Questões BIOLOGIA MOLECULAR

Prévia do material em texto

Módulo – 1 Introdução à Noções Básicas e Clínicas de Biologia Molecular Aplicadas – 2018-2
– Discutir sobre as 2 hipóteses relacionadas ao experimento de Griffith e a reavaliação deste experimento por Avery e colaboradores.
A experiência de Griffith sugere que as bactérias do tipo S conseguiam transmitir a sua virulência às bactérias do tipo R, não virulentas, que se tornariam patogênicas. esta informação deveria ser transmitida por uma substância química, que ficou conhecida como o princípio transformante. Griffith injetou diferentes cepas em camundongos. A cepa S matou todos os camundongos; a cepa R não, ele também notou que se a cepa S fosse inativada pelo calor e injetada nos camundongos, ela não causava pneumonia. Quando ele combinou a cepa S inativada pelo calor com cepas R vivas e injetou esta mistura nos camundongos, todos morreram de pneumonia.
Oswald Avery, em 1940, demonstrou que o fator de transferência era o DNA, adicionando uma enzima capaz de clivar o DNA no experimento de Griffith. Essa experiência mostrou, pela primeira vez que o DNA é responsável pela transformação de bactérias tipo S em bactérias tipo R vivas, dando-lhes a informação necessária para que produzam a cápsula e se tornem virulêntas.
Hipóteses apresentadas;
1. A cepa S inativada (calor) havia sido reanimada/recuperada?
2. A cepa R viável havia sido transformada em uma cepa S viável por algum “fator de transformação”?
A hipótese número 2 estava correta pois em 1952, Hershey e Chase, determinaram se a proteína ou o DNA eram o material da hereditariedade, uma vez que marcaram o DNA e a proteína com radioisótopos diferentes determinando qual estaria entrando na bactéria. Eles marcaram o DNA com o radioisótopo Fósforo 32 .Inversamente ao DNA , a proteína contém enxofre e não fósforo, podendo ser somente marcada com radioisótopo Enxofre 35. Hershey e Chase descobriram que o Enxofre permanecia fora da célula, enquanto que o Fósforo foi encontrado dentro da célula, indicando que o DNA era o carreador físico da hereditariedade.
Módulo – II Técnicas Básicas Aplicadas ao Diagnóstico e a Pesquisa: PCR (reação e cadeia da Polimerase). 
1) - Como você justificaria (tecnicamente) a implantação da PCR em Serviços de Hemoterapia (Bancos de Sangue), e para quais patógenos a PCR seria melhor indicada?
A PCR é uma técnica que amplifica sequências específicas de DNA através de ciclos repetidos de síntese de ácidos nucleicos. É comumente usada para a definição de diagnósticos sorológicos para agentes infecciosos virais, bacterianos e parasitas, assim como para monitoração de pacientes positivos para hepatites ou para HIV. 
Atualmente todos os serviços de análises clínicas e bancos de sangue são obrigados por lei a realizar dois exames de triagem sorológica (ELISA) para o HIV, contudo o status sorológico do paciente pode ser incompatível com os resultados dos testes tipo ELISA , devido possíveis Falso-Positivos (reações cruzadas) e Falso-Negativos (janela sorológica: período em que o sistema imune humoral ainda não produziu anticorpos anti-HIV). A PCR não depende do status sorológico do paciente, uma vez que não detecta anticorpos e sim o ácido nucléico viral. Pode-se detectar a presença de cDNA do HIV pela PCR após o contágio em apenas 12 dias, enquanto que para o aparecimento de níveis detectáveis de anticorpos é de 3 a 6 meses (em kits de última geração este período foi reduzido para 24 – 30 dias).
O NAT, ou Tecnologia de Amplificação de Ácidos apresenta a capacidade de amplificar sequências de ácidos nucleicos provenientes do genoma de um organismo ou vírus, sendo esta a principal vantagem do teste, já que amplifica o material genético do próprio vírus infectante. Desse modo, o NAT, em conjunto com os testes sorológicos, quando realizado nos serviços de hemoterapia, agrega segurança transfusional e qualidade, uma vez que as técnicas se complementam. A primeira é relevante para detectar precocemente os antígenos virais nos estágios após a infecção e, a segunda, para detecção de antígenos e anticorpos, minimizando o risco infeccioso das transfusões. 
Módulo –III Interpretação dos Resultados de Exames de Biologia Molecular (PCR)
1) – Caso você tenha dúvidas quanto a um resultado de PCR para HIV, e precise confirmar o resultado, como você procederia tecnicamente?
Caso haja a necessidade de confirmação dos resultados o procedimento deverá ser o seguinte: Resultado Positivo (+): Confirmar a positividade com a técnica de hibridização com sondas marcadas com material radioativo ou não-isotópico (probes - devem ser complementares e se hibridizar com os produtos amplificados). Recorta-se a banda do gel onde este será eluido para separar o produto amplificado. Após a eluição, a solução é submetida a um aquecimento próximo a 95C para que haja a desnaturação dos amplicons. Uma vez o DNA estando separado, os probes serão adicionados. Após a hibridização a solução é resfriada para que os amplicons voltem a se enovelar, se reconstituindo. As amostras serão submetidas novamente a uma eletroforese, e como as sondas estão marcadas, sua visualização poderá ser analisada da seguinte maneira: Para sondas marcadas com Fósforo 32: Expor o gel a uma chapa de raios-x em temperatura baixa, caso haja hibridização, haverá uma impressão na chapa de raios-X pela emissão de radioatividade no híbrido amplicon+sonda, sendo comparado com o controle positivo. Amostras negativas não apresentarão bandas. 
Para sondas marcadas com substâncias não isotópicas (biotina): Após a adição da sonda marcada com biotina, o gel será exposto a uma membrana de nitrocelulose embebida com um conjugado rico em estreptavidina, que possui elevada afinidade pela biotina, e também com a enzima fosfatase alcalina. A revelação será feita com uma substância reveladora cromogênica e observada em um aparelho colorimétrico. As amostras positivas apresentarão intensidade colorimétrica específica, já as amostras negativas não apresentarão visualização colorimétrica.