Revisão Bibliográfica enzimas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
 Faculdade de Nutrição
 Departamento de Alimentos e Nutrição
 Curso de Ciência e Tecnologia de Alimentos
Utilização de celulases de Kretzschmaria sp. como alternativa a coquetéis enzimáticos comerciais utilizados para sacarificação de bagaço de cana-de-açúcar
Maionara Oliveira França
Outubro
2018
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 
Enzimas
Devido à tendência da procura de meios alternativos mais sustentáveis, o desenvolvimento tecnológico mundial procura cada vez mais meios de produção a partir de processos biotecnológicos. Por isso vários processos químicos convencionais vêm sendo substituídos por processos enzimáticos, tornando o desenvolvimento e a melhoria desta tecnologia de grande importância (COELHO et al., 2001).
Enzimas são catalisadores de reações biológicas, em sua grande maioria de origem proteica, aplicadas industrialmente pela capacidade de aumentar a velocidade de uma reação. Para a indústria, utilizar enzima como catalisador é vantajoso, pois os processos catalisados pelas enzimas são normalmente mais rápidos, eficientes e ambientalmente sustentáveis. Isso porque as enzimas possuem uma alta especificidade, ou seja, a enzima e o substrato são complementares geometricamente. As enzimas são utilizadas em vários segmentos industriais, como nas indústrias têxtil, farmacêutica, de alimentos, de papel e celulose. Enzimas podem ser produzidas por fontes vegetais, animais e microbianas (FERREIRA et al., 2009). 
Frente aos catalisadores químicos, as enzimas possuem algumas vantagens que justificam seu amplo uso, como: serem produtos naturais biológicos e biodegradáveis, terem alta especificidade nas reações, não serem consumidas durante o processo, aumentarem a velocidade das reações por diminuírem a energia de ativação, serem estéreo seletivas e atuarem em faixas de pH e temperaturas brandas (FERREIRA et al., 2009).
Os substratos são reagentes que participam das reações que são catalisadas pelas enzimas. Ao se comparar a conversão de um substrato em produto catalisado pela enzima e pelo catalisador químico, nota-se uma conversão muito mais rápida e eficiente com o uso das enzimas (FERREIRA et al., 2009).
O processo de uma reação é visto como um processo de transformação de reagente ou “substrato” em produto. Nas reações catalisadas, o substrato é elevado a um estado de transição com um gasto reduzido de energia livre em comparação com a reação não catalisada, como mostra na Figura 1. (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010)
Figura 1: Esquema e curva de conversão de substrato em produto catalisado na presença e na ausência de enzima. E= enzima.
Fonte: FERREIRA et al. (2009)
As enzimas podem ser divididas em seis classes, segundo as reações que catalisam: oxidorredutases catalisam reações de óxido-reduções; transferases catalisam reações de transferência de grupos de uma molécula a outra; hidrolases catalisam reações de hidrólise; liases catalisam reações de quebra de ligações; isomerases catalisam reações de mudança intramolecular, onde um substrato transforma-se em um produto isômero; e ligases catalisam a ligação covalente de moléculas, com simultânea quebra de uma ligação de alta energia (ORLANDELLI, et al. 2012).
A utilização das tecnologias enzimáticas é considerada um dos campos mais promissores para síntese de compostos agregados. Processos industriais biocatalisados apresentam baixo impacto ao meio ambiente, além de um consumo energético menor que outros processos; sendo as enzimas biodegradáveis e com alta especificidade, elas reduzem efeitos indesejados do processamento (MITCHELL; BEROVIC; KRIEGER, 2000). 
Enzimas produzidas por microrganismos
		A utilização das enzimas na indústria biotecnológica tem aumentado gradativamente ao longo dos anos. Atualmente, a maioria das enzimas encontradas é de origem microbiana. Isso é devido à maior diversidade de enzimas encontradas a partir de microrganismos e também às dificuldades e custos da extração de enzimas de origem vegetal e animal. Portanto, há um grande incentivo para maior exploração da diversidade microbiana e sua relevância para a indústria biotecnológica (PALMA, 2003).
Apesar das enzimas mais pesquisadas serem aquelas de origem animal e vegetal, as enzimas microbianas têm um alto potencial para a sua utilização nas industrias, sendo facilmente produzidas por fermentação em grande quantidade (ORLANDELLI, et al. 2012). Enzimas microbianas apresentam várias vantagens tais como: produção independente de fatores sazonais, possibilidade da utilização de substratos baratos como os resíduos agrícolas e o fato de o rendimento na produção poder ser elevado a partir da otimização das condições nos processos fermentativos por mutações ou a partir da tecnologia do DNA recombinante (FERREIRA et al., 2009).
A produção de enzimas microbianas vem ocupando mais espaço atualmente na biotecnologia industrial. No mercado mundial, as proteases ocupam primeiro lugar em produção, seguidas pelas amilases. Atenção muito especial tem sido dada às enzimas de fungos fitopatogênicos. Vários deles produzem enzimas extracelulares, que podem ser indicativas de patogenicidade. No momento em que o fungo infecta a planta, ocorre a produção de enzimas para sua nutrição e manutenção com a consequente causa de doença na planta. Existem também os fungos denominados como endofíticos ou endófitos que são capazes de produzir enzimas interessantes que colonizam o interior de plantas sadias, podendo ser encontrados em órgãos e tecidos vegetais. Estes fungos não tem a capacidade de causar dano aos seus hospedeiros, eles beneficiam o hospedeiro controlando a proliferação de microrganismos fitopatogênicos (ORLANDELLI, et al. 2012).
O interesse pela fisiologia, bioquímica e genética de fungos filamentosos tornou possível o reconhecimento do seu potencial de produção de enzimas para a industrial. Para a produção de enzimas a partir de microrganismos, deve-se inicialmente identificar e adquirir o microrganismo produtor, podendo ser de uma linhagem selvagem ou modificada por genética clássica ou técnicas de biologia molecular. Muitas enzimas obtidas a partir de fungos já são produzidas para fins comerciais (ORLANDELLI, et al. 2012).
Para obter microrganismos produtores de enzimas para a aplicação industrial podem ser utilizadas técnicas como o isolamento a partir de recursos naturais, compra em coleções de culturas, obtenção de mutantes naturais, obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais e obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de engenharia genética (FERREIRA et al., 2009). 
Posteriormente à obtenção do microrganismo, o mesmo é cultivado em fermentadores para a produção de quantidades industriais do biocatalisador. A fermentação inicia-se com a escolha do microrganismo ou enzimas adequadas para o processo, seguida da transformação da matéria prima, em condições que podem exigir esterilização, aeração e controle do processo (pH, temperatura, por exemplo.) O processo é finalizado pela separação e purificação do produto final (FERREIRA et al., 2009). 
Existem dois tipos principais de fermentações para a produção de enzimas: fermentação submersa (FS) e fermentação em estado sólido (FES) ou fermentação em meio sólido (FMS) (FERREIRA et al., 2009). 
Nos processos de fermentação submersa (FS), o microrganismo na forma de um inóculo é introduzido em um meio líquido. Este meio possui diversas condições controladas como: agitação, aeração, pH, temperatura e concentração de oxigênio dissolvido, entre outros. Os nutrientes estão dissolvidos no meio líquido sendo facilmente utilizados pelos microrganismos (FERREIRA et al., 2009). O método de fermentação submersa é normalmente realizado em fermentadores fechados, com agitadores,dispositivos de aeração para introdução de ar estéril e camisas e serpentinas para o controle de temperatura. Caso seja necessário um processo de assepsia, o mesmo pode ser realizado através de esterilização do meio (dentro ou fora do fermentador), a desinfecção ou esterilização do equipamento por injeção de vapor ou mediante o calor gerado por serpentinas, sendo essa medida extensiva a todos os ductos de entrada e saída e às válvulas correspondentes além da esterilização do ar mediante filtros adequados (FERREIRA et al., 2009). A fermentação submersa utiliza um meio fermentativo líquido, onde as fontes de nutrientes utilizadas são solúveis levando ao desenvolvimento do microrganismo em presença de água livre. O conteúdo de água nesse processo é superior a 95% (ORLANDELLI, et al. 2012).
A fermentação em estado sólido (FES) ou em meio sólido (FMS) ou ainda em substrato sólido (FSS) ocorre em meios sólidos com ausência de água ou com pouca presença de água. Entretanto, os substratos utilizados devem conter umidade suficiente para que os microrganismos tenham a capacidade de se nutrir e sustentar seu metabolismo (FERREIRA et al., 2009). Este tipo de processo torna-se mais vantajoso pela economia de água e redução das chances de contaminação (POLIDORO, 2009). Amilases, proteases, xilanases, celulases e pectinases, entre outras, são produzidas por fermentação em meio sólido. Os microrganismos que mais se adaptam a esse tipo de fermentação são os fungos filamentosos por apresentarem hifas e boa tolerância à baixa atividade de água e elevada pressão osmótica (FERREIRA et al., 2009.
Celulases
Celulases são enzimas capazes de promover a hidrólise de materiais celulósicos. São enzimas biocatalisadoras com alta especificidade que atuam em sinergia promovendo a liberação de açúcares, sendo a glicose o produto de maior interesse pela indústria, por sua possibilidade de conversão em etanol (CASTRO; PEREIRA, 2010).
As celulases podem ser classificadas pelo local em que atuam no substrato celulósico, sendo divididas em três grupos: endoglucanases, que clivam ligações internas da fibra celulósica; exoglucanases, que atuam na região externa da celulose e β-glicosidases, que hidrolisam oligossacarídeos solúveis em glicose, como mostra a Figura 2 (CASTRO; PEREIRA, 2010).
Endoglucanase é a enzima responsável por iniciar a hidrólise. A endoglucanase hidrolisa as regiões internas da estrutura amorfa da fibra celulósica, liberando oligossacarídeos de diversos graus de polimerização e, por consequência, produz novos terminais, um redutor e um não redutor. Devido à fragmentação da celulose em oligossacarídeos, esta enzima é responsável pela solubilização rápida do polímero (CASTRO; PEREIRA, 2010).
As exoglucanases são constituídas por celobio-hidrolases e glucano-hidrolases (CASTRO; PEREIRA, 2010). A celobio-hidrolase participa da hidrólise inicial da fibra e é a responsável pela amorfogênese, um fenômeno que ainda não pode ser explicado completamente, porém sabe-se que ocorre uma ruptura física no substrato gerando a desestratificação das fibras, pelo aumento das regiões intersticiais. Pelo fato da amorfogênese tornar amorfas as regiões cristalinas do polímero celulósico e, por consequência, o deixar mais exposto às celulases, a taxa de hidrólise da celulose tem um aumento significativo. Essas enzimas geralmente são inibidas pelo produto formado a partir da sua hidrólise, ou seja, celobiose (CASTRO; PEREIRA, 2010). A glucano-hidrolase, é pouco explanada, porém é de alta importância pela sua estratégia de hidrólise da fibra celulósica, pois tem a capacidade de liberação de glicose diretamente do polímero (CASTRO; PEREIRA, 2010).
β-glicosidade, tem como propriedade a hidrólise de celobiose e oligossacarídeos solúveis em glicose. Assim como a celobio-hidrolase, também sofre inibição pelo seu produto gerado pela hidrólise, ou seja, a glicose (CASTRO; PEREIRA, 2010).
Figura 2: Modelo simplificado de hidrólise enzimática da celulose pelas celulases.
Fonte: Phitsuwan, Laohakunjit, Kerdchoechuen, Kyu, e Ratanakhanokchai, (2013).
O mercado das enzimas
O mercado mundial das enzimas divide-se majoritariamente em três segmentos: enzimas empregadas na indústria de alimentos; enzimas técnicas e, enzimas empregadas na produção de ração animal. As enzimas empregadas no setor alimentício têm destaque, principalmente para a produção de xarope de açúcar invertido e de compostos aromatizantes. As enzimas técnicas também possuem destaque; são utilizadas na formulação de detergentes, produção de papel e celulose, manufatura de couros e produção de fármacos. Este é o principal mercado consumidor de enzimas, detendo aproximadamente 50% do total das enzimas comercializadas (EFINITION, 2005).
No setor industrial, as enzimas mais utilizadas são as proteases, que ocupam 40% do mercado de enzimas, seguidas das carboidrases (amilases e celulases) e lipases. No entanto, o crescimento das polimerases e das nucleases, juntamente com outras enzimas como fitases e celulases, poderá levar essas enzimas a ultrapassarem aquelas mais utilizadas no mercado na atualidade (EFINITION, 2005).
Na indústria alimentícia, a tecnologia enzimática já é realidade no mundo inteiro, tendo um grande potencial no Brasil, principalmente pela redução de custos e melhoria da qualidade. A utilização de enzimas no mercado alimentício é ampla, especialmente no tratamento de tecidos vegetais e de polissacarídeos, conforme mostra no quadro abaixo (Quadro 1). Os setores de alimentos e de bebidas são os mais indicados para a absorção inicial de produtos e processos alternativos, que atendam às exigências do mercado consumidor ávido por soluções conforme os padrões considerados ideais de alimentação e saúde (EMBRAPA, 1979).
Quadro 1. Principais enzimas comercializadas e suas aplicações na indústria de alimentos.
Fonte: EMBRAPA (1979)
Importância da elaboração de coquetéis enzimáticos provenientes de fungos
	Existem vários microrganismos cientificamente interessantes pela sua capacidade de degradação de biomassas; dentre estes, os fungos filamentosos se destacam pela sua habilidade em produzir misturas enzimáticas de alta especificidade para os substratos nos quais se desenvolvem. Esses coquetéis necessitam de otimização e para isso é necessário se investir em estudos de novos fungos ou de enzimas mais eficientes dos fungos já conhecidos (BERNARDI, 2017). 
	A utilização de misturas enzimáticas para degradação de biomassas é mais eficiente, pois as enzimas agem em sinergia e impulsionam umas às outras em suas ações. Normalmente coquetéis enzimáticos possuem maior poder de hidrólise e culminam em maiores conversões e produção de açúcares (PELLEGRINI, 2016).
No trabalho realizado por Singh et al. (2009) foi estudada a hidrólise enzimática de bagaço de cana explodido e de celuloses comerciais por um coquetel enzimático comercial (Accellerase® 1000) e um coquetel enzimático produzido por Penicillium. Nesse trabalho foi concluído que, para a hidrólise do bagaço explodido e da celulose comercial tratada, os dois coquetéis tiveram resultados próximos; porém, na hidrólise da celulose microcristalina e da celulose não-tratada, as celulases do fungo filamentoso Penicillium mostraram maiores rendimentos. 
Conhecer a contribuição de cada enzima em uma mistura e identificar misturas eficazes que contêm um número mínimo de atividades enzimáticas essenciais, em uma combinação ótima, são fatores que devem ser estudados e que possivelmente irão contribuir para a viabilidade econômica da rota enzimática (BUSSAMRA, 2014).
Os principais coquetéis enzimáticos são produzidos atualmente a partir de fungos e suplementados por outras atividades, produzidas em sistemas recombinantes, com o objetivo de obter formulações otimizadas e eficientes. Os fungos produzem uma grande diversidade de enzimas e, a depender do meio e das condições de cultivo, as atividades enzimáticas podem ser moduladas (BUSSAMRA, 2014).
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A produção prudente de coquetéissintéticos com a suplementação de coquetéis fúngicos pode oferecer níveis máximos de conversão do substrato. Assim, pode-se levar à redução dos custos do processo de hidrólise, uma vez que sejam adicionadas baixas quantidades de enzimas necessárias à reação de hidrólise (BUSSAMRA, 2014). Outra maneira de se diminuir os custos é conhecer coquetéis enzimáticos oriundos de fungos que sejam alternativos aos comercialmente disponíveis, preferencialmente aqueles obtidos de fontes de carbono abundantes e de baixo custo como as biomassas vegetais (FACUNDES, 2014).
REFERÊNCIAS
BERNADI, A. V. Identificação das principais enzimas hidrolíticas de Aspergillus Fumigatus quando crescido em bagaço de cana-de-açucar. 2017. 94f, Dissertação (mestrado). Faculdade de filosofia, ciência e letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017. 
BUSSAMRA, B. C. Melhoramento de coquetéis enzimáticos para a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar. Campinas: Universidade Estadual de Campinas, 2014. 
CASTRO, A. M.; PEREIRA, N. Produção, propriedades e aplicação de celulases na hidrólise de resíduos agroindustriais. Rio de Janeiro: Química Nova, 2010. v. 33
COELHO, M. A. Z. et al. Aproveitamento De Resíduos Agroindustriais: Produção De Enzimas a Partir Da Casca De Coco Verde. Boletim do Centro de Pesquisa de Processamento de Alimentos, v. 19, n. 1, p. 33–42, 2001. 
DAMODARAN, S.; PARKIN, K. L.; FENNEMA, O. R. Química de Alimentos de Fennema. 4. ed. Porto Alegre: Artmed, 2010. v. 1, 2010.
DE SOUSA GOMES, K. et al. Purification and Characterization of Xylanases from the Fungus Chrysoporthe cubensis for Production of Xylooligosaccharides and Fermentable Sugars. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 182, n. 2, p. 818–830, 2017. 
EFINITION, D. Eau - Les Rejets Industriels Et Leurs Caracteristiques. v. 34, n. 5, p. 3–5, 2005. 
EMBRAPA. Enzimáticos, 1979, Disponivel em: http://www.agencia.cnptia.embrapa.br/gestor/tecnologia_de_alimentos/arvore/CONT000fid5sgif02wyiv80z4s473v6o7sud.html, Acesso em: 26/10/2018.
FACUNDES, B. C. Fungos Filamentosos Produtores De Holocelulases Prospectados Em Mata De Galeria Do Cerrado Tocantinense. p. 108, 2014. 
 
FERREIRA, P. et al. Processos Químicos. Disponível em: <https://static.sistemafieg.org.br/repositoriosites/repositorio/senai/download/Publicacoes/Revista_Cientifica_Processos_Quimicos_/2010/processosquimicos_052009.pdf#page=9>. 
PALMA, M. B. Produção de xilanases por Thermoascus aurantiacus em cultivo em estado sólido. p. 1–169, 2003. 
PELLEGRINI, V. O. Clonagem molecular, espressão, purificação e caracterização estrutural da endoglucanase de Trichoderma harzianum visando o desenvolvimento de coquetéis enzimáticos para a produção de etanol lignocelulósico. Tese (Doutorado em Ciências) Instituto de Física , Universidade de São Paulo., 2016. 
PHITSUWAN, P., LAOHAKUNJIT, N., KERDCHOECHUEN, O., KYU, K. L., & RATANAKHANOKCHAI, K.. Present and Potential Applications of Cellulases in Agriculture, Biotechnology, and Bioenergy. Folia Microbiologica, Volume 58, Edição 2 , pp. 163-176 . 
RAVELY CASAROTTI ORLANDELLI, VÂNIA SPECIAN, ARETUSA CRISTINA FELBER, J. A. P.. Enzimas de interesse industrial: produção por fungos e aplicativos. SaBios : revista de saúde e biologia, p. 97–109, 2012. 
SINGH, R.; VARMA, A. J.; LAXMAN R. S.; RAO, M. Hydrolysis of cellulose derived from steamexploded bagasse by Penicillium cellulases: Comparison with commercial cellulose. Bioresource Technology. n.100, p.6679–6681, 2009.