Resumo imuno

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Parâmetros e qualidade de imunoensaios
· Um teste de laboratório ele representa uma probabilidade que reflete a situação clínica do paciente do momento da coleta e quando este teste é avaliado ele consiste em uma importante ferramenta do auxílio p/o diagnostico ou mudar hipótese clínica inicial
· Os parâmetros bioquímicos e imunológicos eles são importantes para que os médicos consigam então elaborar um diagnostico fidedigno
· Para ser efetivo é importante que o laboratório garante a qualidade desse imunoensaios
Padrão ouro
· Ideal para cada diagnostico e patológica que se encontra o padrão ouro
· Utilizado para definir o verdadeiro estado do paciente
· Resultado dele é altamente fidedigno 
· A validação de um teste diagnóstico é feita contra o desempenho de outro teste, consagrado como válido
· A principal utilidade da busca de um novo teste é que ele seja menos invasivo ou de custo menos elevado. 
Parâmetros para validação de um teste sorológico
· VP e FN- falha no teste ou estão em algum momento biológico
· SENSIBILIDADE:
· A sensibilidade de um teste sorológico refere-se à porcentagem de resultados positivos pelo teste na população de doentes, ou seja, proporção de resultados verdadeiros positivos.
SENSIBILIDADE= VERDADEIRO POSITIVO 
 VERDADEIRO POSITIVO + FALSO NEGATIVO
· ESPECIFICIDADE:
· A especificidade de um teste sorológico é definida pela porcentagem de resultados negativos pelo teste na população dos não doentes, ou seja, proporção de verdadeiros negativos.
ESPECIFICIDADE= VERDADEIRO NEGATIVO 
 VERDADEIRO NEGATIVO + FALSO POSITIVO
Valor preditivo de um resultado positivo (VPP)
· É a proporção de indivíduos doentes entre os resultados positivos obtidos no teste em estudo.
VPP= VERDADEIRO POSITIVO 
 VERDADEIRO POSITIVO + FALSO POSITIVO
Valor preditivo de um resultado negativo (VPN)
· É a proporção de indivíduos não-doentes entre os resultados negativos obtidos no teste em estudo. 
VPN= VERDADEIRO NEGATIVO 
 VERDADEIRO NEGATIVO + FALSO NEGATIVO
Limiar de reatividade ou Cut Off
· A região de corte do teste sorológico, ou seja, um valor acima do qual os resultados são considerados positivos e indicam os doentes e abaixo, os resultados são dados como negativos e correspondem aos não doentes. 
Utilização dos testes sorológicos
· A maior ou menor sensibilidade e especificidade de um teste sorológico depende de qual a sua finalidade.
- Para diagnóstico - é necessário a utilização de testes mais específicos. Nestes casos, é importante que sejam evitados os testes falso-positivos.
- Para triagem em Banco de Sangue (ou outras finalidades similares) – os testes são usados com fins preventivos, ou seja, a função é prevenir a contaminação do receptor. Aqui busca-se evitar os testes falso-negativos. 
· imagine que você trabalha num banco de sangue e precisa selecionar um teste para detectar determinado antígeno. Este teste deverá ter máxima SENSIBILIDADE
· Aumentando o número de resultados FALSO-POSITIVOS
· imagine que você trabalha num laboratório de análises clínica e precisa selecionar um teste para detectar determinado antígeno. Este teste deverá ter máxima ESPECIFICIDADE
· Aumentando o número de resultados FALSO-NEGATIVO
Imunoensaios- Reagentes não marcados 
•Imunoprecipitação 
•Imunoaglutinação
•Hemólise (Fixação de Complemento)
· TÉCNICAS RÁPIDAS
•Sistema homogêneo 
•Sensibilidade reduzida
•Boa especificidade
•Baixo custo
•Dificultam automação 
•Problemas com reprodutibilidade (muitas precisões de identificação a olho nu do individuo)
•Não permite detectar anticorpo (Ac) de uma classe específica que sejam específicos para um determinado Ag – de uma só vez
Imunoprecipitação
· Primeiros testes a serem desenvolvidos
· Permite identificar precipitados resultantes da interação Ag-Ac, ambos solúveis
· Exigem alta quantidade de Ac/Ag para sua realização, tornando muitas vezes o teste pouco específico 
· Nesta técnica é necessário que a molécula antigênica seja multivalente quanto ao número de epitopo e que se tenha maior identificação possível dos epitopos de interesse
· Entre os vários fatores físico-químico e imunológicos que interferem na quantidade do imunopreciptado formando os principais são as concentrações relativas de antígeno e anticorpo
· Se temos um excesso de AC e AG, podemos observar a dissolução do precipitado de forma que o resultado não será fidedigno
· Importante observar a zona de equilíbrio, ou seja, a precipitação máxima, por ser seu resultado fidedigno
· A visualização dos precipitados em meio líquido é difícil, por conta da presença de turvação e coloração própria, por isso muitas vezes se utiliza a automação como tubometria e nefrometria
Imunodifusão
· É baseada na difusão de substâncias solúveis por movimentos moleculares ao acaso em meio gelificado/gel como agra ou gel de agarose
· Difusão de imunocomplexos (Interação Ag/Ac) realizada em meio sólido (gel de ágar).
· No momento da interação das moléculas são formados imunocomplexos de alto peso molecular, que devido ao seu tamanho ficam imobilizados no gel
· IMUNODIFUSÃO SIMPLES:
· fixa-se um dos reagentes no suporte e difunde-se o outro - complexo
· IMUNODIFUSÃO DUPLA:
· ambos movem-se = encontro – complexo pode ser linear ou radial
· IMUNODIFUSÃO RADIAL SIMPLES:
· Técnica onde se utiliza uma quantidade padronizada de AC específico incorporada ao meio gelificado, após a gelificação são feitos orifícios no ágar para se colocar o AG em volumes preciso e a amostra padrão com concentração conhecidas do AG
· A utiliza placa de vidro - mistura de ágar com solução de anticorpos específicos
· perfurações em locais apropriados do gel - as amostras + 3 concentrações conhecidas do Ag
· quantificação de [ ] em soro ou líquor
· sensibilidade de 1 a 3ug/mL de antígeno
· uso: Ig séricas, proteína C reativa (PCR) e proteínas do sistema complemento (C3, C4)
· Diâmetro do halo de precipitação formando relaciona-se com a concentração do AG, sendo que o AC já está diluído no gel
· Aumenta o diâmetro= aumento a quantidade de AG
· Leitura feita com régua própria para medir o diâmetro
· Construção de curva padrão permite determinar a concentração do AG
· Sempre necessário a amostra padrão, que sempre da positivo
· Pessoa tem que ser bem treinada para que não tenha imprecisão
· IMUNODIFUSÃO RADIAL DUPLA:
· A Ambos Ag e Ac migram no gel, formação de linhas correspondentes aos imunocomplexos
· Dois componentes AG e AC vão se difundir radialmente em todas as direções a partir de orifícios no meio gelificado, de forma que vai formar linhas ou arcos de precipitação correspondente ao imunocomplexo possíveis nessa interação
· Cada arco corresponde a um par de imunocomplexo, a uma ligação AG/AC
· Nesta técnica consegui se fazer uma comparação simultânea de diferentes sistemas, por ex :vários AG contra o mesmo AC de especificidade e reatividade conhecida, desde que a interação AG/AC tenha atingindo sua zona de equivalência
· Observa precipitação AG-AC, ligação-linhas ou aros
· Ausência de linhas indica ausência de AG ou AC
· Desvantagem: lenta e baixa sensibilidade
· Uso: vários sistemas AG (artrite reumatoide, lupos, esclerose sistêmica, caxumba)
Nefelometria 
· muito usada em laboratórios de análises clínicas
· mede a quantidade do complexo AG+AC em suspensão, através da dispersão de luz
· Segundo esse principio as reações de precipitação entre AG e AC em soluções diluídas produzem aumento da reflexão da luz que pode ser diretamente medida pela dispersão, cuja a quantidade e a natureza dependem da forma e do tamanho das partículas, da concentração, da forma e do tamanho das partículas, da concentração comprimento de onda de luz e do índice de reflexão do meio
· Ag+Ac em suspensão – dispersão de luz
· Vantagens: automatizada, fácil, rápida, precisa, com sensibilidade adequadae pequenos volumes de amostra, não necessita separação de fases
· Desvantagens: alto custo do antissoro, reações inespecíficas, múltiplas diluições de antígenos muito concentrados
· Sensibilidade - 1ug/mL
· Uso: Ig, componentes do complemento, fator reumatoide, PCR, fatores de coagulação, imunocomplexos e hormônios
· PRINCÍPIO: 
· partículas em suspensão – desvio de luz incidida dispersão de luz incidente quantificada por um detector
· Fonte de luz – lâmpadas de tungstênio, mercúrio, xenônio, hélio-neônio ou laser
· concentração - curva padrão
Turbidimetria
· Ag+Ac em suspensão – luz transmitida
· Detector - espectrofotômetro
· Vantagens: não necessita separação de fases, rápida, precisa, econômica e automatizada
· Desvantagens: não pode ser usada em amostras muito turvas Uso: Ag, Ac, lipoproteínas, PCR, albumina
Limiar de reatividade ou Cut Off
· A região de corte do teste sorológico, ou seja, um valor acima do qual os resultados são considerados positivos e indicam os doentes e abaixo, os resultados são dados como negativos e correspondem aos não doentes. 
Aglutinação
· Processo similar ao princípio de precipitação a diferença é a presença de adsorção do AG ou do AC, micropartículas insolúveis ou células, que permite leitura visual e rápida
· Formação de AG-AC ate formar agregados visuais
· Semi-quantitativa (gera número frente a capacidade de aglutinação) – 500x mais sensível que precipitação
· sensibilização de suporte – látex, hemácias
· vantagens: < custo, facilidade e rapidez
· desvantagens: reprodutibilidade, estabilidade do complexo formado e acessibilidade
· vários tipos de sistemas 
· Teste de aglutinação vai ocorrer quando acontece a formação deste agregado suficientemente grande, em função da ligação AG-AG, para que seja visível e que ocorra a identificação
· FATORES INTERFERENTES:
· Proporção AC-AG é importante e é um fator determinante para o sucesso do teste
· Ensaios utilizado proporções da zona de equivalência geram resultados falso-negativo, por não haver uma ação dos agregados de forma suficiente para que se consiga identificação
· Classe de Ac - IgM 750 vezes mais eficiente que IgG - eletrólitos
· pH (ideal entre 6,0 e 8,0)
· tempo
· temperatura
· estabilidade da ligação ao suporte (adsorção) - concentração de Ag ou Ac (falso -)
· AGLUTINAÇÃO DIRETA
· Ag presente na partícula / célula – hemácias, bactérias, protozoários e fungos
· realizado em tubo ou lâmina
· Uso: identificação de grupo sanguíneo, diagnóstico de mononucleose infecciosa, toxoplasmose, brucelose, salmonelose, leptospirose
· para a identificação de ANTÍGENOS (teste DIRETO
· Bactéria com AG na superfície, que forma uma rede de Ac, ligando a bactéria. O complexo vai aumentando e fica visível 
· Pesquisa de antígeno- tipagem sanguínea 
· INIBIÇÃO AGLUTINAÇÃO DIRETA
· AGLUTINAÇÃO INDIRETA OU PASSIVA
· Ag solúveis adsorvidos na superfície da partículas inertes
· hemácias – hemaglutinação
· outros suportes: látex, carvão, gelatina e sepharose -lâmina ou microplaca em “V” ou “U”
· Uso: diagnóstico da toxoplasmose, doença de Chagas, fator reumatóide (FR), proteína C reativa (PCR), ASLO
· HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVA
· Em vez de utilizar molécula de látex se utiliza hemácia (carneiro)
· Hemácia sensibilizada com AG e o AC se liga a hemácia e ocorre formação de complexo hemácia AG-AC, isso é colocado em uma placa, para se fazer diferentes diluição
· Se consegui quantificar o AC no soro do paciente 
· Semi-quantitativa
· INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO PASSIVA
· REAÇÃO DE MICROFLOCUÇÃO
· Variedade da aglutinação indireta
· Ocorre quando a interação direta de AC específicos com AG leva a formação de meio de imunocomplexo, no entanto em meio líquido detectamos como o auxílio de uma lupa ou microscopia óptica
· Técnica muito utilizada em laboratórios de pesquisa de doença veneria por isso a cigla VDRL (VDRL (Veneral Disease Research Laboratory)‏ ou RPR (Rapid Plasm Reagin)
· SE utiliza uma suspensão antigênica de cardiolipina, cristais de colesterol e ilesitena, preparada em saliva tamponada
· suporte: cristais de colesterol
· Ag: cardiolipina
· placas escavadas
· Uso: pesquisa de reaginas
Imunohistoquimica 
· É o método de imunohistoquímica que utiliza enzimas como substâncias propiciadoras da visualização do antígeno
· AG dentro do tecido
Métodos imunohistoquímicos
· MÉTODOS DIRETOS:
· AC primário possui o marcador 
· Simples, rápido 
· Pouca ampliação de sinal 
· AG tem que ser comum no organismo
· MÉTODO INDIRETO SIMPLES:
· AC primário 
· Anticorpo secundário possui o marcador 
· Mais sensível que o método direto, maior versatilidade, mais econômico 
· Mais demorado e complexo do que o direto 
· MÉTODO INDIRETO- Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP)
· Anticorpo primário e secundário
· Complexo Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP)
· Mais sensível, menos marcações inespecíficas mais demorado e mais complexo
· MÉTODO INDIRETO- APAAP (Alkaline phosphatase anti Alkaline phosphatase) 
· Método semelhante ao PAP, mas que utiliza como marcador a fosfatase alcalina 
· em vez da peroxidase 
· Imunocitoquimica (eritrocitos) 
· METODO DE POLIMERO
· Técnica mais sensível e permite detectar a quantidade mínima do antígeno 
· Simples e rápida execução 
· Reprodutibilidade 
· Facilidade da padronização 
· Polímero de esqueleto interno 
· Esqueleto central que estão acoplados anticorpos secundários (20) e moléculas 
· propiciadoras da visualização (100 moléculas) (Ex: HRP) 
· Moléculas utilizada para a formação do esqueleto é dextrano (polissacarídeo hidrofílico) 
 
Reagentes
· Fixação 
· Preservação 
· Estabilização 
· Proteção
· Cuidado em material e reagentes
· Diluição do AC
· Testar diluição diferentes
· Pipetagem
· Tempo e temperatura de incubação (37)
· Higiene e segurança do laboratório
· Baixo AC- não se consegui ver a reação, sem cor suficiente
· Aumento AC- podem ficar resíduos na sua imunohistoquimica que atrabalha de ver a molécula
Preparação de amostra
· Fixação costuma ser feito em formadelido, antes de por o tecido em parafino
· Fixação do tecido em parafina ou cortes congelados
· Preservação- cortes congelados tomar cuidado com temperatura
· Estabilização
· Proteção
· Formaldeído:
· Econômico, mais utilizado, penetra nos tecidos 
· Pontes de metileno entre os aminoácidos de várias proteínas 
· Mascarar antígenos 
· Algumas alterações estruturais nas biomoleculas, principalmente nas proteínas 
· Recuperação antigênica 
· O tempo de espera entre colheita de material e fixam, pH, temperatura, tamanho dos fragmentos para fixar 
· Criostato
· Fixação para cortes de criostato
· Maior preservação dos tecidos
· Fixadores: álcool, acetona 
Microtamia 
· Após a fixação para tecidos nas parafinas, se utiliza o microtono, que irá cortar pedaços finos
· Cortes finos, sem pregas ou estrias
· HE (hemotoquicilina eusina) e HQ (himunohistoquimica) 
Recuperação antigenica
· Cortes parafinados 
· Digestão enzimatica proteoliica 
· Recuperação antigênica de origem térmica por alta temperatura 
· Forno de micro-ondas, panela de pressão, banho de água quente e vapor quente 
Imunoensaios- Reagentes marcados 
•ELISA
•Imunofluorescencia
•citrometria de fluxo
• Western Blotting
· Através dessas técnicas se consegui fazer detecção de proteína, identificação de presença de anticorpo, detecção de proteína no soro e tecido, determinação de população celulares, antígenos na superfície da célula e intracelular
Imunoensaios utilizando conjugados
· Conjugados: duas substâncias ligadas covalentemente e que mantêm suas propriedades funcionais
· Moléculas conjugadas:
· Antígeno- derivados de patógenos, hormônios, marcadores celulares ou tumorais; 
· Imunoglobulinas- monoclonais ou policlonais; 
· haptenos; 
· tanto antígeno e anticorpo são marcados com uma enzima, para que seja emitida uma luz, para que ocorra a identificação da reação
Imunoensaios ensaios imunoenzimaticos- IES
· Observa a medida da interação AG-AC por medida da atividade enzimática sobre a substrato
· Enzimas utilizadas: peroxidade e fosfatase alcalina
EX: Ex: Enzyme-linked Immunosorbent Assay– ELISA
1. Imobilização de um componente (antígeno ou anticorpo) em fase sólida;
2. Utiliza conjugado: antígeno ou anticorpo ligado a uma enzima, preservando a atividade enzimática e imunológica dessas moléculas;
3. Substrato: formando um produto colorido sendo possível monitorar visualmente ou por espectrofotômetro estas variações;
ELISA
· Princípio do teste: Imobilização de Ag ou Ac em fase sólida e utilização de um conjugado (Ag ou Ac) ligado à uma enzima, com preservação da atividade enzimática e imunológica
· Se coloca a placa no espectrofotômetro e uma curva é gerada, que é comparada a curva padrão
· Tipos de ELISA:
- Direto => Antígeno;
- Indireto => Anticorpo;
· DIRETO- antígeno (identificação direta do antígeno)
· INDIRETO- anticorpo (quando se utiliza o anticorpo para se identificar antígeno)
· Sanduiche- queremos identificar anticorpo específico para antígeno ou identificar a própria medição do antígeno. Muito utilizado para dosagem de citosina)
· COMPETIÇÃO- teste no qual o AG a ser detectado na amostra compete com AG radio marcado, por sítios combinatórios na fase solida
-Concentração da molécula antigênica na amostra é inversamente proporcional a leitura de radioatividade
-Aumenta cor = abaixa a quantidade de AG
Vantagem e desvantagem
· Sensibilidade, especificidade e simplicidade da técnica;
· Cuidados com interferentes, reações cruzadas
· Versatilidade, rapidez, baixo custo e objetividade da leitura;
· Erros operacionais, variáveis analíticas
· Adaptação a diferentes graus de automação
· Instabilidade dos reagentes
· Influência em manipulações e do equipamento
Tipos de substratos 
· Substratos: Cromogênicos, Fluorigênicos, Quimiluminescente
· Substratos Fluorigênicos: O substrato, após ação enzimática, forma composto que emite luz
· fluorescente (fluoróforo) que é detectada por um fluorímetro.
· ▪ Substratos Quimiluminescentes: para ensaios imunoenzimáticos que necessitem amplificação do sinal (determinação de hormônios, marcadores tumorais), uso de quimiluminescência como sinal detectável por um luminômetro.
· Substratos Cromogênicos: Sob ação enzimática originam produtos coloridos 􏰀 quantificação por medida da DO em espectrofotômetro. Ex substrato da peroxidase = H2O2
· H2O2 pode ser empregada com diversos cromógenos 
Ex: Orto-fenilenodiamina – OPD
Tetrametilbenzidina – TMB
Immunoblot (IMMUNOBLOTTING OU WERSTERN BLOTTING)
· Técnica que permite caracterização de fração antigênicas e imuno dominante, se consegui identificar antigênico na amostra de estudo, consigo identificar mais de um antígeno no mesmo teste, especificidade de anticorpo, que caracteriza determinada fase da infecção ou do tratamento
· Quantificação do antigeno- ELISA
· Qualitativa- Immunobot
· É realizado através da eletroforese em gel (gel de poliglinamda), ocorre um eletro transferência para membrana de nitrocelulose depois da separação das proteínas no gel, dai é feito uma reação imunoenzimatica, para se fazer a detecção e coloração do antígeno de escolha
Eletroforese em gel (SDS_PAGE) 
· Técnica que permite que ocorra a separação de partículas através da eletroforese, ou seja da eletricidade que vai ser empregada pelas partículas proteicas, do antígeno
· O gel de poliacrilamida (PAGE) utiliza o dodecil sulfato de sódio (SDS) que confere carga negativa a todas as proteínas facilitando separação por peso molecular 
· Amostra: as proteínas devem estar solubilizadas e desnaturadas (tratamento com agentes dissociantes, detergentes e calor) 
· Corante: comassie blue para facilitar a identificação das proteínas 
· Separação depende também do tamanho dos poros do gel, temos diferentes concentrações de acrilamida do gel
· Proteínas de maior tamanho migram com maior velocidade, que as de tamanho maior 
· Maior poliacrilamida= maior peso molecular da proteína
1. Migração de partículas em um determinado gel (peneira molecular)
2. Molécula de proteína + moléculas do detergente SDS (duodecil sulfato de sódio) carregado negativamente;
3. Migração do Ag em direção ao pólo positivo 
4. As moléculas são separadas de acordo com o peso molecular:
Menor massa => migram mais rapidamente; Maior massa => migram mais devagar;
5. Comparação com padrão: uma vez separadas por tamanho, a posição das proteínas é definida por comparação à migração de um padrão de moléculas de tamanho conhecido
· Substratos: Cromogênicos, Fluorigênicos, Quimiluminescente
· Identifica e caracteriza antígenos previamente desconhecidos, presentes numa mistura complexa
· Princípio do teste: transferência da proteína do gel de eletroforese para uma membrana de nitrocelulose => para estudos imunológicos;
· Filtro de papel embebido em tampão, e colocamos o gel com estremo cuidado, colocamos uma membrana de nitrocelulose
· Os antígenos são separados em gel de poliacrilamida (em geral contendo SDS, e em presença de 2-mercaptoetanol; sistema desnaturante) e transferidos para um papel especial (papel tipo nitrocelulose).
· O “Western Blotting” é muito utilizado para confirmação de testes sorológicos de triagem, como o “ELISA” (por exemplo, um teste positivo para HIV).
· O resultado deste teste é obtido após realização de reação imunoenzimática no referido papel, utilizando-se anticorpos heterólogos conjugados a enzimas contra anticorpos do sistema a analisar, por exemplo, anti-IgG conjugados com enzima e o complexo Ag-Ac pode ser detectado por adição do substrato e do cromógeno.
Imunofluorescência (IFA)
· Detecção de antígeno ou anticorpo
· Geralmente é realizado em lâmina (fragmento de tecido), placa de cultura (cultura celular)
· Princípio do teste: anticorpo conjugado a uma substância que emite luz – fluorescência e ficoerittina
· Tipos:
· Direto: detecção de antígenos ou receptores celulares
-Detecção direta de microrganismo em secreções na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. também é utilizado no fenotipagem de células tumorais
· Indireto: detecção do anticorpo
-Diagnostico sorológico de várias doenças de chagas e AIDS, as hepatites e imunocomplexos em doença autoimune
· Vantagem do método:
· Aumento de 10 a 1000X na sensibilidade
· Grande aumento na rapidez de detecção
· Desvantagem do método:
· Necessidade de microscopia
· Subjetividade de leitura
· Impossibilidade de automação
· Autofluorescência de algumas proteínas do soro (falso positivo) -aumento a emissão da luz modificado o resultado
· Fotodestrição
· É uma técnica onde se consegui alta sensibilidade (fluorescência é mais intensa) e especificidade
Citrometria de fluxo
· Identificação de vários tipos de antígenos, seja eles fixos ou na superfície da célula (CD4 e CD3), antígeno solúveis como citocinas, imunoglobulinas e determinadas proteínas
· Na técnica ocorre a separação de células marcadas por fluorescência
· Anticorpo são dirigidos contra moléculas de membrana ou antígeno dos conjuntos de diferenciação (CD) – CD18, CD4, CD125, CD147, CD8
· Casa AC é marcada como uma fluorocromo diferente
· Teste quantitativo e qualitativo
· As células são incubadas com anticorpo fluorescentes específicos para estruturas de superfície
· Os anticorpos fluorescentes aderem especialmente á superfície da célula
· Os anticorpos que não interagem com as estruturas de superfície são eliminados por lavagens sucessivas (3-4)
· Então essa solução celular é passada no aparelho chamado citrometro de fluxo, que irá ler 1 em 1 célula, e ira absorver a luminosidade que essa célula ira emitir, quando o laser incendi 
· Aplicação:
· Determinar o tipo e número de células sanguíneas brancas
· Isolar populações celulares
· Distribuição de células de acordo com a densidade dos AG
· O tamanho celular
· Uso de múltiplos anticorpos fluorescentes – HIV, leucemia
· Metodologia:
· Só por tamanho e granulosidade se consegui identificar a população de linfócitos (menores e menos granulosos) monócitos (médio) e granulocitos (grandes e muito granulosos)
· Depois se escolhe a população de células que se quer estudar e se faz uma marcação para CD
Imunoensaios- infecções bacterianas
· Padrão ouro- isolamento da cepa bacteriana,com o objetivo de realizar o antibiograma
· Antibiograma- identificar a bactéria para se utilizar o antibiótico adequado
· Dificuldades:
· Dificuldade e tempo de cultura
· Genoma bacteriana- microarray
· Identificação de grupos- prova da catalase
Muitas vezes não fecha diagnostico adequado para a identificação da bactéria especifica
Aplicação de imunoensaios
· Se usa a metodologia imunoenzimatica de captura 
· Tem elevada sensibilidade
· Realizado com exsudados do paciente (soro, muco, LCR)
· Tem como objetivo identificação da cepa (antígeno)- desenvolvimento de vacinas
· Através das técnicas foram identificados anticorpos específicos capazes de neutralizar toxinas, e em cima desse conhecimento ouve o desenvolvimento de várias vacinas especificas
EX: Tetano e Difteria
Sifilis
· Agente etiologivo= Treponema pallidum
· Caráter cosmopolita- mais comum nos grandes centros
· Elevada virulência
· Transmissão sexual
· Forma congênita grave, se pega durante a gestação
· Apresenta evolução crônica
Imunopatologia
· Se observa intensa reação inflamatória, com a possibilidade de formação de granulomas
· Lesão do tipo hipersensibilidade tardei granulomatosa
· O sistema imunológico tenta encapsular o microrganismo, já que ele não conseguiu matar efetivamente todas os microrganismos, formando o granuloma
· Porem o microrganismo tem mecanismo de escape, realizando a invasão dos tecidos, nesses momentos é fácil isolar e identificar
· No exsudado coletado se realiza a microscopia de canto escuro, que apresenta uma sensibilidade de 95%
Diagnostico
· Detecção dos anticorpos da sífilis como método de escolha para o diagnostico
· É possível dividir os imunoensaios da sífilis de acordo com alguns antígenos empregados, em testes que são denominados cardiolipinas e treponemicos
· Antígeno cardiolipinas, faz parte do teste chamado VDRL
· VDRL- teste característico para sífilis, onde é realizado uma floculação, na presença de anticorpos anti-cardiolipina ocorre uma aglutinação da cardiolipina, chamado de floculação, por não existir uma partícula do teste. Os cristais de colesteróis, aos quais a cardiolipina está dissolvida, se agregam formando microfloculos, visíveis com auxílio de lupa ou microscópio
· Método simples. Barato, no entanto deve ser realizado com o máximo vigor, técnica, para que não aconteça diagnostico errado
Testes treponêmicos
· Outra forma para diagnosticar a sífilis
· O teste utiliza antígenos do T. pallidium de difícil obtenção (antígeno com maior especificidade e sensibilidade ao teste)
· Cisto elevado
· Alta sensibilidade e especificidade
· Testes de imunofluorescencia indireta, usa a bactéria integra como antígeno, fácil de se fazer
· ELISA
· Microscópio de campo escuro
· Teste FTA-ABS
· Teste cromatográfico, onde se utiliza o antígeno do T. pallidium e se detecta anticorpos específicos para o patógeno
· Teste treponemico- utiliza antígeno
· FTA-ABS + VDRL 
Virus
HIV
· HIV-1 (mais predominante) e HIV-2 (mais na África)
· Pertencem ao gênero Lentivírus, família retroviridae
· Material genético sobre a forma de RNA
· Responsáveis pela AIDS/ SIDA (iminodeficiencia adquirida)
· SIDA – fase final da infecção com manifestações clínicas graves
· Entre o contágio ao estado grave de SIDA, demora um tempo que pode variar de meses a anos, dependendo do hospedeiro
· HIV tem tropismo pelo linfócito TCD4, pois ele se liga ao receptor CD4 do linfócito
· HIV consegui jogar suas proteínas virais e seu RNA no interior do linfócito
· Linfócito começa a produzir copias virais, e esse vírus começa a ser montado dentro do linfócito, o vírus sai da célula por brotamento, podendo ocorrer lise da célula, acarretando diminuição de linfócito TCD4
· Também pode se utilizar co-receptor como CCPS/CXCR4 que está no linfócito
· HIV também é capaz de infectar monócito, células dentridicas e enterocito
preteinas antigênicas do vírus
· Na superfície temos uma glicoproteína GP120 ou ENVI
· GP41- glicoproteína transmembrana
· P17 ou GAG- na parte interna, na matriz
· P24- capsídeo
· Proteínas, enzimas importantes que vírus utiliza para a replicação como algumas proteínas, transcriptase reversa e a integrasse
HIV resposta imune
· O HIV apresenta rápida mutação e recombinação, tem grande variabilidade genômica, por isso se tem uma grande dificuldade para se desenvolver uma vacina
· Se é uma infecção sexual, por mucosa o HIV começa primeiramente a invadir a células do tecido linfoide associado a mucosa, boca e intestino e se tem a migração para o linfonodo a onde ocorre uma maior contaminação e ele chega na coerente sanguínea 
1. Infectadas células do MALT
2. Linfoides – sangue
· Existe uma Janela imunológica, ate o individuo se infectar ate ter resposta imunológica- alta carga virulência 
· Temos uma queda significava de linfócito TCD4 e um aumento da quantidade de vírus HIV
· Fase adies ou SIDA temos uma queda drástica de linfócito TCD4 e infecções oportunistas começa a acontecer
Diagnostico
· ELISA indireto – Detecção de IgM (doença na fase aguda) e IgG (doença crônica)
· Testes rápidos – Imunocromatografia 
· Western blotting – altamente específico (confirmação de diagnostico)
· PCR e RT-PCR – Detecção do RNA viral
Hepatite
· HEPATITE A
· Muito comum em países em desenvolvimentos, transmissão é fecal oral
· Diagnosticado das hepatites em geral é realizado através da sorologia, para identificação de anticorpo ou moleculares como PCR 9reação de cadeia polimerase) ou RTPCR (que é em tempo real)
· antígeno no caso da hepatite A é o HAV Ag, é uma hepatite que possui vacina, que não possui forma crônica, ocorre principalmente na infância e pode ter característica assintomática
· Fígado na hepatite geral ocorre um tipo intenso de infiltrado, onde é absorvido que ocorre dentro do tecido hepático, uma reação inflamatória significativa
· HEPATITE B
· Em seu genoma te DNA
· Transmissão é parenteral (contato com sangue do individuo infectado) e sexual
· Incubação 30-180 dias
· Existem vários antígenos conhecido: 
-HBsAg – temos antígeno de superfície 
- HBcAg – temos antígeno de cor
 - HBeAg – temos antígeno de cor
· Diagnostico diferencial vai ser realizado através da sorologia e da identificação dos antígenos e dos anticorpos referentes a proteínas virais conhecidas
· Pode apresentar uma forma crônica e ela pode estar associada á cirrose hepática ou ao câncer hepático
· Existe vacina
· Vírus encapsulado- capsula lipídica que confere alta viabilidade do vírus ao meio ambiente
· Possui uma serie de antígenos importante quando se irá fazer o diagnostico clínico, identificar que momento o paciente se encontra e os anticorpos
· Primeiro se identificado na fase aguda será o DNA do HBV, sérica de 3 semanas após a infecção, a gente identifica através de técnicas moleculares como PCR e RTPCR que são extremamente sensíveis e podem detectar a presença do vírus ainda com poucas copias virais 
· Na fase aguda o primeiro antígeno a ser quantificado no soro vai ser de superfície HBsAg e HBeAg, antígeno característico de multiplicação viral
· Primeiro a se identificar o antígeno no sangue e depois se identifica os anticorpos anti-esses antígenos
· Crônica
· Temos a identificação ainda do antígeno anti-BGeAg, que é característica de multiplicação viral, vão ter um bom prognostico quando acontece a identificação desse antígeno
· E temos a identificação dos anticorpos anti-HBIgM, anti-HBCIgG e o antígeno anti-HBSAg no soro do paciente, técnica
· Lembrando então quando a gente fala em identificação de antígeno e de anticorpo a técnica mais utilizada é o ELISA
· HEPATITE C
· Flavivirus, seu genoma tem presença de RNA
· Transmissão parenteral e esporádica
· Incubação de 15-150 dias, seu antígeno é o HCVAG
· Ë um dos maiores problemas de saúde publica no mundo, pois não temos vacina, não tem imunização passiva e nem terapias eficazes
· Não apresenta imunidade cruzada entre os diferentes genótipos dos outros vírus da hepatite
· É um vírus que se replica preferencialmente nos hospedeiros
· Apresenta considerado diversidade genômica
· É umvírus mutante, com alta taxa de mutação
· Principal causa do transplante hepático, em pacientes com falência hepática
· Apresenta forma crônica e não tem vacina
· ELISA e PCR
· Infecção autoimune
· HEPATITE D
· Genoma apresenta RNA
· A sua transmissão é parenteral e sexual
· Pode ser co-transmitida junto com a hepatite B, vírus híbrido, individuo pode ter infecção dupla, podendo virar de uma simples alteração de enzimas hepáticas, ate uma hepatite fulminante
· Em geral o curso clínico da hepatite D aguda é mais grave que a infecção apenas da hepatite B
· Quando se tem os dois vírus juntos em geral é mais grave, observando hepatite fulminante em 5% dos casos 
· Os antígenos são HDVAg
· Diagnostico é feito também com sorologia a presença de IbM anti-HDV 
· ELISA ou PCR
· Possui forma crônica e se existe vacina
· Se utiliza PCR e biotaime- testes quantitativos, podem ser uteis no monitoramento da virulemia 
· HEPATITE E
· Vírus com genoma de RNA
· Transmissão fecal-oral
· antígeno então é o antígeno HEVag
· Diagnostico em cima dos anticorpos no caso IgM e anti-VEE
· Não tem forma crônica e não tem vacina 
· Hepatite autolimitada
· HEPATITE G
· Sabe que existe mais não tem muitas informações
· Genoma RNA
· Transmissão parenteral
· antígeno é o HGV Ag
· Diagnostico é feito através do PCR ou do biotaime
· Não se tem vacina
· Aparentemente se tem forma crônica, porem não é confirmado