Técnicas de Sequenciamento

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Metabolismo e Endocrinologia 
2.º Ano LEBM, 5 de Abril de 2006 
 
Grupo 4: Ângela Chan, Gustavo Lopes, Joana Vieira; 
Tema: Separação e identificação das proteínas celulares. 
 
- Intro: Purificar uma proteína – essencial para estudar as suas propriedades/actividades. 
Métodos aproveitam-se de diferentes propriedades (tamanho, carga, props ligantes) 
 
- Fonte da proteínas; extracto cru (bruto) 
A fonte de proteínas é geralmente tecido ou células microbianas. Geralmente são bertas 
e o seu conteúdo é extraído para solução chamada extracto bruto (?) 
 
- Fraccionamento, “salting out” 
Comummente, o extracto é sujeito a tratamentos que separam as proteínas em diferentes 
fracções com base em dadas propriedades – fraccionamento. A diferente solubilidade 
das varias proteínas é usada em fases iniciais. A técnica “salting out” consiste na adição 
de sal às soluções, o que diminui a solubilidade das proteínas e as faz precipitar. Dada 
essa diferente solubilidade, através do controlo da concentração do sal pode fazer-se 
precipitar selectivamente certas proteínas. 
 
- Diálise 
Membranas semipermeáveis permitem separar moléculas de acordo com o seu tamanho. 
Pode ser usada, por exemplo, para remover o sal depois de aplicado o processo de 
“salting out” 
 
- Cromatografia de coluna – generalidades: fase estacionaria, fase móvel, diferente 
velocidade de migração de acordo 
com dadas propriedades 
 
Os elementos padrão incluem um 
material sólido e poroso (matriz, fase 
estacionária por onde corre a solução, 
a fase móvel) dentro duma coluna de 
plástico ou vidro. A solução que 
perde no fundo (efluente) é 
constantemente substituída por 
solução fornecida no topo. As 
proteínas migram a diferentes 
velocidades à medida que são 
retardadas em diferente grau pelas 
suas diferentes interacções com a 
matriz. A separação melhora (ie, a 
resolução aumenta) se aumentarmos 
a coluna, mas piora à medida que o 
temp vai passando. 
 
Tipos de cromatografia 
-Cromatografia por troca de iões 
 
A cromatografia por troca de iões 
explora as diferenças no sinal e 
magnitude da carga eléctrica 
global das proteínas a dado pH. A 
matriz da coluna é um polímero 
sintético que contém grupos 
carregados. A afinidade de cada 
proteína para os grupos carregados 
na coluna é afectada pelo pH (que 
determina o estado de ionização da 
molécula) e pelas concentrações 
dos sais livres que competem na 
solução. 
 
- Cromatografia de filtração em 
gel 
 
Separa as proteínas de acordo com o seu tamanho. 
A matriz é polímero com ligações cruzadas e poros 
de determinado tamanho. As proteínas grandes 
migram mais rápido que as mais pequenas porque 
são demasiado grandes para entrar nos poros e, 
assim, tomam o caminho mais rápido; as moléculas 
mais pequenas têm de percorrer um caminho mais 
labiríntico. 
 
- Cromatografia de afinidade 
 
 
Separa as proteínas através da 
facilidade com que estabelece 
determinadas ligações. As proteínas 
retidas na coluna são aquelas que se 
ligam especificamente a um ligante 
na matriz. As proteínas que não se 
lhe ligam passam a coluna. Pode 
remover-se determinadas proteínas 
retidas na coluna com uma solução 
contendo o ligante. 
 
- (HPLC, high-performance liquid 
chromatography) – uso de bombas 
de alta pressão e material 
cromatográfico de alta qualidade 
que aguente a pressão inerente ao 
processo. 
 
Electroforese 
 
- Electroforese: ideia base, contexto 
de uso, desvantagem 
A electroforese é uma técnica que 
permite separar proteínas com base 
na migração de proteínas carregadas sujeitas a um campo eléctrico. 
É geralmente usada em fases iniciais – permite purificar em grandes quantidades; 
essencialmente um método analítico, as proteínas podem ser visualizadas e separadas, o 
que permite estimar rápido o numero de proteínas numa preparação ou determinar o 
grau de pureza de dada proteína. Permite ainda determinar propriedades cruciais: ponto 
isoeléctrico e peso molecular aproximado. 
 
- Electroforese: gel de poliacrilamida e factores afectando a velocidade de migração – 
forma e relação massa/carga 
A electroforese é geralmente realizada em géis constituídos pelo polímero com ligações 
cruzadas poliacrilamida. O gel de poliacrilamida abranda a migração de proteínas 
aproximadamente na proporção da sua relação carga/massa. A migração também é 
afectada pela forma da proteína. 
 
- Estimação do peso molecular por gel de SDS; azul de Coomassie, comparação com 
moléculas padrão 
Na
+
SO O
O
O
-
sulfato duodecil de sódio 
O SDS liga-se à maioria das proteínas em quantidade aproximadamente proporcional ao 
peso molecular da proteína (uma ligação por cada duas moléculas de resíduo de 
aminoácidos). O SDS contribui com uma carga global muito negativa, tornando a carga 
intrínseca de proteína insignificante. Face à electroforese, as proteínas são separadas 
quase exclusivamente de acordo com a sua massa molecular (as pequenas migram mais 
rápido). De seguida, adiciona-se azul de Coomassie, que se liga às proteínas mas não ao 
gel e que permite visualizar as proteínas. Pode comparar-se a migração da proteína que 
se está a estudar com outras cujo peso molecular seja conhecido e, assim, estimar o peso 
molecular da molécula em causa 
 
 
- Focagem isoeléctrica; electroforese bidimensional (combinação com a electroforese de 
SDS) 
 
Focagem isoeléctrica é o procedimento usado para determinar o ponto isoeléctrico de 
uma proteína. Um gradiente de pH é estabelecido num gel de poliacrilamida pela 
mistura de soluções tampão especiais e sujeita a um campo eléctrico. Quando se 
introduz uma mistura de proteínas, cada uma migra até chegar a uma região cujo pH 
coincida com o seu pI. 
Este método pode ser combinado com a electroforese de SDS num processo chamado 
electroforese bidimensional, o que permite separar moléculas com o mesmo pI mas 
pesos molecular diferentes e assim obter grande resolução. 
 
 
 
- Breve referência à importância de “dissecar” a proteína 
Que faz duma proteína, uma hormona, proteína estrutural ou anticorpo. Milhares de 
doenças genéticas humanas foram associadas à produção de proteínas defeituosas. 
 
- Método de Sanger (mostrar imagem) 
Frederik Sanger (a quem se atribui o método de sequenciamento de DNA usado hoje) 
desenvolveu o reagente 1-fluoro-2,4-dinitrobenzeno (FDNB) que permite identificar o 
resíduo amino-terminal de um polipétido. Este método implica a hidrólise da cadeia 
para identificar o amino-ácido marcado, pelo que não é útil para sequenciar o 
polipéptido para além do resíduo amino-terminal. Pode, no entanto, ajudar a determinar 
o número de polipéptidos distintos numa proteína desde que cada um tenha um resíduo 
amino-terminal diferente. 
N
+
O
-
O
N
+
O
O
-
F
1-fluoro-2,4-dinitrobenzeno 
 
- Degradação de Edman; máquinas (ver imagem) 
A degradação de Edman permite identificar e remover apenas o resíduo amino-terminal 
de um péptido e deixar as outras ligações Intactas 
1. O péptido reage com fenilisotiocianato sob condições um pouco alcalinas e converte 
o aminoácido terminal num produto de adição ao PTC 
 
•C
NH
S
PTC 
A ligação peptídica é então quebrada num passo que envolve o ácido anidro 
trifluoroacético, com a remoção do aminoácido amino-terminal como um derivado da 
anilinotiazolinona (o resíduo liga ao carbono por baixo do “l”). 
S
N
O
N
H
anilinotiazolinona 
O derivado é então extraído com um solvente orgânico e convertido num derivado do 
phenylthiohydantoin 
Após a remoção e identificação do resíduo amino-terminal, o novo resíduo amino-
terminal pode ser removido e identificado até que toda a sequência esteja determinada. 
 
- Estruturas maiores, apenas dizer que são partidas 
 
- Papel do sequenciamento do DNA; breve referência