 
T 
T 
T 
G 
G 
G 
G 
G 
G 
G 
G 
G 
C 
C C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
 
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 
||||||||||||||| 
5’ 3’ 
ATGCTTCTGGCAGAT 
5’ 3’ 
A 
A 
A A A 
A 
A 
A 
A 
A 
T 
T 
T 
T 
T 
T 
T T 
T T 
T 
G 
G 
G 
G 
G G 
G 
G 
G 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
 
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 
||||||||||||||| 
5’ 3’ 
ATGCTTCTGGCAGAT 
5’ 3’ 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
A 
T 
T 
T 
T 
T 
T 
T 
T 
T 
T 
T 
G 
G 
G 
G 
G 
G 
G 
G 
G 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
C 
 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT 
5’ 3’ 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT 
ATGCTTCT 
ATGCTTCTGGCAGATCT 
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 
5’ 3’ 
ATGCTTCTGGCAGAT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT 
População de 
moléculas 
Incorporação 
aleatória do 
didesóxi 
Quantidade 
precisa entre 
didesóxi e 
desóxi 
ATGCTTCTGGCAGAT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT 
ATGCTTCT 
ATGCTTCTGGCAGATCT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT 
 
G A T C 
• molde 
• polimerase 
• dNTPs 
•ddGTPs •ddATPs •ddTTPs •ddCTPs 
 
ATGCTTCTGGCAGAT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT 
ATGCTTCT 
ATGCTTCTGGCAGATCT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT 
ATGCTTCTG 
ATGCTTCTGG 
ATGCTTCTGGCAG 
ATGCTTCTGGCAGATCTG 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTG 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG 
ATGCTTCTGGC 
ATGCTTCTGGCAGATC 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAAC 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC 
ATGCTTCTGGCA 
ATGCTTCTGGCAGA 
ATGCTTCTGGCAGATCTGA 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAA 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA 
G A T C 
 
ATGCTTCTGGCAGAT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT 
ATGCTTCT 
ATGCTTCTGGCAGATCT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT 
ATGCTTCTG 
ATGCTTCTGG 
ATGCTTCTGGCAG 
ATGCTTCTGGCAGATCTG 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTG 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG 
ATGCTTCTGGC 
ATGCTTCTGGCAGATC 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAAC 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC 
ATGCTTCTGGCA 
ATGCTTCTGGCAGA 
ATGCTTCTGGCAGATCTGA 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAA 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA 
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA 
AS MÁQUINAS NECESSÁRIAS 
PARA O SEQUENCIAMENTO 
• Primeira etapa: junta-se os 
reagentes em poços de 
placas e coloca-se na 
máquina de PCR para a reação 
de amplificação interrompida 
 
• Diferenças com relação ao PCR 
– Utilização de umsó primer 
– Utilização dos ddNTPs 
 
• Uma vez prontas, as sequências de diferentes tamanhos 
contendo os didesóxi amplificados devem ser enviadas 
ao sequenciador de DNA mais próximo 
O QUE FAZ UM SEQUENCIADOR 
DE DNA? 
• Segunda etapa: realiza a eletroforese em gel ou capilar 
– O sequenciador executa a eletroforese em géis capilares ultra-finos 
– Um sensor é responsável por emitir um laser e verificar qual o comprimento 
de onda emitido pelo didesóxi 
 
Obtenção dos dados da sequência 
background 
Região de qualidade alta 
• Picos bem definidos e grandes. 
• Linha de base boa. 
• Distância entre picos anterior e posterior constante. 
Analisando o cromatograma 
Região de qualidade média – poucas 
ambigüidades 
• Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho médio. 
• Linha de base boa a razoável. 
• Distância entre picos anterior e posterior razoável. 
Região de qualidade baixa – baixa confiabilidade 
• Picos mal definidos e de tamanho pequeno. 
• Linha de base confusa. 
• Distância entre picos anterior e posterior inconstante. 
SANGER Pirosequenciamento 
• Depende de clonagem em 
bactéria (2 semanas de 
trabalho) 
• Não há clonagem 
• Reads de ~700 bp • Reads de ~100 bp 
• Clones de fita dupla 
permitem seqüenciamento 
em ambas direções (facilita 
orientação e montagem) 
 
• Fragmentos fita simples não 
permitem seqüenciamento em 
ambas direções 
Sanger vs Pirosequenciamento 
• 25 milhões de bp em 4 horas 
(100x mais rápido) 
• 1 milhão de pb em 24 horas 
• 6 meses de sequenciamento, 
24 horas por dia, para 
sequenciar o genoma de um 
fungo 
• 24 horas para sequenciar o 
genoma de um fungo 
Conclusão : a união faz a força 
PNAS 103 (2006), 11240 
Genomas 
 
Genômica funcional 
 
Diagnóstico muito sensível de doenças infecciosas 
 
Diagnóstico preciso de doenças genéticas 
 
Manipulação terapêutica de genes 
 
Criação de organismos híbridos e transgênicos na medicina, agricultura e pecuária 
 
Estudos evolutivos e de descendência 
 
Medicina legal etc. 
 
SEQUENCIAMENTO - APLICAÇÕES 
Genoma Celular 
É o conjunto de todos os genes e do 
DNA intergênico de uma célula 
PROJETO GENOMA HUMANO - A CORRIDA 
DO SÉCULO 
Objetivos do PGH: 
-Identificar os 3 bilhões de pb e os genes no DNA humano; 
-Armazenar a informação em banco de dados público; 
-Aperfeiçoar a análise de dados; 
- Lidar com questões éticas, legais e sociais 
James Watson 
Em outubro de 1990, teve inicio o Projeto Genoma Humano (PGH) previsto 
para durar 15 anos com um investimento de $3.000.000.000 
PGH – Evolução Científica 
Em 26/06/2000, o anúncio do sequenciamento de 90% do Genoma Humano, 
na Casa Branca, EUA. 
Craig Vanter 
Celera Genomics 
Francis Collins 
NIH 
HGSC 
Em 2003, no ano do cinquentenário da descrição da estrutura da molécula do 
DNA, foi finalizado o genoma humano. 
Em outubro de 1990, teve inicio o Projeto Genoma Humano previsto para 
durar 15 anos com um investimento de $3.000.000.000 sob coordenação de 
James Watson 
Genoma Humano: 
• 3 bilhões de pb 
• ~ 26.000 genes 
• 1,2% éxons 
• 24% íntrons 
• 75% intergênico 
• Genomas diferentes populações – 12% 
variação – diferenças étnicas, resposta a 
medicamentos, susceptibilidade a doenças. 
Aspectos mais relevantes do genoma 
humano 
Organização do genoma humano 
Representação do mapeamento físico no cromossomo humano 
PROJETO GENOMA HUMANO 
Genoma é a informação...O que é feito dessa 
informação ainda não é totalmente conhecido. 
Transcriptoma, proteômica, interatoma….