Hidrólise ácida do amido, extração do DNA do morango e reação de saponificação: práticas experimentais

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Hidrólise ácida do amido, extração do DNA do morango e reação de saponificação: práticas experimentais
Bianca Martins Monzillo1
Unisul, 2019
RESUMO
As biomoléculas são essenciais para os processos vitais dos seres vivos e amplamente utilizadas no setor produtivo. A hidrólise modifica quimicamente e fisicamente o amido que é um polissacarídeo presente no reino vegetal, podendo ser hidrolisado por via ácida ou enzimática, proporcionando dessa maneira diferentes propriedades ao mesmo. Para que se possa comprovar a hidrólise ácida do amido, são utilizados métodos de coloração com reagentes DNS e lugol. Com o lugol foi possível observar o desaparecimento do amido e com o DNS a formação de açúcares redutores. O DNA é uma estrutura que contém informações codificadas que reagem os processos vitais das células, sendo responsável pela transmissão de características herdáveis. O DNA do morango foi extraído através de uma solução contendo cloreto de sódio e detergente adicionada, filtrado o extrato e adicionado etanol para que se fosse observado. As gorduras e óleos são empregados universalmente como forma de reserva, esses são denominados ácidos graxos. Esses óleos e gorduras são caracterizados pela presença de cadeias carboxílicas longas. Na saponificação são utilizadas bases fortes para hidrolisar as ligações de éster dos lipídeos. O experimento de saponificação foi realizado em três partes sequenciais: a primeira consistia na reação de saponificação, a segunda, na formação de sabão insolúvel e a terceira, na estabilização de uma emulsão. Por meio de uma reação de saponificação, foi sintetizado sabões por meio de óleo vegetal na presença de uma base forte e álcool, de modo que o produto passo por uma série de testes a fim de analisar a natureza anfipática em determinadas situações.
Palavras-chave: Saponificação, Amido, Hidrólise, DNA.
INTRODUÇÃO 
A Bioquímica é uma ciência complexa e importante que estuda os processos químicos envolvidos nos organismos vivos. Esses processos abrangem as biomoléculas, tratando das suas estruturas, funções e processos metabólicos (ALBULQUERQUE, 2012).
O amido é um carboidrato, sendo polímero da glicose. Sua formação é constituída por duas macromoléculas: amilose e amilopectina. Sendo que a amilose é formada porunidades de glicose unidas por ligações glicosídicas α-1,4, originando uma cadeia linear. Por outro lado, a amilopectina é formada por unidades de glicose unidas em α-1,4 e também por ligações α-1,6, resultando assim uma estrutura ramificada (DENARDI & SILVA, 2009).
Hidrólise é a decomposição pela água; mas a água, por si mesma não pode realizar uma hidrólise completa. Para isso, é necessário operar em temperaturas e pressões elevadas. Para que a reação seja rápida e completa é sempre indispensável um agente acelerador, qualquer que seja o mecanismo da reação. Os mais importantes são álcalis, ácidos e enzimas (BARCZA, 2016). A hidrólise do amido faz com que a cadeia fique menor, devido à quebra das ligações. Apesar de maior dificuldade de obtenção de açúcares redutores pela hidrólise ácida em relação à hidrólise enzimática, esta apresenta menores custos de processo (RIBEIRO et al., 2009). 
Enzimas são catalisadores biológicos de alta especificidade. Elas são de natureza proteica e aumentam a velocidade de reações químicas específicas, por diminuição da energia de ativação requerida (CISTERNAS, 2001). O valor de pH, a temperatura, o tempo de incubação, as concentrações dos substratos, de cofatores ou de outras substâncias (inibidores ou ativadores) são exemplos de condições de ensaio que podem ser modificadas com o objetivo de observar como varia a atividade da enzima, ou seja, como varia a velocidade da conversão ou conversões que esta catalisa (FONTES, 1996).
O método de DNS foi inicialmente empregado para medir açúcares no sangue e na urina (SUMNER, 1921; SUMNER; SISLER, 1944; GONÇALVES et al., 2010; TEIXEIRA et al., 2012). Mais tarde, Miller (1959) aperfeiçoou o ensaio, de modo que seu protocolo foi o mais empregado por muitos anos, com diversos fins, e o mais citado na literatura. O ácido 3,5-dinitrosalicílico (agente oxidante presente no reativo DNS) que apresenta coloração alaranjada, sob condições alcalinas, reage com o carbono carbonílico de açúcares redutores e se reduz a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, um composto acastanhado cuja absorção máxima de luz se dá a 540 nm (GONÇALVES et al., 2010; NEGRULESCU et al., 2012).
	A hidrólise ácida homogênea é um processo econômico, onde a escolha do ácido depende de sua compatibilidade com o produto final, e muito utilizada para produção de xaropes, porém podendo causar alterações devido às condições drásticas de reação (pH e temperatura) em que são empregados (RODRIGUES ET AL. 2000).
A molécula de DNA consiste em duas cadeias de nucleotídeos dispostas em hélice em torno de um eixo. As bases púricas e pirimídicas de cada cadeia polinucleotídica situam-se dentro da hélice dupla, em planos paralelos entre si e perpendiculares ao eixo da hélice (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2005). As bases púricas encontradas no DNA são adenina e guanina; e as bases pirimídicas são citosina e timina, sendo que a adenina se liga à timina e a guanina liga-se à citosina através de pontes de hidrogênio. (LOUREDO)
De acordo com Lehninger (2002, p.14) a informação do DNA está codificada em uma sequência linearde unidades de nucleotídeos, mas a expressão dessa informação resulta em uma célula tridimensional. Essa mudança de uma para três dimensões ocorre em duas fases. Uma sequência linear de desoxirribonucleotideos no DNA codifica por meio do RNA intermediário a produção de uma proteína com uma sequência linear de aminoácidos. A proteína dobra-se sobre si mesma numa forma tridimensional particular, ditada por sua sequência de aminoácidos e estabilizada por interações não-covalentes. A estrutura tridimensional precisa é crucial para a função da proteína, que como catalisadora quer como elemento estrutural.
Para extrair DNA do morango, é necessário dissociar o tecido do morango, romper a parede celular e as membranas plasmáticas e nucleares, remover as proteínas e isolar o DNA. Este experimento requer detergente líquido para desnaturar as membranas lipídicas e água com sal para neutralizar o DNA que precipitará ao adicionar álcool gelado, pois estará menos solúvel em solução alcoólica, permitindo sua visualização(SEER, 2019). Na primeira fase da técnica de extração do DNA, objetiva-se a ruptura ou lise das membranas celulares com a finalidade de liberar os componentes citoplasmáticos e/ou nucleares intracelulares. Após a obtenção do lisado contendo proteína, ácidos nucleicos e lipídios, existe a necessidade de separar os ácidos nucleicos das outras moléculas (SCORSATO, TELLES, 2011, p. 545).
As gorduras e os óleos, empregados quase universalmente nos organismos vivos como forma de reserva, são denominados ácidos graxos (LEHNINGER, 2006). Segundo Baldasso (2010), O sabão pode ser fabricado de forma caseira a partir de óleos de fritura. Este tipo de prática, além de reduzir danos ao meio ambiente causados pelo descarte incorreto desse material, transforma os óleos em materiais biodegradáveis.
A mais importante característica dos lipídios é sua natureza apolar, o que leva a sua insolubilidade em água. No caso dos ácidos graxos, o lipídio contém uma extremidade carboxílica ligada a uma longa cauda alifática. Possuindo três cadeias alifáticas, os triacilgliceróis (gorduras) são reservatórios ideais para o armazenamento de energia na célula (CAMPBELL, 2000, p. 204)
O sabão é largamente empregado em diversos seguimentos industriais, tais como nas indústrias têxteis, de tintas, de plásticos e de couros. Entretanto, sua maior produção se destina à lavagem e limpeza domésticas (OZAGO, 2008).Os sabões são sais de ácidos carboxílicos que possuem cadeia longa apolar e extremidade polar. Essa característica possibilita a interação do sabão com meio polares e apolares, agindo por meio de micelas que possibilitam a limpeza. Os sabões são capazesde diminuir a tensão superficial dos líquidos que entram em contato, diminuindo, dessa maneira, a quantidade de interações entre as moléculas que o constituem e, por consequência, aumentando o contato entre a superfície do líquido e os agentes de limpeza (FERNANDES, 2009).
As reações de saponificação servem de base para importantes determinações analíticas, as quais têm por objetivo informar sobre o comportamento dos óleos e gorduras em certas aplicações alimentícias, como, por exemplo, estabelecer o grau de deterioração e estabilidade, verificar se propriedades dos óleos estão de acordo com as especificações e identificar possíveis fraudes e adulterações (RIBEIRO & SERAVALLI, 2007).
Uma vez que óleos e gorduras são ésteres, eles sofrem reação de hidrólise ácida ou básica. A hidrólise ácida produzirá simplesmente o glicerol e os ácidos graxos constituintes. Já a hidrólise básica produzirá o glicerol e os sais desses ácidos graxos. Pois bem, esses sais são o que chamamos de sabão (GIBSON, 2012). Dentre os grupos de substâncias utilizadas presentes nos sabões pode-se citar as substâncias saponificáveis (óleos e gorduras vegetais e animais), e outras substâncias aditivas que aumentam a detergência ou dão características específicas ao sabão (FABRÍCIO, 2010).
Este trabalho teve como objetivo efetuar a hidrólise ácida do amido, conhecer os princípios básicos da extração do material genético do morango por meio da lise e a reação de saponificação. 
MATERIAIS, REAGENTES E MÉTODOS
Hidrólise ácida do amido
Primeiramente, pesou-se 1g de amido e foi adicionado 100 mL de água destilada em um erlenmeyer de 250 mL, agitando-se. Foram retiradas duas alíquotas, das quais uma continha 0,5 mL da solução, e outra com 1 mL da solução. A primeira foi transferida para um tubo de ensaio (A1) contendo 1,1 mL do reagente DNS + Hidróxido de sódio 50%, sendo em seguida colocada em banho maria por 5 minutos. A segunda, de 1 mL, foi transferida para outro tubo (B1) contendo 2 gotas de lugol.
Em seguida, no Erlenmeyer contendo a solução de amido 1% foram acrescentados 2 mL de ácido clorídrico concentrado, agitando-se para, em seguida, retirar-se alíquotas de 0,5 mL para o tubo de ensaio A2 e no tubo de ensaio B2, transferiu-se 1 mL e foi adicionado 2 gotas de lugol. A solução de amido com ácido foi levada para ebulição por 40 minutos. 
Durante a ebulição,a cada 10 minutos, foi retirada uma alíquota de 0,5 mL para os tubos de ensaios contendo 1,1 mL do reagente DNS + Hidróxido de sódio 50% (enumerados de A3 a A8), e outra alíquota de 1,0 mL com 2 gotas de lugol (de B3 a B8) e foram colocados em banho maria, mantendo em ebulição por 5 minutos.
Preparou-se então 2 tubos de ensaio, com 0,5 mL água destilado no tubo contendo 1,1 mL do reagente DNS + Hidróxido de sódio 50%, e outro com 1 mL de água destilada com 2 gotas de lugol e colocando-o em banho maria, mantendo em ebulição por 5 minutos.
Os materiais utilizados no experimento de Hidrólise ácida de amido podem ser observados na Tabela I.
Tabela I: Matérias utilizados no experimento.
	MATERIAIS
	CAPACIDADE
	QUANTIDADE
	Béquer
	250 mL
	1
	Béquer
	600 mL
	1
	Erlenmeyer
	250 mL
	1
	Bastão de vidro
	-
	1
	Chapa de aquecimento
	-
	1
	Pêra de sucção
	-
	1
	Tubo de ensaio
	-
	16
	Pipeta graduada
	2 mL
	5
	Pipeta graduada
	5 mL
	1
	Estante para tubos
	-
	1
	Conta Gotas
	-
	1
Fonte: Acervo próprio, 2019.
Os reagentes utilizados no experimento estão apresentados na Tabela II.
Tabela II: Reagentes utilizados no experimento.
	REAGENTES
	QUANTIDADE
	Amido
	1g
	Hidróxido de sódio 50 %
	5 mL
	Lugol
	2 gotas por solução
	Ácido Clorídrico P.A
	1,5 mL
	Solução de DNS
	7,7 mL
	Água Destilado
	1 mL
	Ácido 3,5 Dinitrosalicílico
	7,5 mL
Fonte: Acervo próprio, 2019.
Extração do DNA do morango 
Primeiramente, separou-se as sépalas de 3 morangos previamente lavados, para que eles fossem colocados em uma sacola plástica e esmagados por 3 minutos. Em seguida, 15 mL de solução de extração de DNA ao conteúdo da sacola e misturado, apertando com as mãos, por 10 minutos. 
O extrato foi filtrado e recebido em um tubo de ensaio até 1/3 de seu volume total. Posteriormente, foi derramado lentamente o álcool etílico gelado, até completar 2/3 do tubo de ensaio. Após 3 minutos foi mergulhado um palito de madeira dentro do tubo no local onde a camada de álcool fez contato com a camada de extrato. O tubo foi mantido ao nível dos olhos para que facilitasse a análise do processo. 
Os materiais utilizados no experimento de extração do DNA do morango podem ser observados na Tabela III.
Tabela III: Materiais utilizados no experimento.
	MATERIAIS
	QUANTIDADE
	Morangos
	3
	Funil de vidro
	1
	Papel de filtro
	1
	Tubo de ensaio
	1
	Saco plástico
	1
	Palito de madeira
	1
Fonte: Acervo próprio, 2019.
Os reagentes utilizados no experimento de extração do DNA do morango podem ser observados na Tabela IV.
Tabela IV: Reagentes utilizados no experimento.
	REAGENTE
	QUANTIDADE
	Solução de extração de DNA (50 mL de detergente + 15 g de NaCl + 900 mL de água)
	15 mL
	Etanol gelado
	2/3 de um tubo de ensaio
Fonte: Acervo próprio, 2019.
Reação de saponificação
Marcou-se quatro tubos de ensaio: A, B, C, D e E. No tubo A adicionou-se 2 mL de óleo de soja e 5 mL de solução de KOH a 5%, misturando-as e levando a banho-maria fervente por 5 minutos. No tubo B adicionou-se 2 mL de água e 2 mL de óleo, agitou-se e foi aguardado 10 minutos. No tubo C adicionou-se 2 mL de água, 2 mL de óleo e 1 mL de sabão, agitando em seguida. No tubo D adicionou-se 2 mL de água e 1 mL de sabão, agitou-se vigorosamente. No tubo E foi adicionado 2 mL de sabão e 0,5 de solução de cloreto de cálcio. Observou- se e os resultados foram anotados. 
Os materiais utilizados no experimento de saponificação podem ser observados na Tabela V.
Tabela V: Materiais utilizados no experimento.
	MATERIAIS
	QUANTIDADE
	CAPACIDADE
	Tubo de ensaio
	5
	-
	Estante para tubos
	1
	-
	Pipeta graduada
	1
	5 mL
	Pipeta graduada
	1
	2 mL
	Pipeta graduada
	1
	1 mL
	Béquer
	1
	250 mL
	Pêra de sucção
	1
	-
Fonte: Acervo próprio, 2019.
Os reagentes utilizados no experimento de saponificação podem ser observados na Tabela VI.
Tabela VI: Reagentes utilizados no experimento.
	REAGENTES
	QUANTIDADE
	Solução alcóolica de KOH a 5%
	5 mL
	Água destilada
	6 mL
	Óleo de soja
	6 mL
	Solução de CaCl2 a 10%
	0,5 mL
Fonte: Acervo próprio, 2019.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Hidrólise ácida do amido 
O experimento da hidrólise ácida do amido foi observado qualitativamente. Para que essa reação aconteça é necessário aquecer a solução em banho-maria, desta forma o amido é hidrolisado transformando-se em glicose como produto final e obtendo como produtos intermediários dextrinas e oligossacarídeos, sendo que estes obtêm colorações diferentes com relação ao tempo em que permanecem em banho-maria. A coloração ideal obtida é gradual crescente nos tons de amarelo/laranja/vermelho para o método DNS de determinação de açucares redutores (glicose) e tons de azul/roxo para o método com Lugol (pigmentação das dextrinas). Os resultados visuais das amostras após a reação com o DNS e com o lugol são apresentados na Tabela VII.
Tabela VII: Aspecto visual das amostras retiradas durante o experimento da hidrólise ácida do amido:
	Amostra
	Cor amostra reagida com DNS + NaOH
	Cor da amostra reagida com lugol
	Solução de amido 1%
	Amarelada
	Amarronzada
	Solução de amido 1% com HCl sem aquecimento
	Amarelo-Alaranjada
	Amarronzada
	Solução de amido 1% com HCl, após 10 minutos de aquecimento
	Laranja
	Preto com leve tom roxo
	Solução de amido 1% com HCl, após 20 minutos de aquecimento
	Laranja escura
	Preto com leve tom roxo
	Solução de amido 1% com HCl, após 30 minutos de aquecimento
	Vermelho
	Preto – café
	Solução de amido 1% com HCl, após 40 minutosde aquecimento
	Vermelho escura
	Preto – café
	Água destilada com aquecimento
	Amarelada
	Amarronzada
Fonte: Acervo próprio, 2019.
Nas séries que continham solução de amido 1%, observou-se uma coloração escura pois houve uma reação do iodo com o amido, que ao interagir com a amilose garante a coloração formando um complexo de cor intensa. Entretanto o resultado esperado seria um tom azul ou roxo, um possível erro para a que isso ocorresse foi a alta concentração de polissacarídeos de cadeia longa, tonando parte da amostra insolúvel. 
A medida que o aquecimento e a hidrólise progrediram, houve maior solubilização dos polissacarídeos, reduzindo o tamanho das cadeias e por essa razão as amostras tomaram um tom preto- café. Os sacarídeos de cadeias menores, bem como a amilopectina não formam o complexo, desta forma, a coloração se torna menos intensa. Assim, gradativamente os tubos contendo lugol tiveram a coloração alterada, hidrolisando o amido, e formando a glicose como produto final.
Extração do DNA do morango
	
	O DNA molécula longa, constituída por uma sequência de nucleotídeos, formado por três diferentes tipos de moléculas: um açúcar (pentose), um grupo fosfato, e uma base nitrogenada (adenina, citosina, timina, guanina). A visualização e extração do DNA foram possíveis devido ao tratamento no qual o morango foi submetido. 
A maceração aumentou a superfície de contato com a solução de lise e melhor a ação da solução sobre as células, fazendo com que a solução chegasse com maior facilidade a membrana celular. Isto permitirá a liberação de uma maior quantidade de moléculas de DNA e, portanto, um bom rendimento.
	O detergente, com sua propriedade de emulsificação, afeta a permeabilidade das membranas, que são constituídas, em parte, por lipídeos. Com a ruptura das membranas os conteúdos celulares, incluindo as proteínas e o DNA, são liberados e dispersam-se na solução. A adição do sal no início da experiência contribui com íons positivos e negativos. Os positivos neutralizam a carga negativa dos grupos fosfato do DNA, e os negativos das histonas (proteínas que funcionam como matriz no qual o DNA se enrola), permitindo que o complexo DNA + histonas não se enovele. Um outro fato, é que o sal aumenta a densidade do meio, o que facilita a migração do DNA para o álcool.
	Já o etanol gelado diminui a solubilidade do DNA com a ajuda do sal adicionado inicialmente. O DNA, menos solúvel em álcool, formará um aglomerado que precipitará junto com outras moléculas. Adicionar o álcool gelado em velocidade lenta auxilia na eficiência de precipitação do DNA.
Reação de saponificação
	
	Os sabões são derivados de ácidos graxos, formados pelo aquecimento de um triacilglicerol com um álcali, como hidróxido de sódio. Esse processo é denominado saponificação. O tratamento rompe as ligações éster e converte o triacilglicerol de volta a seus ácidos graxos componentes, que formam sais com o cátion do álcali, o sódio no caso do hidróxido de sódio (BROWN, 2018). A reação de saponificação (Figura I) é caracterizada como uma neutralização. Os radicais R representam cadeias carboxílicas longas; o KOH e NaOH possibilitam a fabricação de um sabão mole e de um sabão duro, respectivamente (BARATA, 2003).
Figura I: Reação de Saponificação utilizando o Hidróxido de Potassio (KOH).
Fonte: http://www.dbm.ufpb.br/. Acesso em 31 mar. 2019.
	O experimento foi efetuado em 5 tubos de ensaios diferentes sendo classificado em: tubo A; reação de saponificação, tubo B; controle do teste de emulsão, tubo C; teste de emulsão, tubo D; teste de espuma e tubo E; teste de precipitação.
	No tubo A o óleo reage com a solução de KOH em banho-maria, formando sais de potássio. Apresentando coloração levemente amarelada. 
	No tubo B observa-se uma diferença de polaridade e densidade, pois a água é polar e o óleo apolar havendo a separação dos reagentes.
	No tubo C, verificou-se a capacidade de limpeza do sabão, isso ocorre porque o sabão apresenta uma parte polar, sendo solúvel em água, sendo hidrófila (que possui afinidade com a água) e uma parte apolar, sendo insolúvel em água e hidrofóbica(afinidade com óleos e gorduras).
	No tubo D a mistura entre água e sabão formou espuma com agitação. A formação das bolhas ocorre pela interação da superfície da água com o ar, assim as moléculas de sabão se organizam formando uma película artificial na água, quando agitado, o ar é envolto pelo líquido formando as bolhas. Isso se dá pela redução da tensão superficial. 
	No tubo E formou-se um precipitado branco, isso representa uma baixa eficiência quando o sabão está presente em água dura. Resultado da reação entre o sabão e a solução de cloreto de cálcio. 
CONCLUSÃO
	A pratica possibilitou o estudo de algumas biomoléculas. Com o procedimento feito, foi possível extrair o DNA do morango através de um método simples, para isso, três etapas contribuíram na extração dessa molécula. Na primeira, foi possível destruir a parede celulósica que envolve a célula. Na segunda etapa, o detergente foi responsável pelo rompimento da membrana citoplasmática e da liberação do DNA. E assim, a partir da adição de álcool, foi possível separar essa molécula do resto do morango. Com esse experimento, prova-se a existência do DNA através dos resultados obtidos, bem como sua baixa solubilidade e densidade, além de suas ligações fracas feitas por ponte de hidrogênio. O procedimento realizado com o morango foi satisfatório, já que foi possível a visualização da molécula de DNA. O processo de hidrólise do amido obtém como produto final a glicose, sendo um açúcar redutor. Assim, ao passo que ocorre a diminuição do amido a glicose é formada proporcionalmente, o procedimento apresentou falhas em sua execução. Na reação de saponificação o óleo de soja foi submetido à reação com hidróxido de sódio para a formação de um sal de ácido graxo. Foram observadas propriedades como: formação de espuma, emulsificação e precipitação.
	Através das observações realizadas durante o processo, pode-se inferir que a metodologia empregada para o desenvolvimento do mesmo se mostrou adequada para abordar a análise estrutura e funcional dos diferentes grupos de biomoléculas. 
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