Eletroforese e Cromatografia - Biofísica

Prévia do material em texto

Eletroforese e Cromatografia 
Eletroforese 
֎ Fracionamento de moléculas presente 
em uma amostra (permite a 
visualização do perfil de moléculas) 
Diferentes tipos de proteína em uma 
amostra, peso molecular e carga total. 
 
֎ A eletroforese é uma técnica de 
separação baseada na migração de das 
moléculas carregadas, numa solução, 
em função de um campo elétrico. 
 
 
 
֎ O mais utilizado hoje em dia é 
eletroforese de proteínas em gel de 
poliacrilamida e de DNA em gel de 
agarose. 
 
֎ A velocidade de migração das 
moléculas nestes suportes depende 
principalmente da força do campo 
aplicado da carga, do tamanho e da 
molécula. 
 
 
Eletroforese de Proteínas em gel de 
poliacrilamida desnaturada – SDS-PAGE 
 Gel vertical de poliacrilamida (formada 
por monômeros de acrilamida) 
 
 Gel desnaturante (SDS detergente – 
Torna a proteína carregada 
negativamente). 
. 
 
 Uso de um campo elétrico (proteínas 
carregadas negativamente migram para 
o polo positivo). 
 
 Migração depende da carga, massa, e 
formato das proteínas. 
 
 A migração das proteínas é 
proporcional ao peso molecular. 
 
֎ Preparo do gel de poliacrilamida 
 
 Produtos necessários 
- Acrilamida 
- Bis-acrilamida (monômero que ajuda na 
rigidez da substância fazendo ligações 
cruzadas nos polímeros de acrilamida) 
- TEMED (polimerizante) 
- Persulfato de amônia (polimerizante) 
- Tampão Tris 
- Conjunto de placas 
- Garras 
 
֎ Processo de preparação do gel 
 
- Utilização de duas placas encaixadas (a 
placa de baixo tem uma elevação que 
permite a formação de um 
espaçamento interno para o gel). 
- Disposição das placas em um suporte 
- Criação de uma marcação com auxílio 
do pente, para ter uma noção da 
disposição do 1º gel... 
- Disposição de água no suporte para 
verificar se há presença de 
vazamentos, seguindo da retirada da 
mesma, utilizando um papel filme para 
auxílio. 
- Preenchimento do espaço até a 
marca feita com o pente com a mistura 
do 1° gel: acrilamida, SDS, dH2O, 
persulfato de amônia, TEMED (deve 
ser adicionado por último), tampão Tris 
em pH mais altos. 
 - Esperar pela polimerização, podendo 
colocar água para verificação. 
- Terminar o preenchimento do espaço 
com uma 2° mistura de gel: os 
ingredientes são os mesmos do 1° gel, 
com a diferença que possui menor 
concentração de acrilamida (a 
concentração e a relação acrilamida:bis-
acrilamida determinam o tamanho dos 
poros do gel), e tampão com pH mais 
baixo. 
- Disposição do pente junto com a 2° 
mistura de gel, permitindo a formação 
de pocinhas neste para disposição das 
proteínas, para a corrida do gel. 
- O perssulfato e o TEMED se ligam ao 
monômero de acrilamida para formar o 
polímero de acrilamida (formação de 
radicais livres iniciadores da 
polimerização). 
- A bis-acrilamida vai se ligar nas 
ramificações dos polímeros de 
acrilamida (importante para unir os 
polímeros e formar uma malha, que 
contribui para a rigidez do gel). 
 
* A disposição de dois géis serve para 
que não haja interferências no resultado 
da corrida entre as proteínas. 
 
֎ Preparo de proteínas - Itens 
 
 Tampão de amostra 
- SDS (sodium dodecy sulfate) (-) 
- β-mercaptoetanol (quebra pontes de 
dissulfeto) 
- Glicerol (da maior densidade a proteína) 
- Tampão Tris 
- Azul de bromofenol (para visualização) 
 Desnaturação de proteínas 
- 95 - 100°C por um período de 5 minutos. 
 
֎ Processo de preparo das proteínas 
 
 Com a desnaturação das proteínas, os 
radicais hidrofóbicos das proteínas se 
ligam a parte hidrofóbica do SDS, 
deixando toda a proteína com carga 
negativa., permitindo sua atração pelo 
polo positivo do sistema. 
 
֎ Execução da eletroforese 
 
 Disposição das proteínas nas poças 
feitas pelo pente 
 Conexão de eletrodos no aparelho 
montada para criação de um campo 
eletromagnético em sentido (-) → (+), 
sendo que o polo negativo posiciona-se 
na parte superior, e o polo positivo na 
parte inferior. 
 No 1° ou último pocinho pode ser 
colocado um marcador de massa 
molecular (proteína com massa 
molecular conhecida) para a indicação 
do tamanho (peso) das proteínas de 
amostra por comparação. 
 Densidometria: baseado na largura e 
intensidade da banda, adquire-se a 
concentração das proteínas. 
 
֎ Revelação das bandas proteicas 
 
 Coloração com comassie-blue ou prata 
 
 Azul de comassie + Metanol 
 
 Solução descorante: Metanol 
 
 Após a corrida das proteínas, o gel é 
disposto em um recipiente com 
corante azul de comassie – permite 
identificar o número de proteínas da 
amostra. 
 
Western Blot 
. 
֎ Permite a análise de proteína em gel, 
com uma proteína conhecida de 
comparação (ex: uma proteína viral). 
֎ Passagem por reconhecimento por 
anticorpos que dão coloração, 
permitindo o reconhecimento de 
proteínas de interesse. 
֎ Utilizado para tirar a prova de exames 
com resultados falso negativo/positivo. 
 
Eletroforese de DNA 
 
 O gel mais indicado para o processo é 
o gel de agarose 
 
֎ Princípios da técnica 
 
 A mistura para a preparação deste gel 
específico já vem pronto e seco. 
 Gel de disposição horizontal 
 Preparação de um suporte de acrílico 
com duas entradas vedadas. Disposição 
da mistura com o tampão, adição da 
agarose, e levar para aquecer. 
 O agarose vai dissolver pela 
temperatura elevada, adicionando o 
pente logo após para formar os poços. 
 Todo o conteúdo do gel deve estar 
submerso em um tampão (para 
permitir a corrente eletromagnética) 
 Apoiado o gel em um “recipiente” com 
parte central mais elevada para 
disposição do gel. 
 Em uma extremidade do “recipiente” é 
disposto um eletrodo negativo, e a 
outra extremidade, um eletrodo 
positivo. 
 Não há a necessidade de um composto 
para converter a carga das amostras, 
pois o grupamento fosfato das bases 
deixa a amostra com carga total 
negativa. 
 Coloração no gel com brometo de 
etídeo. 
 Visualização: transiluminador de luz UV 
(quando a luz incide nas moléculas 
fluorescentes a amostra floresce – 
principalmente quando os anéis são 
atingidos). 
 
 PGGE (Pulsed Field Gel 
Eletrctropheresis) – Eletroforese em 
Gel de Campo Pulsante: Eletroforese 
com aplicação de campos elétricos 
alternados em duas direções para a 
separação de moléculas de DNA com 
massa acima de 10kb. 
 Outros fatores que influenciam a 
migração: 
Topologia do DNA – nível de 
compactação; 
Fita dupla x fita simples. 
 Tampão de amostra: Glicerol, azul de 
bromofenol, tampão TRIS. 
 
֎ Separação do DNA no gel 
 
 Quanto maior a massa molecular da 
amostra, menor é a velocidade de 
migração. 
 Cada banda no gel corresponde a 1 
molécula de DNA. 
 Com o procedimento também pode 
ser observado RNA. 
 
֎ Visualização 
 Transiluminador de luz UV 
 Quantidade de DNA limite – 10ng 
 Compostos fluorescentes 
 
 
֎ Southern Blot 
 
 Utilização de uma sonda radioativa de 
DNA (DNA pequeno com sequência 
complementar a de interesse, ligada a 
um átomo radioativo). 
 Permite a visualização de uma 
sequência de DNA específico. 
 Utilizado em criminalística – DNA de 
uma amostra, degradação (enzimas de 
restrição), fragmentos separados por 
tamanho, transferência do dna para 
uma membrana, incubação com a 
sonda, e exposição à Raio-X.. 
 
֎ Teste de paternidade 
 
 Marcadores de DNA – regiões 
genômicas diferentes entre as pessoas. 
 Microssatélites (sequências repetitivas) 
– número de repetições. 
 PCR 
 
Cromatografia Líquida 
֎ Baseia-se na utilização de um método 
com a função de separar (purificar) 
componentes de sistemas biológicos, 
como proteínas e fragmentos de DNA. 
֎ As moléculas de uma amostra são 
dissolvidas em um tampão e aplicadas 
em uma coluna de cromatografia 
preenchida por resina (esferas 
poliméricas). O fluxo de tampão é 
estabelecido e as moléculas passamentre as resinas de acordo com esse 
fluxo. As moléculas que não interagem 
com as esferas de resina migram 
rápido e logo saem da coluna (eluidas). 
As proteínas que interagem com as 
esferas apresentam velocidade de 
migração menor e saem mais 
posteriormente. 
֎ Coluna líquida convencional utiliza como 
suporte uma coluna de vidro 
֎ Utensílios: coluna de vidro cheia de 
esferas (resinas), com uma abertura 
com regulador na parte inferior, e 
recipiente acoplado na parte superior 
contendo o líquido (tampão), regulado 
por uma torneirinha. 
֎ Coleta das amostras que saem do 
sistema em tubos, denominadas as 
partes de frações. 
 
 
Cromatografia de Peso Molecular 
֎ As esferas desse sistema possuem 
suas superfícies cheias de esporos de 
tamanho definidos, sendo que as 
proteínas maiores que o tamanho 
definido não encaixam nos poros da 
resina, sendo rapidamente levadas pelo 
tampão e coletada pelos tubinhos, 
enquanto as moléculas de tamanho 
igual ou menor ao definido, irão se 
encaixar no poro e sair após um tempo 
maior. 
 
 
Cromatografia de Troca Iônica 
֎ As resinas desse sistema possuem uma 
superfície mais lisa, com grupamentos 
químicos que podem estar carregados 
positiva ou negativamente, deixando a 
resina com carga positiva ou negativa, 
de acordo com a estratégia de trabalho. 
֎ As moléculas que possuírem uma carga 
igual a da resina, não sofrem atração, e 
rapidamente saem do sistema levadas 
pelo tampão. As moléculas de cargas 
opostas as resinas vão ter afinidade e 
levar mais tempo para se desligar. 
֎ Para ajudar na perda da afinidade das 
moléculas restantes é comum a adição 
de sais ao sistema, ou mudança do pH. 
 
 
Cromatografia de Afinidade 
֎ As resinas desse sistema não são nem 
porosas nem carregadas, mas são 
ligadas a moléculas ligantes que se 
prendem a proteína que se tem 
interesse em identificar. 
֎ As proteínas que não tem afinidade 
pelo ligante rapidamente serão eluidas 
e as proteínas que são de interesse 
ficarão ligadas as moléculas ligantes. 
֎ As proteínas que ficarão no sistema ao 
final, ligadas as moléculas ligantes na 
resina, serão soltas com o despejo de 
ligantes livres no sistema, que se ligam 
as proteínas ligadas aos ligantes não 
livres (das resinas) e permitem que 
sejam eluidas em frações finais.