6 TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO

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TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO
Prof. Me. Francisco Mário Sidney Oliveira
HISTÓRICO
A medicina virológica teve início em 1898 (Loeffler e Frosch);
Mas em 1892 inclusões já haviam sido relatadas;
Os primeiros diagnósticos virológicos foram os sorológicos;
Badson e Band em 1929 – Teste de fixação do complemento;
HISTÓRICO
Weller e Enders em 1948 isolaram patógenos virais humanos e culturas de células;
Então a partir do século XX houve um aumento do conhecimento dos vírus causando doenças;
Esfregaço
Inclusões
Olho de Coruja
TÉCNICAS PARA DETECÇÃO DE AC/AG
Elisa
Aglutinação
 IF
FC
TÉCNICAS
Culturas de células;
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR);
Eletroforese em gel;
PCR Real Time;
Southern Blotting;
Reação de Hibridização;
Northern Blotting;
IMPORTÂNCIA DO DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO
Determinar a etiologia e acompanhar o curso de uma infecção viral;
Diferenciar viroses com sintomas semelhantes
Diagnosticar doenças congênitas
Determinar o prognóstico ou a conduta a ser tomada com o paciente;
 Avaliar a eficácia do tratamento antiviral
 Avaliar a resposta vacinal;
 Triagem de sangue em bancos de sangue;
Estudos de soroprevalência;
PONTOS CRÍTICOS 
FASE PRÉ-ANALÍTICA
Instruções para coleta:
1. Preparação do paciente;
2. Material a ser coletado;
3. Horário da coleta;
4. Identificação efetiva do paciente;
5. Identificação correta da amostra coletada;
6. Cuidados especiais;
7. Registro da identidade do colhedor ou receptor da amostra;
8. Descarte seguro do material usado na coleta;
9. Preenchimento correto do cadastro do paciente;
Transporte e acondicionamento das amostras;
COLETA E TRANSPORTE
FASE ANALÍTICA
1. Nome do procedimento
2. Nome e fundamento do método
3. Principais aplicações clínicas
4. Amostra do paciente – condições em que pode ser aceitável.
5. Padrões, calibradores, controles, reagentes e insumos
6. Equipamentos
7. Procedimento detalhado
8. Significado clínico
9. Referências bibliográficas
FASE PÓS-ANALÍTICA
 Etapas:
1. Cálculo;
2. Análise de consistência dos resultados
3. Liberação dos laudos;
4. Armazenamento da amostra do paciente
5.Transmissão e arquivamento dos resultados;
6. Consultoria técnica;
TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
ISOLAMENTO VIRAL
É fundamental a importância de comprovar-se a presença do vírus;
PROPAGAÇÃO VIRAL EM ANIMAIS
Em geral o vírus é inoculado em um hospedeiro (Camundongo);
É verificado os sintomas clínicos, o animal é sacrificado e é realizado exames histopatológicos;
Animais de grande porte não são utilizados;
PROPAGAÇÃO VIRAL EM OVOS EMBRIONADOS
Até a década de 1950 essa técnica era bastante utilizada;
ISOLAMENTO VIRAL
Culturas de células: é uma forma de isolamento viral onde é possível manter células viáveis;
TIPOS DE CULTURA 
Cultura Primária: Uma cultura primária é estabelecida a partir do crescimento de células oriundas de um fragmento de tecido obtido por desagregação mecânica ou enzimática;
Cultura Secundária – São células retiradas de uma cultura primária e usadas em um recultivo;
LINHAGENS CELULARES
Existem células que não perdem as características do tecido de origem, mas possuem alta proliferação. (Linhagem Contínua);
Quando as características das células são modificadas são chamadas de Células Transformadas;
CÉLULAS GENETICAMENTE MODIFICADAS
Essa técnica foi proposta por Stabell & Olivo em 1992;
Com a presença de cor é possível ser visualizado ao microscópio;
CARACTERÍSTICAS
Células aderentes e não aderentes:
MATERIAIS UTILIZADOS
EFEITO CITOPÁTICO (CPE)
São alterações morfológicas nas células ou em grupos celulares induzidos por vírus; 
VANTAGENS E DESVANTAGENS
Facilitam a identificação e detecção;
Permitem a produção de partículas viáveis, que podem ser estocadas;
Pode-se isolar diferentes vírus;
Alguns vírus não crescem em culturas ou são muito complicados de se cultivar;
O tempo para o crescimento é muito demorado;
HEMAGLUTINAÇÃO
Certos vírus são capazes de aglutinar hemácias de animais (Ácido Siálico);
DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO
Confirmar a suspeita diagnóstica laboratorialmente causada por vírus;
Identificação do vírus isolado em cultura;
Estudar o comportamento do vírus na comunidade;
TESTE DE INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO
1ª Etapa
2ª Etapa
TESTE DE NEUTRALIZAÇÃO (TN)
Incubar
FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO (FC)
IMUNOFLUORESCÊNCIA (IF)
Fluorocromos
Absorvem luz
Elevam o nível de energia dos elétrons
Quando retornam ao estado basal
Emitem fluorescência de comprimento de onda maior do que o comprimento de onda da fonte excitadora original 
Principais fluorocromos
Isotiocianato de fluoresceína
Lisamina-rodamina B
 Outros: Vermelho Texas, Ficoeritrina
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA
Insumos
Lâmina de vidro de fina espessura
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA
Técnica em fase sólida
Reação em lâmina
Adição de conjugado para cada Ag
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA
Adição do conjugado (Ac específico marcado com fluorocromo);
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA
Incubação - Conjugado se fixa ao antígeno
Lavagem – Acs não ligados são removidos
Observação em microscópio de fluorescência
Sensibilidade dos testes de IFA direta é limitada pelo nível de fluorescência detectável pelo olho humano
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA
Toxoplasmose
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
Anti-imunoglobulina marcada com fluorocromo
Amplifica a sensibilidade
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
T. cruzi
TESTE IMUNOENZIMÁTICO (ELISA)
ELISA (Enzyme-linked immuno sorbent assay)
		Baseia-se na imobilização de um dos componentes, em fase sólida, e na utilização de um conjugado ligado a uma enzima
TESTE IMUNOENZIMÁTICO (ELISA)
Componentes da reação - ELISA
Amostra
Diluente da amostra
Proteína bloqueadora
Solução de lavagem
Conjugados
Substratos cromogênicos
TESTE IMUNOENZIMÁTICO (ELISA)
Fase sólida
ELISA INDIRETO
ELISA DIRETO (SANDUÍCHE)
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
 1983: PCR 
(Reação de polimerização em cadeia)
 Kary B. Mullis
Prêmio Nobel de Química 1993
PCR
 síntese in vitro de grandes quantidades de um fragmento específico de dna, a partir de quantidades mínimas de dna;
- Replicação in vitro
- 1 molécula de DNA como molde
DESVANTAGENS 
requer conhecimento da seqüência de dna flanqueadora ( seqüência de interesse) → confecção dos primers;
extremamente sensível → contaminação laboratorial;
não se aplica a grandes sequências
APLICAÇÕES DA PCR
- Seleção de clones recombinantes
-Estudo do padrão de expressão gênica
-Sequenciamento direto de produtos amplificados
-Detecção de mutações em genes específicos
 - Diagnóstico de câncer e doenças genéticas
 - Determinação do mecanismo de ação de substâncias mutagênicas
-Diagnósticos de doenças infecciosas
 - Detecção de bactérias, vírus e protozoários parasitos
-Diagnóstico pré-natal em caso de risco
-Elucidação de relações evolutivas entre espécies, utilizando material arqueológico
-Grande potencial na Medicina Forense
““INGREDIENTES” DA PCR 
ETAPAS DA PCR
1989, o DNA Thermal Cycler – 1o Termociclador automático.
 Termocicladores automáticos: aquecimento por resistências elétricas e refrigeração. 
VARIAÇÕES DA PCR
Multiplex PCR:
Refere-se a um conjunto de primers;
Criada para diminuir o tempo do diagnóstico;
Já existem Kits para vírus respiratórios, enterovírus, herpesvírus e para detecção simultânea de vírus e protozoários;
VARIAÇÕES DA PCR
PCR Real Time:
Teve o objetivo de automatizar, deixar mais rápida e segura a PCR;
São utilizadas sondas fluorescentes;
O material amplificado pode ser monitorado em tempo real;
SYBR green;
Taqman;
TESTE RÁPIDO HIV/SIDA
Triagem qualitativa
Para detecção de
anticorpos para HIV ½
 Teste se baseia nas
tecnologias de imunocromatografia e fluxo lateral
Resultado em 10 min
PROCEDIMENTO