Métodos Analíticos

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Disciplina: Bioquímica Clínica 
MÉTODOS ANALÍTICOS 
Prof. Dra. Michele Janegitz Acorci Valerio 
Biomédica Kelly Colussi Pinheiro Precipito 
Métodos Analíticos 
 
• São os meios utilizados no Laboratório Clínico 
para análise das amostras; 
 
• Cada laboratório utiliza o método que se 
enquadra melhor com sua rotina; 
Métodos Analíticos 
 
• O método deve atender às características: 
– Especificidade; 
– Sensibilidade; 
– Precisão; 
– Exatidão; 
Espectrofotometria 
 
• Método que estuda a interação da luz com a 
matéria; 
• Cada composto químico absorve, transmite ou 
reflete luz ao longo de um determinado 
intervalo de comprimento de onda; 
• Cada cor tem um comprimento de onda 
diferente, então quando a luz atinge um 
objeto, alguns comprimentos de onda são 
absorvidos e outros refletidos de volta; 
Espectrofotometria 
 
• Uso: 
– Medir determinados ingredientes em uma droga; 
– Medir o crescimento bacteriano; 
– Diagnosticar um paciente com base na quantidade 
de determinado analito presente em sua urina ou 
sangue; 
 
Espectrofotometria 
 
• As análises podem ser: 
– Quantitativas: identificação da concentração da 
substância; 
– Qualitativas: identificação de uma substância 
desconhecida, já que cada substância irá refletir e 
absorver a luz de forma diferente; 
 
Lei de Lembert-Beer 
 
• A quantidade de luz absorvida ou transmitida 
por uma determinada solução depende da 
concentração do soluto e da espessura da 
solução; 
 
Absorbância é diretamente 
proporcional à concentração 
do analito! 
 
Tipos de Reações 
 
• Reações Colorimétricas; 
• Reações de Ponto Final; 
• Reações Cinéticas; 
Reações Colorimétricas 
 
• Determinação espectrofotométrica de 
compostos corados; 
• Analito + Reagente Cromogênico; 
• A reação colorimétrica é amplamente utilizada 
com as metodologias cinéticas 
 
 
A velocidade da formação 
de um produto é medida 
por intervalo de tempo 
Reações Colorimétricas 
 
• Uma molécula orgânica que se liga à uma enzima 
para ativar a reação química é chamada de 
coenzima; 
• As coenzimas podem ou não ser utilizadas como 
substratos nas reações químicas, utilizadas nas 
técnicas laboratoriais; 
As coenzimas podem ser adicionadas 
aos testes para favorecer o aumento 
da velocidade 
 
Reações de Ponto Final 
 
• São reações em que a concentração do 
produto formado atinge um valor máximo, 
permanecendo inalterada por um 
determinado tempo em função da 
estabilidade do produto; 
• Estas reações podem ser colorimétricas ou 
ultravioleta; 
 
 
Reações de Ponto Final 
 
• Devido a sua flexibilidade, é a reação mais empregada no LAC, 
podendo ser utilizada em metodologias manuais ou 
automatizadas. 
• Ex.: Dosagens químicas ou enzimáticas de glicose e colesterol. 
 
 
Reações Cinéticas 
 
• Geralmente utilizada em reações em que o 
analito é uma enzima; 
• A atividade enzimática é analisada por meio da 
reação dela com um composto químico 
denominado substrato; 
• Em geral, a reação é acoplada a uma reação 
colorimétrica: à medida que a conversão 
enzimática se processa e o produto é gerado, há 
mudança de cor que deve ser observada em 
espectrofotômetro; 
Reações Cinéticas 
 
• Leituras sucessivas em intervalos de tempos iguais 
devem ser feitas; 
• Aos valores obtidos na leitura espectrofotométrica 
deve-se aplicar fatores de correção que variam de 
acordo com o exame a ser realizado; 
• Classificação: 
– Reações Cinéticas de Tempo Fixo; 
– Reações Cinéticas Contínuas; 
– Reações Cinéticas de 2 Tempos; 
 
Reações Cinéticas de Tempo Fixo 
 
• São reações que utilizam um tempo fixo de incubação, sendo 
a formação do produto interrompida por qualquer processo, 
como por exemplo, adição de determinado reagente; 
• Ex.: Dosagem de fosfatase alcalina, método de Roy mod. 
(mede a formação do produto após 10 minutos de incubação 
em temperatura de 37°C); 
 
 
Reações Cinéticas Contínuas 
 
• A velocidade da formação do produto é medida em intervalos 
de tempo (3 no mínimo); 
• Ex.: Dosagem de fosfatase alcalina - método de p-Nitrofenol. 
 
 
Reações Cinéticas de 2 Tempos 
 
• É uma variante da Reação Cinética Contínua; 
• Faz-se uma leitura aos 30 segundos (serve como 
Branco) e a outra leitura aos 90 segundos. Utiliza-se 
de 1 minuto para calcular a concentração do analito; 
• A reação cinética de 2 tempos serve para diminuir o 
tempo da reação e também para reduzir a influência 
de interferente; 
• Ex.: Dosagem de creatinina, método Cinético-
Colorimétrico; Dosagem de ureia, método Cinético-
UV; 
 
 
Reações Cinéticas de 2 Tempos 
 
Como Espectrofotômetro funciona? 
 
1. Uma amostra é colocada dentro do espectrofotômetro. 
2. Há uma fonte de luz e um dispositivo chamado monocromador 
que divide a luz em comprimentos de onda individuais. 
3. Uma fenda ajustável permite apenas um comprimento de onda 
específico através da solução de amostra. 
4. O comprimento de onda da luz atinge a amostra, que está na 
cubeta. 
5. A luz passa através da amostra e é lida pelo detector. 
 
 O espectrofotômetro é muito sensível e qualquer interferência 
pode mostrar um resultado errado. As cubetas têm papel 
fundamental e sua limpeza e uso correto são essenciais para a 
obtenção de resultados confiáveis. 
 
 
Espectrofotômetro Manual 
 
• Aumento dos erros na fase 
analítica; 
– Cubetas; 
– Leitura do teste; 
• Resultado impresso 
somente no Display do 
aparelho – anotar 
resultado (erros fase pós-
analítica); 
 
Espectrofotômetro Semi-Automático 
 
• Ideal para laboratórios com 
baixa rotatividade; 
• Grava a programação com os 
requisitos da corrida de cada 
analito; 
• Fornece o valor da 
absorbância e da 
concentração do analito; 
• Impressão dos resultados 
(evita erros pós-analíticos); 
Espectrofotômetro Automático 
 
• Aumento da produtividade e 
performance; 
• Ideal para laboratórios com alta 
rotatividade; 
• 200 – 500 amostras por hora; 
• Fase analítica totalmente 
automatizada; 
• Identificação da amostra – código 
de barras; 
• Administração de reagentes 
automática; 
• Redução de erros na fase analítica; 
 
Quimioluminescência 
 
• Consiste na emissão de energia luminosa a 
partir de uma reação química; 
• Energia luminosa ocorre devido à excitação 
eletrônica dos átomos envolvidos na reação; 
• Uso: identificação de hormônios, drogas e 
microrganismos através de testes 
colorimétricos; 
 
Quimioluminescência 
 
• A técnica baseia-se na ligação Antígeno-
Anticorpo; 
• Ag ou Ac é conjugado a uma substância que, 
quando ativada, emite luz visível; 
• Emissão de luz é proporcional ao analito 
pesquisado; 
Quimioluminescência 
 
• Marcadores luminescentes (cromógenos) 
utilizados: 
– Luminol; 
– Derivados de acridina; 
– Sistema avidina-biotina; 
– Fluoresceína; 
Quimioluminescência 
 
Luminol: 
• Luminol, C8H7O2N3, composto em pó feito de 
nitrogênio, hidrogênio, oxigênio e carbono; 
• Muito utilizado na perícia criminal para investigação 
de vestígios de sangue; 
• Quando em contato com o sangue utiliza o ferro da 
hemoglobina como catalisador para a reação de 
liberação de luz; 
 
Quimioluminescência 
 
Luminol: 
• Os criminalistas misturam o pó de luminol com um 
líquido contendo peróxido de hidrogênio (H2O2) e um 
hidróxido (OH-); 
• O peróxido de hidrogênio e o luminol são os 
principais agentes da reação química, que é 
catalisada pelo ferro contido na hemoglobina; 
 
 
 
Eletroquimioluminescência 
 
•Utiliza a emissão de luz através da aplicação de 
potenciais de oxidação ou redução a um eletrodo 
imerso em soluções que emitem radiação (em geral 
compostos de rutênio); 
 
Eletroquimioluminescência 
 
• Método automatizado mais utilizado: Elecsys (Roche 
Diagnóstica) 
– Utiliza micropartículas revestidas de estreptavidina, 
anticorpo monoclonal específico biotinilado, e um 
anticorpo monoclonal específico para cada analito; 
– Essa mistura é fixada magneticamente na superfície do 
eletrodo e o que não se fixar é removido; 
– Por fim, há uma aplicação de corrente elétrica no eletrodo 
que induz uma emissão quimioluminescente, medida por 
um fotomultiplicador; 
Eletroquimioluminescência 
 
Elecsys 
E.L.I.S.A. 
 
• E.L.I.S.A. (Enzyme-lynked Immunosorbent Assay); 
• Também conhecido por imunoensaio ou teste 
imunoenzimático; 
• Metodologia amplamente usada para a confirmação de 
infecções virais, porém possui muitas aplicações bioquímicas; 
• Utiliza conjugado que pode estar ligado ao Ag ou ao Ac; 
• Substrato forma produto colorido que é medido por 
espectrofotometria; 
• Intensidade da cor é diretamente proporcional à 
concentração do analito; 
 
E.L.I.S.A. 
 
• O teste baseia-se na interação Ag-Ac; 
• Utiliza Ac secundário acoplado com enzima que produzirá 
substância corada; 
– Ac secundário liga-se à amostra do paciente; 
– Pode ser monoclonal (altamente específico) ou policlonal; 
• Alta sensibilidade – detecta quantidades mínimas do Ag ou Ac 
na amostra; 
• Alta especificidade – indica somente o Ag ou Ac desejado; 
• Possibilidade de testar várias amostras simultaneamente; 
 
E.L.I.S.A. 
 
• Classificação: 
– E.L.I.S.A. Indireto: Pesquisa de Ac; 
– E.L.I.S.A. Sanduíche: Pesquisa de Ag; 
– E.L.I.S.A. Competitivo: Detecção quantitativa de 
Ag; 
– E.L.I.S.A. Direto: Titulação de Conjugado; 
 
 
E.L.I.S.A. 
 
Uso do E.L.I.S.A. nas determinações de 
Marcadores tumorais: 
– Marcadores Tumorais: substâncias químicas 
presentes no sangue ou urina somente em casos 
de tumores, pois são produzidas por estes; 
– O mais popularmente conhecido é o PSA 
(Antígeno Prostático Específico) presente em altas 
quantidades em homens com câncer de próstata; 
 
 
E.L.I.S.A. 
 
Uso do E.L.I.S.A. nas determinações de 
Marcadores tumorais: 
– Na rotina laboratorial utiliza-se o E.L.I.S.A. para 
detecção do PSA, através do uso de Ac 
monoclonal específico para este marcador 
tumoral; 
 
E.L.I.S.A. 
 
Uso do E.L.I.S.A. nas determinações de drogas 
terapêuticas e de abuso: 
– Faz-se o uso de Ac monoclonal capaz de detectar 
a droga terapêutica ou de abuso; 
– Droga terapêutica: Essa técnica se faz útil para 
avaliar se há algum tipo de acúmulo do princípio 
ativo do medicamento que poderia levar a médio 
e longo prazo, algum tipo de dano reversível ou 
não ao paciente; 
E.L.I.S.A. 
 
Uso do E.L.I.S.A. nas determinações de drogas 
terapêuticas e de abuso: 
– Droga de abuso: Essa técnica se faz útil para 
avaliar o uso indevido de drogas, perícias 
criminais, testes antidoping antes de competições; 
Eletroforese 
 
• O princípio básico da eletroforese é o deslocamento 
de moléculas eletricamente ativas através de um gel 
após a aplicação de uma corrente elétrica; 
• Consiste em separar moléculas de acordo com seu 
peso molecular; 
• É uma técnica amplamente utilizada na detecção de 
ácidos nucleicos (DNA e RNA) e proteínas como 
hemoglobina, lipoproteinas e albumina; 
Eletroforese 
 
• Os tipos de geis mais utilizados são o de agarose e o 
de poliacrilamida. A diferença entre eles é o tamanho 
da rede que eles oferecem e a forma como são 
corados; 
• A visualização do gel de agarose é feita em câmara 
de UV, portanto é necessária a utilização de 
substância luminescente em UV, como por exemplo, 
brometo de etídio; 
• Gel de poliacrilamida é corado com nitrato de prata; 
Eletroforese 
 
Gel de agarose: 
– Agarose é um pó (polissacarídeo) que adicionado a uma 
solução tampão (TBE) previamente preparada se 
polimeriza formando um gel firme, onde serão aplicadas as 
amostras; 
– É a concentração da agarose que determina o tamanho da 
rede que será formada e isso é baseado na amostra a ser 
analisada. Após a “corrida” das amostras o gel é retirado e 
colocado em solução de Brometo de Etídio que fará com 
que a amostra que se deslocou no gel “brilhe” após a 
colocação em câmara de luz UV; 
Eletroforese 
 
Gel de poliacrilamida: 
– A poliacrilamida é uma substância formada por dois tipos de 
polímeros: acrilamida (com conformação linear) e 
bisacrilamida (com conformação em forma de “T”); 
– A junção destes polímeros leva a formação de uma rede mais 
“fechada”, útil na detecção de proteínas que são consideradas 
moléculas pequenas; 
Gel de poliacrilamida 
corado por nitrato de prata 
Cubetas 
de 
Eletroforese 
Eletroforese de Proteínas 
 
• A eletroforese é usada para identificar a presença 
de proteínas anormais, para comprovar a ausência 
de proteínas normais e para determinar que grupos 
específicos de proteínas estão aumentados ou 
reduzidos no soro, urina, líquor; 
Eletroforese de Proteínas 
 
• Utilizada no diagnóstico: 
– Suspeita de mieloma múltiplo, amiloidose ou outras 
gamopatias; 
– Presença de proteína de Bence Jones; 
– Quadros de infecções recorrentes; 
– Neuropatia periférica inexplicável; 
– Insuficiência cardíaca refratária; 
– Síndrome nefrótica; 
– Quadros de anemia e hepatoesplenomegalia; 
– Avaliação de doença hepática crônica; 
– Pacientes com VHS elevado; 
Eletroforese de Proteínas 
 
Proteínas pesquisadas: 
• Albumina 
• Proteína mais abundante no plasma, sendo sua 
função principal a manutenção da pressão osmótica 
coloidal; 
Eletroforese de Proteínas 
 
Proteínas pesquisadas: 
• Albumina 
• Reduzida: 
– Desnutrição e falha na absorção; 
– Gravidez; 
– Doença renal (especialmente síndrome nefrótica); 
– Doença hepática; 
– Doenças inflamatórias; 
– Síndromes com perda proteica; 
• Aumentada: 
– Desidratação; 
 
Eletroforese de Proteínas 
 
Proteínas pesquisadas: 
• Alfa 1 – glubulina 
• Principalmente composta por alfa-antitripsina. O 
restante (10%) se deve à alfa-glicoproteína ácida, 
alfa-fetoproteína e certas proteínas carreadoras; 
• Aumenta na reação inflamatória de fase aguda, 
especialmente nas inflamações gastrointestinais e 
neoplasias malignas; 
Eletroforese de Proteínas 
 
Proteínas pesquisadas: 
• Alfa 1 – glubulina 
• Reduzida: 
– Enfisema congênito (deficiência de a1-antitripsina, uma 
doença genética rara); 
– Doença hepática grave; 
• Aumentada: 
– Doenças inflamatórias agudas ou crônicas; 
 
Eletroforese de Proteínas 
 
Proteínas pesquisadas: 
• Alfa 2 – glubulina 
• É constituída por um grupo variado de proteínas: 
haptoglobina, alfa �-macroglobulina e 
ceruloplasmina; 
• Proteínas de fase aguda, aumentando sua 
concentração na presença de infecção, em procesos 
inflamatórios e imunes. 
Eletroforese de Proteínas 
 
Proteínas pesquisadas: 
• Alfa 2 – glubulina 
• Reduzida: 
– Hipertireoidismo; 
– Doença hepática grave; 
– Hemólise; 
• Aumentada: 
– Doença renal (síndrome nefrótica); 
– Doença inflamatória aguda ou crônica; 
Eletroforese de Proteínas 
 
Proteínas pesquisadas: 
• Beta glubulinas 
• Composta pela transferrina, hemopexina e 
Complemento C3; 
Eletroforese de Proteínas 
 
Proteínas pesquisadas: 
• Beta glubulinas 
• Reduzida: 
– Desnutrição; 
– Cirrose; 
• Aumentada: 
– Hipercolesterolemia; 
– Anemia ferropriva; 
– Alguns casos de mieloma múltiploou MGUS; 
Eletroforese de Proteínas 
 
Proteínas pesquisadas: 
• Gamaglobulinas 
• Predominantemente composta de imunoglobulinas 
do tipo IgG. As imunoglobulinas IgA, IgM, IgD e IgE se 
sobrepõem à junção beta-gama; 
• O aumento dos níveis de imunoglobulinas pode 
ocorrer de forma policlonal, monoclonal ou 
oligoclonal; 
Eletroforese de Proteínas 
 
Proteínas pesquisadas: 
• Gamaglobulinas 
• Picos policlonais decorrem da produção heterogênea 
de anticorpos que produzem elevação difusa das 
gamaglobulinas na resposta a quadros infecciosos e 
inflamatórios crônicos, doenças hepáticas e 
neoplasias; 
Eletroforese de Proteínas 
 
Proteínas pesquisadas: 
• Gamaglobulinas 
• Bandas oligoclonais (dois ou mais picos monoclonais) 
estão presentes ocasionalmente na hepatite aguda 
fulminante, infecções virais crônicas, infecções 
bacterianas e imunodeficiências; 
• Os picos monoclonais são resultados de uma única 
classe ou subclasse de imunoglobulinas produzidas 
por uma única linhagem de plasmócitos ou linfócitos 
B; 
Eletroforese de Proteínas 
 
Proteínas pesquisadas: 
• Gamaglobulinas 
• Reduzida: 
– Diversas doenças imunes genéticas; 
– Deficiência imune secundária; 
• Aumentada: 
– Monoclonal: 
− Macroglobulinemia de Waldenström; 
− Mieloma múltiplo; 
− Gamopatia monoclonal de significado clínico 
indeterminado (MGUS); 
 
 
Eletroforese de Proteínas 
 
Proteínas pesquisadas: 
• Gamaglobulinas 
• Aumentada: 
– Policlonal: 
- Doença inflamatória crônica; 
- Artrite reumatoide; 
- Lúpus eritematoso sistêmico; 
- Cirrose; 
- Dença hepática crônica; 
- Infecção aguda e crônica; 
- Imunização recente; 
 
Eletroforese de Hemoglobina 
 
• A análise das hemoglobinas constitui importante 
método diagnóstico para estudo das anemias 
hemolíticas e talassemias; 
• Método também utilizado: Cromatografia Líquida de 
Alta Performance (HPLC); 
Eletroforese de Lipoproteínas 
 
• As lipoproteínas são partículas de alto peso 
molecular, responsáveis pelo transporte de lipídios 
no plasma; 
• Os padrões de eletroforese de lipoproteinas são úteis 
na caracterização das dislipidemias secundárias e 
primárias; 
 
Eletroforese de Lipoproteínas 
 
• As lipoproteinas recebem nomes de acordo com sua 
mobilidade: 
– HDL (alfa-lipoproteina) migram com as alfa-1-globulinas; 
– LDL (beta-lipoproteinas) migram com as beta-globulinas; 
– LDL (pré-betalipoproteinas) migram com as alfa-2- 
globulinas;