Atividade Enzimática De Protease - Método

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Atividade enzimática de Protease 
 
Reação enzimática 
• 1 mL do extrato enzimático; 
• 2,5 mL de albumina 0,5%; 
Manter em banho-maria à 37°C por 30 min; 
Interromper a reação pela adição: 
• 5 mL de TCA (ácido tricloroacético) 10%; 
Centrifugar em 5000 rpm à 4°C. 
 
Quantificação dos aminoácidos liberados 
Retirar uma alíquota de 3 mL do tubo de reação (colocar em outro tubo de centrifuga) e adicionar: 
• 6 mL de NaOH 1 M; 
• 1 mL do reagente Folin-Ciocalteau 2N diluído (1:2) com água destilada; 
Deixar repouso por 10 min e ler a absorvância à 660 nm. 
 
Branco 
(para eliminar interferência reagentes) 
Tempo zero 
(para eliminar interferência da enzima) 
Reação enzimática 
2,0 mL de H2O 1 mL de enzima 1 mL de enzima 
2,5 mL de albumina 0,5% 5 mL de TCA 10% 2,5 mL de albumina 0,5% 
- 1 mL de H2O 1 mL de H2O 
Banho-maria 37 °C 30 min 
5 mL de TCA 10% 2,5 mL de albumina 0,5% 5 mL de TCA 10% 
Centrifugar 4°C 5 min 5000 rpm 
Alíquota de 3 mL Alíquota de 3 mL Alíquota de 3 mL 
6 mL de NaOH 1M 6 mL de NaOH 1M 6 mL de NaOH 1M 
1 mL de Folin 1:2 1 mL de Folin 1:2 1 mL de Folin 1:2 
Repouso (10 min) Repouso (10 min) Repouso (10 min) 
Leitura 660 nm 
Utilizar curva de tirosina para fins de cálculo.