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TRANSPORTE ATRAVÉS DE MEMBRANAS O meio intracelular é constituído por vários microambientes cuja composição molecular, iônica e osmótica é mantida relativamente constante. Além disso, o ambiente intracelular como um todo também difere do meio extracelular sendo capaz de se manter em equilíbrio mesmo quando este último sofre flutuações. Além de funcionar como fronteira entre o meio intracelular e o meio externo, a membrana plasmática desempenha uma série de outras funções: adesão e reconhecimento, sítio de atividades enzimáticas e transporte de substâncias. O transporte de substâncias pode ser dividido em três categorias: 1. Transporte celular - consiste na troca de moléculas ou íons entre o meio intracelular e extracelular. O exemplo clássico deste tipo de transporte é observado no epitélio intestinal. Nestas células a superfície de absorção é aumentada milhares de vezes devido à existência de evaginações da membrana, chamada de microvilosidades, ao nível das quais ocorre a absorção de moléculas como glicose e de íons como o sódio, vindos da luz intestinal para o interior das células de revestimento. 2. Transporte intracelular – neste caso o fluxo de íons e moléculas ocorre através das membranas das organelas intracelulares, como por exemplo, o fluxo de íons através do envoltório nuclear, da membrana mitocondrial, etc. Transporte de moléculas da luz intestinal parao interior da célula. Observe que a glicose é transporta junto com o sáodio (sistema simporte), atravessam a célula e saem pelo lado basal: a glicose é transportada por difusão facilitada, graças a uma proteína carreadora. O sódio sai por troca com o potássio, com gasto de energia (ATP), transporte ativo. 3. Transporte transcelular – nesta última categoria, as substâncias são absorvidas em uma face da célula, atravessam o seu interior e são transportadas para outro compartimento, pela outra extremidade. A absorção de moléculas na luz do intestino delgado, sua passagem através do citoplasma do epitélio intestinal e sua saída na face basal da célula em direção ao sangue ilustram claramente esta tipo de transporte. (Fig.1). Na transcitose, o material atravessa a célula, onde é modificado, e é transferido para a região basal, onde é exocitado. Ocorre principalmente nas células intestinais. PERMEABILIDADE DE UMA BICAMADA LIPIDÍCA Por ser constituída, em grande parte, por uma bicamada lipídica cuja porção média é apolar e hidrofóbica, a membrana plasmática forma uma barreira impermeável à maioria das moléculas polares, dificultando assim que a célula perca para o meio ambiente íons e outras moléculas hidrossolúveis. Entretanto, a troca seletiva de moléculas entre a célula e o meio extracelular é uma atividade essencial à vida. Toda célula precisa ingerir, secretar e/ou excretar moléculas e íons para o meio extracelular, o que significa TRANSPORTAR estas moléculas e íons através da membrana. Esta atividade leva a diferença entre a composição iônica e molecular do citosol (citoplasma) e do meio extracelular que permite às membranas armazenar energia potencial na forma de gradientes iônicos. DIFUSÃO SIMPLES OU OSMOSE Se um pesquisador produzir em laboratório uma membrana artificial constituída apenas por lipídios (lipossomas), poderá observar que a velocidade de difusão de diferentes solutos através da mesma obedece a certas regras. Assim, quanto mais solúvel em óleo (hidrofóbica) uma molécula for, mais rápida será sua difusão através da bicamada lipídica. Esta difusão se processará segundo o gradiente de concentração da molécula em questão. Esta passará do lado em que sua concentração for menor, até que sejam atingidas concentrações iguais dos dois lados da membrana. Membrana artificial – lipossoma- é muito útil para testes de transporte através das membranas. Além do gradiente de concentração a difusão simples de uma molécula através da bicamada lipídica também depende dos seguintes fatores: 1 – O tamanho da molécula: moléculas pequenas atravessarão a membrana com mais facilidade. 2 – A polaridade da molécula: moléculas apolares (hidrofóbicas) atravessarão com mais facilidade a membrana do que moléculas polares. 3 – A carga da molécula: moléculas não carregadas também atravessarão com mais facilidade a membrana. Se duas soluções posseum o mesmo potencial osmótico, são isosmóticas. Se uma solução possui muita concentração de moléculas em relação ao solvente, é considerada hiperosmótica. Ao contrário é hiposmótica. Observe no esquema que moléculas pequenas e sem carga como a água, álcool, gliceroal e gases passam livremente pelas membranas, enquanto que moléculas grande como a glicose, aminoácidos e íons não atravessam livremente e assim têm que usar trasnportadores A permeabilidade de uma bicamada lipídica a uma determinada molécula ou íon depende da combinação de três fatores. Na figura 2 estão representadas as velocidades de difusão de vários solutos em ordem decrescente. Observamos que as moléculas que mais rápida e facilmente atravessavam a bicamada lipídica são as pequenas, hidrofóbicas e não carregadas, como o O2 e o N2 e o benzeno. Porém moléculas polares como a água, a uréia, o glicerol e o CO2 também se difundem rapidamente pois, são pequenas e não carregadas. Já moléculas grandes e polares como a glicose e a sacarose praticamente não se difundem através da bicamada mesmo não sendo carregadas assim como os íons Na+, K+, HCO3 -, Ca+2 , Cl- e Mg+2 que, embora pequenos têm seu diâmetro muito aumentado devido a formação da camada de hidratação ao seu redor. Tendemos a considerar a água como sempre sendo um solvente de uma solução, entretanto quanto mais concretrada for uma solução de glicose ou Experimentos realizados em mebranas artificiais mostraram passagem para moléculas hidrofóbicas e aquelas de tamanho pequeno e sem carga. Para moléculas grandes, sem carga, e íons houve rejeição. sacarose em água, menor será a concentração da água nesta solução (reflita um pouco antes de prosseguir na leitura do texto). Agora, se considerarmos uma membrana semi-permeável, isto é, permeável a água, mas não às substâncias nela dissolvidas, veremos que o princípio também se aplica à difusão simples das moléculas de água, que tenderão a passar do compartimento onde estão em maior concentração (soluto mais diluído) para o compartimento onde existirem em menor número (soluto mais concentrado). Este fluxo passivo de água entre dois compartimentos é chamado de OSMOSE. O experimento clássico para demonstrar esta propriedade consiste em observar a reação de uma célula vegetal ou de um eritrócito (hemácia) em soluções de sacarose em concentrações variáveis (Fig 3). Assim, numa solução 0,5M de sacarose as células perderão água para o meio e portanto, murcharão. Já a 0,25M a quantidade de água que sai da célula é semelhante a que entra, assim as células manterão sua forma e volume normais. Se a concentração de sacarose no meio externo for menor do que no meio intracelular a água penetrará através da membrana celular e o volume da célula será aumentado. Colocado em água pura, a hemácia se romperá, enquanto a célula vegetal atingirá o máximo do seu turgor, mas será contida pela parede celular. (Fig.3) Hemácias submetidas a meios com diferentes concentrações iônicas. Em meio hipertônico a célula enruga e fica crenada, enquanto que em meio muito hipotônico a hemácia incha e até pode se romper (lise). PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS Se as membranas fossemapenas constituídas por bicamadas lipídicas, a passagem de uma molécula para dentro ou para fora de célula dependeria apenas de sua solubilidade em lipídeos. Entretanto, sabemos que as membranas naturais também possuem proteínas inseridas na sua matriz lipídica. As proteínas presentes na membrana plasmática podem ser envolvidas em processos de adesão e comunicação intercelular, podem ser enzimas que participam de vias metabólicas localizadas nas membranas ou podem estar relacionadas com o fluxo de substâncias para dentro e para fora da célula. Essas últimas são chamadas de proteínas TRANSPORTADORAS. As proteínas transportadoras se caracterizam sempre por: 1- Serem especializadas em mediar o transporte de um tipo ou classe restrita de soluto (aminoácidos, açúcares, íons, etc). 2- Serem sempre proteínas do tipo multipass, isto é, sua cadeia de aminoácidos atravessa várias vezes a bicamada lipídica (Fig. 4), formando um ambiente hidrofílico que permite a substância transportada passar pela membrana sem entrar em contato com sua porção hidrofóbica. (Fig.4) As proteínas transportadoras podem ser de dois tipos (Fig. 5): Proteína do tipo “multipass”. Note que a proteína atravessa várias vezes a bicapa lipídica. 1- Podem formar um poro hidrofílico através da bicamada lipídica, sendo então chamadas de canais. 2- Podem ligar-se a um soluto a ser transportado de modo específico, assim como uma enzima ao seu substrato, mudando de conformação e permitindo a passagem deste (o soluto) através da membrana. Neste caso são chamadas carreadoras. O transporte de moléculas e íons através da membrana pode ou não requerer dispêndio de energia (ATP) por parte da célula. No caso de soluto ser transportado sem gasto energético, dizemos que o transporte é PASSIVO. Já, quando a célula gasta energia para transportar um dado soluto, o transporte é dito ATIVO. Na figura 6, encontram-se esquematizadas as principais características de cada um dos tipos de transporte. (Fig. 6) TRANSPORTE PASSIVO OU DIFUSÃO FACILITADA Todas as proteínas do tipo canal e muitas das proteínas carreadoras permitem a passagem de solutos apenas de forma passiva, chamando-se o processo de transporte passivo ou difusão facilitada. Neste tipo de transporte o deslocamento do soluto se faz do compartimento onde ele esteja mais concentrado para aquele em que esteja menos concentrado. Entretanto, no caso de se tratar de uma molécula carregada ou de um íon, não apenas o gradiente de concentração determinará o sentido do fluxo. A diferença de potencial entre os dois lados da membrana (potencial de membrana) também influirá no deslocamento da molécula. Estes dois fatores (gradiente de concentração e potencial de membrana) considerados em conjunto formam o gradiente eletroquímico de cada soluto. Todas as membranas (inclusive as intracelulares) possuem uma distribuição de cargas que é diferente entre o seu lado intercelular e seu lado extracelular, sendo que, em repouso, o lado citoplasmático é negativo em relação ao exterior. Existem quatro diferenças entre a difusão simples e a difusão facilitada: 1 – A primeira se refere à velocidade do deslocamento que é muitas vezes maior na difusão facilitada do que na osmose ou na difusão simples. Entretanto, o resultado final em ambos os sistemas é semelhante. 2 – A segunda diz respeito à cinética de movimentação do soluto. Enquanto na osmose a velocidade de deslocamento da molécula é ditada apenas pela diferença de concentração da mesma nos dois lados da membrana, na difusão facilitada o transporte pode atingir um ponto de saturação, quando todos os receptores específicos para aquela molécula estiverem ocupados. A partir deste ponto, o aumento na concentração do soluto não alterará a velocidade do transporte (Fig. 7). (Fig. 7) 3 – Ao contrário da difusão simples, onde moléculas estruturalmente semelhantes se difundem através da membrana com velocidades semelhantes, na difusão facilitada há uma grande seletividade. O transportador para glicose não permite a passagem de outras hexoses, como a frutose. Pentoses, açúcares cuja cadeia possui 5 carbonos, também não são transportadas por difusão facilitada, o que indica que a seleção não é feita pelo tamanho da molécula. 4 – A última diferença entre os dois tipos de transporte é sua susceptibilidade a inibidores competitivos e não competitivos. Moléculas semelhantes ao soluto não serão transportadas, mas inibirão competitivamente o transporte das moléculas específicas. Este tipo de inibição não é observado na difusão simples e é mais uma semelhança entre as propriedades dos transportadores passivos e as enzimas. As proteínas carreadoras podem atuar de três formas (Fig. 8): 1 – Uniporte: Quando carreiam apenas uma espécie química. A glicose que as células absorvem do meio extracelular é transportada num sistema deste tipo. Como no citoplasma a glicose é utilizada na glicólise ou armazenada na forma de glicogênio, sua concentração intracelular é sempre menor que a extracelular, criando assim um gradiente de concentração que favorece sua entrada na célula. 2 – Simporte: Quando duas espécies químicas são transportadas simultaneamente no mesmo sentido. A absorção de glicose pelas células do epitélio intestinal é feita concomitantemente com o sódio. Como a concentração intracelular de sódio é muito pequena (devido à atividade da bomba de sódio e potássio), o transporte se faz preferencialmente da luz intestinal para o meio intracelular e não no sentido oposto. 3 – Antiporte: Neste caso, duas moléculas diferentes também são transportadas simultaneamente, mas em sentidos opostos. A proteína Banda 3 da membrana dos eritrócitos atua desta maneira, permitindo que o CO2 transportado pela hemácia na forma de íon bicarbonato (HCO3-) seja trocado, ao nível dos alvéolos pulmonares por Cl- é um bom exemplo deste tipo de transporte. A manutenção do pH intracelular também é feita por um sistema antiporte: toda vez que a concentração de íons H+ aumenta muito, levando o pH intracelular a baixar, entra em funcionamento um trocador de Na+ -H+ que expulsa o excesso de H+ da célula trocando-o por Na+. O excesso de Na+ será eliminado através da Bomba de Na+-K . Já nas proteínas do tipo canal funcionam basicamente como poros hidrofílicos. A grande maioria delas está relacionada com o transporte de moléculas carregadas, principalmente íons. Por isto mesmo são geralmente chamadas de canais iônicos. Na figura 9, encontra-se esquematizado um canal iônico em dois estados – aberto e fechado. A abertura de um canal pode ser promovida por dois mecanismos: 1 – Alterações de voltagem (polaridade) da membrana. 2 – Substâncias químicas específicas. (Fig. 9) Na condução e transmissão do estímulo nervoso a uma célula muscular participam canais de dois tipos. O sinal nervoso induz uma despolarização da membrana que abre canais iônicos ao longo da membrana do neurônio. No botão sináptico este sinal leva à liberação da acetilcolina, neurotransmissor que abre canais na membrana da célula muscular, provocando sua despolarização. Este processo será analisado com maiores detalhes em outro texto. Concluindo, caso um canal transmembrana esteja aberto ocorrerá o fluxo passivo de seu soluto específico segundo seu gradiente de potencial eletroquímico. Caso este canal esteja no seu estado fechadoeste soluto só atravessará a membrana por um sistema simporte ou por transporte ativo. TRANSPORTE ATIVO Tanto na osmose quanto na difusão facilitada o transporte ocorre porque o soluto transportado está sendo preferencialmente consumido de um dos lados da membrana, justamente o que acontece com a glicose, que está sempre sendo consumida ou armazenada na forma de glicogênio no citoplasma. Entretanto, a concentração iônica dentro e fora das células é bem diferente e esta diferença é mantida por um outro tipo de transporte, o transporte ativo. Neste o transporte de um determinado soluto se faz no sentido oposto ao seu gradiente de potencial eletroquímico, requerendo dispêndio de energia por parte da célula. O transporte ativo sempre é mediado por uma proteína do tipo carreadora. A concentração de Na+ no meio extracelular é cerca de 20 vezes maior do que no citoplasma. Por outro lado, o inverso acontece com o K+. Entretanto a concentração total de cátions é maior no meio extracelular do que no meio intracelular. A manutenção desta diferença de cargas entre o meio interno e o meio externo é crucial para a célula, mantendo seu equilíbrio osmótico e é feita com dispêndio de energia. Assim dizemos que o lado citoplasmático da manutenção desta distribuição iônica é feita com dispêndio de energia por um sistema do tipo antiporte: a Bomba de Na+/K+. A presença de uma ATPase dependente de Na+ e K+ na membrana celular levou os pesquisadores a pensar que esta enzima estivesse envolvida no processo de troca de sódio por potássio que ocorre através das membranas celulares de todas as células. A demonstração de que a substância ouabaína inibe tanto a bomba quando a ATPase contribuiu para a confirmação desta suspeita. Além disto foi identificado o sítio de ligação desta droga à ATPase, sendo demonstrada sua afinidade pelo sítio do K+ que se encontra voltado para o lado extracelular. Também foi demonstrado que para cada 3 íons Na+ que saem da célula, 2 íons K+ são internalizados. Durante o processo 1 molécula de ATP é hidrolisada a ADP+Pi. A bomba de Na+-K+ consome cerca de 1/3 do requerimento total de energia de uma célula animal típica e, no caso de células excitáveis como os neurônios que a cada ciclo de despolarização da membrana tem seu citoplasma invadido por íons Na+ este consumo pode chegar a 2/3 do total (Fig. 10). A Na+-K+ ATPase já foi isolada e caracterizada como sendo uma proteína transmembrana de cerca de 1000 aminoácidos associada a uma pequena glicoproteína. Na subunidade maior estão localizados os sítios de ligação para o Na+ e o ATP na fase citoplasmática e o sítio para K+ (ouabaína) na superfície externa. Quando inserida em membranas artificialmente construídas, pode-se reconstruir uma bomba funcional e demonstrar algumas características surpreendentes desta ATPase. Quando os gradientes de Na+ e K+ são artificialmente aumentados de modo que a concentração de Na+ fora e K+ dentro da membrana sejam tão grandes que se tornam capazes de suprir a energia necessária à síntese de ATP a partir de ADP e Pi. (Fig. 10) Além da solubilidade em lipídeos e das proteínas transportadoras, uma outra classe de moléculas está relacionada à permeabilidade das membranas são os ionóforos. Ionóforos são pequenas moléculas hidrofílicas que se dissolvem nas bicamadas lipídicas, aumentando sua permeabilidade a íons. A maioria é sintetizada por microorganismos, atuando como armas biológicas contra suas presas ou competidores. Existem duas classes de ionóforos: carreadores móveis de íons e formadores de canais. Ambos servem para encobrir a carga do íons transportado de modo a que ele possa penetrar através da bicamada lipídica. A valinomicina é um carreador móvel que aumenta a permeabilidade celular ao K+, levando ao vazamento deste cátion . Já a Gramicidina A é um exemplo de ionóforo formador de canal. Duas moléculas deste ionóforo se unem na bicamada lipídica formando um canal que permite a passagem de cátions monovalentes (H+>K+>Na+ ). A gramicidina é um antibiótico sintetizado por algumas bactérias capaz de matar outros microorganismos levando-os ao colapso do gradiente de cátions essencial à sua sobrevivência. Transporte através da Membrana Conceitos Básicos ⇒ A bicamada lipídica das membranas celulares é altamente impermeável à maioria das moléculas hidrossolúveis e a todos os íons. A transferência de nutrientes, metabólitos e íons através da membrana plasmática e membranas intracelulares é feita através de proteínas transportadoras. ⇒ As membranas celulares contém várias proteínas transportadoras, cada uma das quais é responsável pela transferência de um soluto específico através da membrana. Existem duas classes de proteínas transportadoras: CARREADORAS e CANAIS. ⇒ O gradiente eletroquímico representa a força direcional de um íon resultante de seu gradiente de concentração e do campo elétrico. ⇒ No transporte passivo um soluto não carregado move-se a favor do gradiente de concentração, do lado em que está mais concentrado para o lado em que está menos concentrado, enquanto um soluto carregado move-se a favor de seu gradiente eletroquímico. ⇒ No transporte ativo o movimento do soluto se faz contra o gradiente de concentração, no caso de um soluto não carregado, e contra o gradiente eletroquímico, no caso de um soluto carregado; num processo que requer energia. ⇒ As proteínas carreadoras ligam-se a solutos específicos (íons inorgânicos, pequenas moléculas orgânicas, ou ambos) fazendo com que atravessem a bicamada lipídica através de mudanças em sua conformação que expõem o sítio de ligação do soluto a um lado da membrana e a seguir ao outro. ⇒ As proteínas do tipo canal formam poros aquosos através da bicamada lipídica através dos quais os solutos podem se difundir. Enquanto o transporte pelas proteínas carreadoras pode ser ativo ou passivo, o transporte através dos canais é sempre passivo. ⇒ A maior parte das proteínas do tipo canal é de canais iônicos seletivos que permitem a passagem de íons inorgânicos específicos de acordo com seu tamanho e carga. O transporte através destes canais é pelo menos 1000 vezes mais veloz do que o transporte através de qualquer carreador conhecido. ⇒ A maior parte dos canais iônicos só se abre sob determinados estímulos como a alteração do potencial de membrana (ativados por voltagem) ou a ligação de uma molécula específica (ativados por ligante). TRANSPORTE “A membrana plasmática é dotada de permeabilidade seletiva” A - PERMEABILIDADE ATRAVÉS DE UMA BICAPA LIPÍDICA Depende de: - Tamanho - Polaridade - Carga - Concentração da molécula ou íon em questão B - OSMOSE – difusão simples C - TRANSPORTADORES Sempre proteínas (ou complexos de proteínas) integrais “multipass” D - TIPOS DE TRANSPORTE E PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS Tipo de Proteína Transporte Passivo Ativo Carreadoras Algumas Muitas Canais Algumas Nenhuma TRANSPORTE PASSIVO = DIFUSÃO FACILITADA - A favor do gradiente de concentração - Sem dispêndio de energia - Pode atingir a saturação CANAIS - Formam poros hidrofílicos na membrana - São seletivos - São quase sempre “canais iônicos” - Podem abrir-se e fechar-se PODEM SER ATIVADOS POR 1 – ligante 2 – voltagem CARREADORES -Similares a enzimas, mas não modificam quimicamente a molécula transportada TRANSPORTE ATIVO TRANSPORTE PASSIVO Dispêndio energético Semdispêndio energético Contra o gradiente eletroquímico A favor do gradiente eletroquímico 0 1 2 3 4 0 2 4 6 Vmax Difusão Facilitada Difusão Simples TRANSPORTE ATIVO - Primário - Secundário FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS CARREADORAS FAMÍLIA EXEMPLOS Transportadores de açúcares Transportadores passivos de glicose em mamíferos Cátion-ATPases Na+/K+ ATPases Ca++ ATPases Transportadores ABC PTNs MDR (multi resistência a drogas) Resistência à cloroquina em P. falciparum Ptn. Transmembrana reguladora da fibrose cística Antiporters aniônicos (Cl- - HCO3-) Banda 3 em hemácias Antiporters catiônicos Trocadores de Na+ - H+ Antiporters cátions/anions Trocador de Cl- - HCO3-, depende de Na+ Simporters associados ao Na+ Simporter de Na+ - glicose no epitélio intestinal Bibliografia - Molecular Biology of the Cell. Alberts, Bray, Lewis, Raff, Roberts and Watson. Garland Publishing Co. - Principles of Cell Biology. Lewis J. Kleinsmith, and Valerie M. Kish. Harper & Row publishers, New York Questionário Transporte 1. De que fatores depende a permeabilidade de uma bicamada lipídica a uma molécula? 2. Diferencie osmose de difusão facilitada 3. Dê duas diferenças entre transporte ativo e transporte passivo 4. O que são proteínas carreadoras? 5. O que são proteínas do tipo canal? 6. Defina e exemplifique: UNIPORTE, SIMPORTE e ANTIPORTE. 7. O que é a bomba de Na+ / K+? - qual a sua importância? - como funciona? - como pode ser bloqueada? - como pode ser revertida? - o que acontecerá com uma célula animal se a bomba deixar de funcionar? 8. O que são ionóforos? 9. O que determina o sentido do transporte no transporte passivo? 10. Qual o efeito da bomba de Na+ / K+ sobre a polaridade da membrana plasmática? 11. Pesquise sobre doenças provocadas por problemas ou erros nos mecanismos de transporte através de membranas celulares. Escolha ao mesno uma para explicar. PERMEABILIDADE DE UMA BICAMADA LIPIDÍCA DIFUSÃO SIMPLES OU OSMOSE PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS TRANSPORTE PASSIVO OU DIFUSÃO FACILITADA TRANSPORTE A - PERMEABILIDADE ATRAVÉS DE UMA BICAPA LIPÍDICA B - OSMOSE – difusão simples C - TRANSPORTADORES D - TIPOS DE TRANSPORTE E PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS TRANSPORTE PASSIVO = DIFUSÃO FACILITADA CANAIS PODEM SER ATIVADOS POR TRANSPORTE ATIVO Transporte FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS CARREADORAS