Bioquímica de Proteínas e Eletroforese

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Bioquímica de Proteínas 
Eletroforese 
Estrutura e Função de Proteínas – 
→ Estrutura primária: sequência de aminoácidos 
que compõe a proteína que fazem ligações 
peptídicas entre si. 
 
o O que difere os aminoácidos são os 
seus radicais. 
 
→ Estrutura secundária: dobramento da 
proteína; ocorre uma ligação de hidrogênio 
entre o oxigênio da carboxila de um 
aminoácido com o hidrogênio do grupo amina 
do outro. 
o Folha β-preguiada. 
o α-hélice. 
 
→ Estrutura terciária: dobramento resultante da 
interação dos grupos radicais dos 
aminoácidos. 
o Ligação dissulfelto entre as cadeias 
laterais de cisteína: covalente. 
 
→ Estrutura quaternária: está relacionada à 
interação de diferentes proteínas, formando 
uma estrutura funcional. 
 
DESNATURAÇÃO 
→ Processo de desenovelação das proteínas. 
→ Pode ocorrer por alterações no pH, variações 
de temperatura e presença de detergentes 
na cadeia polipeptídica. 
→ Quando ocorre a desnaturação de uma 
proteína, a mesma acaba perdendo sua 
função. 
Anemia Falciforme ------------- 
→ É caracterizada pela alteração nos glóbulos 
vermelhos, onde as hemácias passam a 
apresentar formato de foice. 
o Isso ocasiona a oclusão dos vasos 
sanguíneos e a propensão à 
hemólise (destruição prematura das 
hemácias por rompimento da 
membrana plasmática). 
→ A diferença entre um indivíduo saudável e 
um que possui a doença ocorre em apenas 
um aminoácido: onde deveria-se apresentar 
uma glicina, tem-se uma valina. 
Eletroforese ------------------- 
→ Técnica empregada para separar moléculas 
de diferentes cargas e/ou pesos moleculares 
durante a aplicação de uma diferença de 
potencial elétrico. 
→ Na eletroforese é possível separar 
macromoléculas de DNA, RNA e proteínas. 
→ Na separação por carga, quando há uma 
mistura de proteínas com cargas negativas e 
positivas, aplica-se uma diferença de potencial 
elétrico, assim, atraindo as proteínas para a 
região dos polos. 
→ Na separação por peso (massa) molecular, 
todas as proteínas são carregadas 
negativamente e a única coisa que as difere 
é a massa molecular. Logo, quando o 
potêncial elétrico é adicionado, as proteínas 
maiores ficam mais próximas ao polo 
negativo, enquanto as menores ficam mais 
próximas ao polo positivo. 
SDS-PAGE -------------------- 
→ Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) 
em presença do detergente dodecilsulfato de 
sódio (SDS). 
PRINCIPAIS COMPONENTES 
→ Gel de poliacrilamida. 
o Representa o polímero. 
 
o O gel é preparado verticalmente 
entre dois suportes plásticos ou de 
vidro que possuem depressões para 
realizar a aplicação da amostra. 
o Quando pronto, o gel apresenta um 
pollímero de acrilamida. 
▪ Forma-se uma malha porosa 
por todo o gel; os poros 
alteram de tamanho de 
acordo com a quantidade de 
acrilamida. 
• É inversamente 
proporcional. 
o Dois tipos de gel: empilhamento e 
corrida. 
▪ O gel de empilhamento 
empilha todas as proteínas 
até que as mesmas entrem 
no gel de corrida ao mesmo 
tempo, seguindo uma 
sequência. 
 
→ Preparo de amostra. 
o Para linealizar as amostras, deve-se 
desnaturá-las. Para isso, deve-se 
fervê-las por cinco minutos a 95º em 
uma solução tampão. Ademais, 
deve-se, atráves do 2-
mercaptoetanol, reduzir as pontes 
dissulfeto. 
o Para que todas as proteínas passem 
a apresentar cargas negativas, no 
tampão há presença do SDS. 
▪ Uma molécula de SDS se liga 
em dois aminoácidos de 
cada proteína, criando uma 
relação entre a massa e a 
carga das proteínas. 
• Proporcional ao 
número de SDS. 
o O tampão é constituido por SDS, 2-
mercaptoetanol, azul de bromofenol 
e glicerol. 
→ Solução tampão ionizada. 
o Faz a condução das amostras e, 
também, do potêncial elétrico que é 
aplicado.. 
o Em pH 8,3, a glicina se encontra 
acima da curva do ponto isoelétrico; 
SDS (-). 
 
→ Cada banda apresenta um peso molecular 
diferente. 
→ Quando em gel, pode-se observar um 
padrão no peso molecular. 
*** ESSE PROCESSO PERMITE AVALIAR SE 
OCORREU EXPRESSÃO DA PROTEÍNA DE 
INTERESSE E SUA PURIFICAÇÃO. 
Eletroforese Bidimensional ------- 
→ Uma nova dimensão de separação de 
proteínas é adicionada. 
→ Além de realizar a separação por peso 
molecular, pode-se realizar, simultaneamente, 
a separação por ponto isoelétrico. 
o A separação por ponto isoelétrico é 
feita por focalização. 
→ PRIMEIRA DIMENSÃO: 
o Separação por ponto isoelétrico. 
o Focalização isoelétrica: a amostra é 
aplicada em um gel com gradiente 
de pH (9 → 3) e migra até o ponto 
isoelétrico neutro. 
▪ Quando o potêncial elétrico 
é aplicado, a proteína tende 
a migrar em direção ao polo 
positivo até atingir o pH 
neutro. 
→ SEGUNDA DIMENSÃO: 
o SDS-PAGE.