TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM

Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original

Faculdade Pitágoras Teixeira de Freitas
Curso: Farmácia Período: 4° 
Discentes: Aline da S. Pereira, Aline R. S. Correia, Ana Carla O. Freitas, Denise B. Figueiredo, Greice Kely S. Brito
Docente: Sebastião Monteiro de Carvalho
Disciplina: Relações Microorganismos e Hospedeiros
Relatório Sobre Técnica de Coloração
De Gram
Teixeira de Freitas – BA
2015
TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM
Aline da Silva PEREIRA¹; Aline Ramos dos Santos CORREIA¹; Ana Carla Oliveira FREITAS¹; Denise Braz FIGUEIREDO¹; Greice Kely Salomão BRITO¹; Sebastião Monteiro de CARVALHO².
¹- Alunos de graduação em Farmácia da Faculdade Pitágoras de Teixeira de Freitas
²- Professor da disciplina Relações Microorganismos e Hospedeiros
INTRODUÇÃO
A coloração de Gram foi desenvolvida em 1984 pelo bacteriologista dinamarquês Hans Christian Gram. Ela é um dos procedimentos de coloração mais úteis, pois classifica as bactérias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram-negativas.
Neste procedimento:
Um esfregaço fixado pelo calor é recoberto com um corante básico púrpura, geralmente o cristal violeta. Uma vez que a coloração púrpura impregna todas as células, ela é denominada coloração primária.
Após um curto período de tempo, o corante púrpura é lavado, e o esfregaço é recoberto com iodo. Quando o iodo é lavado, ambas as bactérias gram-positivas e gram-negativas aparecem em cor púrpura.
A seguir, a lâmina é lavada com álcool. Essa solução é um agente descolorante, que remove o púrpura das células de algumas espécies, mas não de outras.
O álcool é lavado, e a lâmina é então corada com safranina, um corante básico vermelho. O esfregaço é lavado novamente, seco com papel e examinado microscopicamente.
Os diferentes tipos de bactérias reagem de modo distinto à coloração de Gram, pois diferenças estruturais em suas paredes celulares afetam a retenção ou a liberação de uma combinação de cristal violeta e iodo, denominada complexo cristal violeta-iodo (CV-I). Entre outras diferenças, as bactérias gram-positivas possuem uma parede celular de peptideoglicano mais espessa (dissacarídios e aminoácidos) que as gram-negativas. Além disso, as bactérias gram negativas contém uma camada de lipopolissacarídios (lipídios e polissacarídios) como parte de sua parede celular. Quando aplicados às células gram-positivas e gram-negativas, o cristal violeta e o iodo penetram facilmente nas células. Dentro das mesmas, o cristal violeta e o iodo se combinam para formar o CV-I. Esse complexo é maior que a molécula de cristal violeta que penetrou na célula e, devido ao seu tamanho, não pode ser removido da camada intacta de peptideoglicano das células gram-positivas pelo álcool. Consequentemente, as células gram-positivas retém a cor do corante cristal violeta. Nas células gram negativas, contudo, a lavagem com álcool rompe acamada externa de lipopolissacarídios, e o complexo CV-I é removido através da camada delgada de peptideoglicano. Como resultado, as células gram-negativas permanecem incolores até serem contracoradas com a safranina, quando adquirem a cor rosa.
Em resumo, as células gram-positivas retém o corante e permanecem com a cor púrpura. As células gram-negativas não retém o corante; elas ficam incolores até serem contracoradas com um corante vermelho.
O método de Gram é uma das mais importantes técnicas de coloração na microbiologia médica. Porém os resultados da coloração de Gram não são universalmente aplicáveis, pois algumas células bacterianas coram-se fracamente ou não adquirem cor. A reação de Gram é mais consistente quando utilizada em bactérias jovens, em crescimento.
Objetivo: Evidenciar características morfológicas das bactérias, classificando-as em gram-positivas e gram-negativas
MATERIAIS E MÉTODOS
Para realização da prática utilizou-se como materiais lâminas para microscopia, lamínulas, alça de Henle, tubo contendo solução salina fisiológica, bactéria gram-positiva Staphylococcus aureus, bactéria gram-negativa Escherichia coli, óleo de imersão, microscópio, lamparina. Como corantes utilizou-se cristal violeta, lugol, safranina e álcool 95%.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
1)Esfregaço da cultura bacteriana sólida: 
Flambou-se uma lâmina limpa rapidamente na chama da lamparina. Em seguida, flambou-se a alça de Henle, deixou-se esfriar. A partir daí todo procedimento foi realizado próximo da chama da lamparina. Em seguida, foi retirada uma gota de solução salina fisiológica e depositou-se na lâmina. Foi novamente flambado a alça, resfriou-se e assim foi coletada uma amostra da cultura sólida, onde foi levada até a água depositada sobre a lâmina. Foi homogeneizado com movimentos circulares, obtendo-se um esfregaço oval, uniforme e fino. Após fixou-se o esfregaço passando a lâmina na chama da lamparina, como se cortando a chama 5 vezes, para que o material fique bem aderido.
2) Método de coloração de Gram 
Colocou-se a lâmina com o esfregaço sobre um suporte na pia, onde foi realizada a coloração seguindo-se a seguinte sequencia: 1- Cobriu-se a lâmina com cristal violeta (Gram I) foi deixado agir por 1minuto. 2- A lâmina foi lavada em jato fraco de água destilada, dos dois lados. 3- Cobriu-se então após lavagem da lâmina com lugol (Gram II), onde foi deixado agir por 1 minuto e depois foi lavada novamente a lâmina no mesmo procedimento anterior. 5- Cobriu-se a lâmina com álcool (Gram III), e esperou-se 30 segundos e lavou-se bem a lâmina. 6- Cobriu-se a lâmina com safranina (Gram IV) e foi deixado agir por 30 segundos, e, novamente lavou-se a lâmina. Após a lâmina foi secada do lado oposto ao esfregaço e, em seguida levada ao microscópio, onde foi primeiro observada na objetiva de 10x para se ter uma visão se tem esfregaço ou não. Em seguida colocou-se uma gota de óleo de cedro sobre a lâmina, que foi observada na objetiva de imersão (100x).
Observações: 
É fundamental que o esfregaço fique totalmente coberto com cada um dos reagentes e que o reagente anterior seja completamente removido antes de se adicionar o seguinte.
* Este é o passo fundamental da técnica pois:
- Se deixarmos atuar o descorante tempo demais este vai retirar o corante a bactérias que deviam ficar coradas de cristal de violeta, ou seja, faz com que as células Gram positivo apareçam como Gram negativo.
- Se o descorante atuar tempo a menos não se remove completamente os complexos formados entre o corante primário e o mordente e assim aparecem coradas de violeta bactérias Gram negativo às quais o descorante não conseguiu retirar convenientemente o corante primário.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Resultados obtidos com a Coloração de Gram.
	Bactérias
	Solução
	Gram-positiva
	Gram-negativa
	Cristal violeta
	Tinge de violeta
	Tinge de violeta
	Lugol
	Permanece violeta
	Permanece violeta
	Álcool 
	Permanece violeta
	Torna-se incolor
	Safranina 
	Permanece violeta
	Tinge de vermelho
	
1) corante primário: violeta de cristal
É o primeiro a ser usado e cora todas as células de violeta.
2) mordente: lugol - solução de iodo
Este reagente é uma substância que forma um complexo insolúvel ligando-se ao corante primário. O complexo resultante serve para intensificar a cor do corante, ou seja, o lugol ajuda o cristal de violeta a penetrar nas células e a resistir à descoloração. Nas bactérias Gram positivo este complexo é mais difícil de ser removido do que nas bactérias Gram negativo.
3) descorante: álcool etílico 
Este reagente serve de solvente de lipídios e de agente desidratante das proteínas. Assim, a sua ação é determinada pela concentração lipídica das paredes celulares microbianas. 
Nas células Gram positivo a concentração baixa de lipídios é importante para reter o complexo corante-mordente. Os lipídios são dissolvidos pela ação do álcool causando a formação de pequenos poros na parede celular. Mas estes são prontamente fechados pela ação desidratadora do álcool e como consequência o corante primário é difícil de ser removido e as células mantêm-se
violetas.
Nas células Gram negativo a alta concentração de lipídios na membrana externa da parede celular é dissolvida pelo álcool, formando-se grandes poros na parede celular que não fecham apreciavelmente durante a desidratação das proteínas da parede celular. Isto facilita a libertação do complexo corante-mordente deixando as células incolores.
4) corante de contraste: safranina 
Este é o último reagente a ser aplicado e cora de vermelho as células que foram previamente descoradas. Uma vez que as células Gram negativo ficaram descoradas elas podem agora absorver o corante de contraste. As células Gram positivo mantêm a cor do corante primário.
CONCLUSÃO
Observou-se nos esfregaços que foram preparados que as bactérias do tipo gram-negativas adquiriram uma coloração aproximada do róseo e vermelho, efeito esse relacionado com a composição de sua parede celular. 
Já as bactérias que assumiram uma coloração mais violeta ou azul, caracterizaram as bactérias ditas gram-positivas, cuja característica da parede celular foi decisiva para esse efeito dos corantes na colônia. Ou seja, as gram-negativas possuem mais lipídeos em sua composição, e são mais permeáveis, por ter menos peptidioglicanos. Assim, quando aplicamos o álcool 95%, os lipídeos de sua parede celular são dissolvidos, perdendo-se a coloração violeta do cristal violeta. Aplicando-se safranina, de cor avermelhada, a bactéria gram-negativa adquire a coloração desta substância. Já as bactérias gram-positivas, têm menos lipídeos em sua parede celular e possuem uma camada muito mais espessa de peptidioglicanos, sendo assim menos susceptíveis de dissolução ou permeabilidade ao álcool 95%. Portanto, ela permanece com a coloração fornecida pelo cristal violeta: violeta. Sendo que o lugol apenas permite a melhor visualização do cristal violeta.
O que fica bastante evidenciado nessa prática é que a técnica de detecção de Gram é absolutamente importante para determinarmos as características iniciais da bactéria, nos permitindo domar melhor as potencialidades da bactéria e junto de outros testes nos possibilitando indicar melhor tratamento para o combate da colônia.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
TORTORA, G. J., FUNKE, B. R., CASE, C. L.. Microbiologia. 10ed. Porto Alegre: Artmed, 2012.