curva padrão de pnp e cinetica enzimatica

Prévia do material em texto

Coordenadoria de Farmácia
Curso de Bioquímica
Prática: Curva padrão do PNP e Cinética enzimática
Alunos: Júlia Cardoso, Yasmin Thallia, Luan Letieri, e Caio Martoreli
Turma: FM161
Professores: Gisele Silva e Marcio Loureiro
Data da realização da prática: 27/04/2018 e 04/05/2018
Data da entrega do relatório: 25/05/2018
Critério:
Nota:
Apresentação
Introdução
Objetivos
Métodos
Resultados
Discussão
Bibliografia
Total:
 Avaliação:
Introdução
1.1. Visão geral sobre enzimas
As enzimas são catalisadores biológicos altamente seletivos de natureza, em maioria, proteica, também existindo em casos com natureza proveniente de RNA – chamadas de ribozimas. Sua composição lhe garante conformação espacial própria indispensável para seu funcionamento efetivo. 
Sua função essencial é de catálise de reações acelerando processos com ligantes próprios, chamados substratos, aumentando a velocidade e diminuindo a energia de ativação do processo. As interações entre esses, lê-se enzima e substrato, são de natureza fraca possibilitando contorções e prevendo mecanismos de ação para o grupo de macromoléculas. Vale ressaltar que, uma vez com ação catalítica, as enzimas não são consumidas e não participam da reação, não alterando o equilíbrio reacional. Dessa maneira, as enzimas conseguem estar presentes em reações de diferente caráter. Por fim, a cinética enzimática pode averiguar melhor o sistema da relação entre enzimas, substratos e o produto formado. 
 1.2. Cinética enzimática
A cinética enzimática é o campo específico do estudo de enzimas que trata sobre sua função principal estudando a velocidade das reações envolvidas e também os fatores influentes nas variantes experimentais.
A concentração do reagente implica sobre um princípio geral da cinética diferenciador das reações com e sem enzimas: saturação com o substrato. Tal que elucida-se um gráfico característico: 
Informações muito importantes podem ser retiradas desse, como a velocidade inicial (Vo), a velocidade máxima (Vmáx) e o Km (discutido a frente). Atentando aos dois primeiros conceitos, a velocidade inicial, em concentrações baixas de substrato, segue proporcionalmente à concentração deste, graficamente expresso por uma reação de primeira ordem. Ao longo do gráfico, porém, nota-se que existe a formação de um plator, com reação de ordem zero (ou seja, aquelas que o aumento entre eixos não segue alterando-se mutuamente) na qual atinge-se a velocidade máxima da atividade catalítica da enzima.
A partir do efeito notório de saturação enzimática, algumas hipóteses puderam ser postuladas. A teoria da ação e cinética desenvolvida por Michaelis e Menten estabelece a reação enzimática segundo a seguinte reação:
Enzima + Substrato   [EnzimaSsubstrato]  Enzima + Produto
 
As moléculas de substrato passam por uma série de variações conformacionais e elétricas até alcançarem um estado complexante que as liga às enzimas. Uma vez, que as enzimas têm maior afinidade por estados de transição sendo esse conjunto mais instável, maior determinante da taxa de reação. Como essa interação abaixa o nível energético dos intermediários reativos, as enzimas são capazes de acelerar a velocidade das reações.
A velocidade foi então arranjada em uma equação por esses pesquisadores que permite demonstrar a variação da concentração de substratos, assim: 
Relaciona-se portanto Vo e Vmáx (já descritos anteriormente) com uma constante proposta pelos pesquisadores chamada constante de Michaelis-Menten (Km). O Km corresponde a concentração de substrato correspondente a metade do estado independente de velocidade máxima. Essa constante é muito importante não apenas matematicamente como também para avaliação da afinidade de enzimas, uma vez calculando a taxa de associação e dissociação do complexo. 
O sistema desenvolvido por Michaelis e Menten é bem elucidativo para o comportamento de apenas uma enzima. Para mais enzimas, onde geralmente pode ocorrer transferência de grupamentos funcionais e a ligação entre enzima e substrato não necessariamente ocorre na forma direta. 
Um gráfico linear pode elucidar o comportamento de enzimas, sendo obtido por valores recíprocos em ambos os lados chamado gráfico de Lineweaver- Burk ou, simplesmente, gráfico duplo-recíproco.
Alguns fatores podem alterar a cinética da reação como temperatura, pH e a ação de inibidores. Os inibidores funcionam com mecanismo reversível ou irreversível. Compreendendo o conjunto dos primeiros: inibidores competitivos, incompetitivos, mistos e não-competitivos. Já compreendendo o conjunto dos segundos: inibidores suicidas, análogos de estado de transição e análogos de substrato. 
Objetivos
 A partir da confecção da curva padrão de PNP é possível definir o gráfico do curso temporal da velocidade das reações enzimáticas da fosfatase alcalina. Assim, pode-se determinar e reproduzir graficamente a influência de determinadas situações como na presença de inibidores, em variações de temperatura, em diferentes pHs e em distintas concentrações de substrato na velocidade das reações dessa enzima.
Objetivos
3. Material e métodos
3.1. Material
Solução padrão de p-nitrofenol (PNP) 0,1mM em tampão TrisHCL pH 9,5
Solução de p-nitro-fenol-fosfato (PNPP) 1mM em tampão Tris HCL pH 9,5
Solução tampão Tris-HCL 0,2 M, pH 7,5 ; 8,5 e 9,5 de 
Solução de Na2HPO4 12mM en tampão Tris-HCL 0,2M pH 9,5 
Soluções tampão borato-NaOH 0,3 M pH 9,5; 10,5 e 11,5
soluções tampão citrato HCL 0,2 M , pH 5,5; 6,5 e 7,5
solução NaOH 2 M 
Solução de enzima: fosfatase alcalina (EC 3.1.3.1) µg/ml 
Pipetador  automático 20-100 µL
Pipetador  automático 200-1000 µL
Tubos de ensaio
Vortex
Banho de gelo (0 °C)
Banho-maria  (37°C)
Banho-maria(68°C)
Placa de 96 poços para leitor de elisa 
Leitor de elisa 
3.1. Material
3.2. Métodos
3.2.1. Curva padrão de PNP
Inicialmente, transferiu-se, com auxílio de uma pipeta automática, alíquotas das soluções indicadas abaixo para tubos devidamente rotulados seguindo a ordem expressa na tabela.
	 Tubos
	Solução padrão de PNP (µL)
	Tampão Tris-HCl, pH 9,5 (µL)
	Solução de NaOH (µL)bv
	B
	0
	800
	200
	1
	75
	725
	200
	2
	150
	650
	200
	3
	225
	575
	200
	4
	300
	500
	200
	5
	375
	425
	200
	6
	450
	350
	200
	7
	525
	275
	200
Obs: volume final dos tubos = 1000µL
Após todos os tubos terem sido homogeneizados, foi transferido 200µL de cada um deles para uma placa de 96 poços para leitura posterior em 405nm no leitor de Elisa.
3.2.2. Curso temporal
	Primeiramente foi preparada uma solução contendo a o tampão e o substrato. Foi utilizada uma placa de 96 poços para realizar a medição de absorbância no leitor Elisa. Após a placa pronta, a solução foi transferida para a placa onde recebeu a enzima, para que a primeira medição fosse a mais próxima possível do início da reação. Todas os poços no final ficaram contendo 200µL de solução total.
As proporções da solução final seguem as seguintes medidas mostradas na tabela.
	Tampão Tris-HCl
pH 9,5 (µL)
	PNPP 1 mM (µL) 
	Enzima (µL)
	125
	62,5
	12,5
	Após o início da medição, o leitor Elisa continuou fazendo medições durante uma hora em intervalos de três minutos cada.
3.2.3. Influência da temperatura
	
	 Primeiramente rotulou-se oito tubos de ensaio como segue a tabela , e com o auxilio de uma pipeta automática foi-se adicionados em sequência a cada tubo tampão Tris-HCL ph 9,5 e PNPP 1mM ,após isso os tubos foram homogeneizados manualmente e postos em um pré-encubação durante 5 minutos em temperaturas diferentes, os tubos b1 e 1 foram expostos a uma temperatura de 4 °C, os tubos b2 e 2 foram mantidos na temperatura ambiente , os tubos b3 e 3 foram postos em banho-maria a uma temperatura de 37°C e os tubos b4 e 4 a um banho-maria de temperatura de 68 °C. Após esse período adicionou-se NaOH 2M e enzima aos tubos b1, b2, b3, b4 homogeneizando-os manualmente e os devolvendo a suas temperaturas de pré-incubação.Nos tubos 1, 2, 3, e 4 foi-se adicionado enzima com intervalos de exatos 1 minutos entre eles, homogeneizando-os e os devolvendo as suas respectivas temperaturas de pré-incubação também. Após um período de 30 minutos, para cada tubo, adicionou-se uma solução de NaOH aos tubos 1, 2, 3, e 4 homogeneizando-os, posteriormente transferiu-se 200 μL de cada tubo para uma placa de 96 poços para que houve-se a leitura de absorbância em um leitor de Elisa.
	 
Numeração 
 Tubo 
	
Tampão Tris-HCL ph 9,5 (µl)
	
PNPP 1 mM (µl)
	
Temperatura (°C)
	
Enzima (µl)
	
Solução de NaOH (µl)
	1b
	500
	250
	4
	50
	200
	1
	500
	250
	4
	50
	200
	2b
	500
	250
	Ambiente
	50
	200
	2
	500
	250
	Ambiente
	50
	200
	3b
	500
	250
	37
	50
	200
	3
	500
	250
	37
	50
	200
	4b
	500
	250
	68
	50
	200
	4
	500
	250
	68
	50
	200
3.2.4. Influência do pH 
Rotulou-se doze tubos de ensaio de B 1-3, B 4-6, B 7-9, e de 1 a 9 - sendo o tubo B 1-3 referente ao branco dos tubos 1 ao 3, tubo B 4-6, branco dos tubos 4 ao 6 e B 7-9, branco dos tubos 7 ao 9. Com o auxílio de pipeta volumétrica, foi adicionado a todos soluções tampão, tal que: dos tubos B 1-3 ao 3, solução tampão citratato – HCl 500 µl com pH de 6,5, 5,5, 6,5 e 7,5, respectivamente; dos tubos B 4-6 ao 6, solução tampão Tris-HCl 500 µl com pH de 8,5, 7,5, 8,5 e 9,5, respectivamente; e dos tubos B 7-9 ao tubo 9, solução tampão borato-NaOH 500 µl com pH 10,5, 9,5, 10,5 e 11,5, respectivamente. 
Uma vez com solução tampão em todos os tubos, foi adicionado PNPP 1 mM a todos. O processo se diferencia com adição de 50 µl de enzima aos tubos, com exceção dos brancos, com intervalo de 5 segundos entre cada tubo no sentido crescente. Em todos foi submetida homogeneização manual e incubação por 30 minutos. Para paralisar a reação, ao fim, foi adicionado 200 µl de NaOH 2M concordando com os intervalos de 5 segundos entre cada tubo.
Para os brancos, B 1-3, B 4-6 e B 7-9, o protocolo seguido ocorreu no sentido contrário: adicionou-se primeiramente 200 µl de NaOH 2M seguida de adição de 50 µl de enzima.
Após transferência de 200 µl de cada solução dos 12 tubos para placa de 96 poços e submetida a leitura da absorbância em 405 nm, calibrado com o branco.
	Tubos
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
3.2.5. Curva de substrato
Primeiramente, alíquotas das soluções abaixo foram transferidas para tubos de ensaio rotulados seguindo a ordem da tabela, com exceção do NaOH e da enzima. No branco (tubo B), foi colocada a enzima e logo após a solução de NaOH. Com o auxílio da pipeta automática, adicionou-se a enzima nos tubos 1 a 13 com intervalos de 20 segundos e homogeneização. Os tubos foram incubados a temperatura ambiente por 30 minutos a partir do horário exato do início do ensaio. Após esse tempo, a reação foi paralisada com a adição de NaOH nos mesmos tubos com intervalos de 20 segundos e homogeneização. Em seguida, transferiu-se 200µL para uma placa de 96 poços para leitura posterior em 405 nm.
	Tubo
	Tampão Tris-HCl pH 9,5
	PNPP 1mM (µL)
	Enzima (µL)
	Solução de NaOH (µL)
	B
	725
	25
	50
	200
	1
	725
	25
	50
	200
	2
	700
	50
	50
	200
	3
	675
	75
	50
	200
	4
	650
	100
	50
	200
	5
	600
	150
	50
	200
	6
	550
	200
	50
	200
	7
	500
	250
	50
	200
	8
	450
	300
	50
	200
	9
	375
	375
	50
	200
	10
	300
	450
	50
	200
	11
	225
	525
	50
	200
	12
	150
	600
	50
	200
	13
	75
	675
	50
	200
3.2.6. Influência do inibidor
	Previamente, foram transferidas alíquotas das soluções indicadas abaixo para tubos identificados segundo a tabela, exceto a solução de enzima e de NaOH. No tubo B, a ordem é enzima e depois NaOH. Enquanto nos tubos de 1 a 13, em intervalos de 20 segundos, foi adicionada a solução de enzima seguida de homogeneização. Após 30 minutos de reação a temperatura ambiente, a paralisação foi feita com NaOH com intervalos de 20 segundos mais homogeneização. Em seguida, foram transferidas alíquotas de 200µL de cada tubo para uma placa de 96 poços para leitura posterior em 405 nm. 
	Tubo
	Tampão Tris-HCL pH = 9,5
	PNPP 1mM (µL)
	Inibidor (µL)
	Enzima (µL)
	Solução de NaOH (µL)
	B
	650
	25
	75
	50
	200
	1
	650
	25
	75
	50
	200
	2
	625
	50
	75
	50
	200
	3
	600
	75
	75
	50
	200
	4
	575
	100
	75
	50
	200
	5
	525
	150
	75
	50
	200
	6
	475
	200
	75
	50
	200
	7
	425
	250
	75
	50
	200
	8
	375
	300
	75
	50
	200
	9
	300
	375
	75
	50
	200
	10
	225
	450
	75
	50
	200
	11
	150
	525
	75
	50
	200
	12
	75
	600
	75
	50
	200
	13
	0
	675
	75
	50
	200
Resultados
4.1. Curva padrão de PNP
Para analisar o comportamento da enzima a partir da construção da curva padrão de PNP, foram feitas leituras no leitor de elisa com o intuito de obter a absorbância de cada uma das misturas presentes nos tubos. A tabela abaixo apresenta os resultados alcançados e, o gráfico que representa a curva padrão e a equação da reta estão em anexo. Além dessas informações, está demonstrado o cálculo feito para descobrir o número de nmoles presentes na amostra.
Cálculo geral do número de nmoles de PNP
Ci x Vi = Cf x Vf .·. 0,1 x Vi = Cf x 1000
Substituindo no tubo 1: 0,1 x Vi = Cf x 1000
 0,1 x 75 = Cf x 1000
 7,5/1000 = Cf
 Cf = 0,0075 mM = 7500 nm/mL = 7,5 nm/L
Substituindo no tubo 2: 0,1 x Vi = Cf x 1000
 0,1 x 150 = Cf x 1000
 15/1000 = Cf
 Cf = 0,015 mM = 15000 nm/mL = 15 nm/L
Substituindo no tubo 3: 0,1 x Vi = Cf x 1000
 0,1 x 225 = Cf x 1000
 22,5/1000 = Cf
 Cf = 0,0225 mM = 22500 nm/mL = 22,5 nm/L
Substituindo no tubo 4: 0,1 x Vi = Cf x 1000
 0,1 x 300 = Cf x 1000
 30/1000 = Cf
 Cf = 0,030 mM = 30000 nm/mL = 30 nm/L
Substituindo no tubo 5: 0,1 x Vi = Cf x 1000
 0,1 x 375 = Cf x 1000
 37,5/1000 = Cf
 Cf = 0,0375 mM = 37500 nm/mL = 37,5 nm/L
Substituindo no tubo 6: 0,1 x Vi = Cf x 1000
 0,1 x 450 = Cf x 1000
 45/1000 = Cf
 Cf = 0,045 mM = 45000 nm/mL = 45 nm/L
Substituindo no tubo 7: 0,1 x Vi = Cf x 1000
 0,1 x 525 = Cf x 1000
 52,5/1000 = Cf
 Cf = 0,0525 mM = 52500 nm/mL = 52,5 nm/L
	Tubos
	nmoles de PNP (X)
	ABS - 405 nm (Y)
	B
	0
	0,059
	1
	7,5
	0,065
	2
	15
	0,133
	3
	22,5
	0,200
	4
	30
	0,280
	5
	37,5
	0,358
	6
	45
	0,409
	7
	52,5
	0,478
Obs: nos valores de abs acima, já está descontado o valor de abs do branco.
A partir dos resultados obtidos, é possível o cálculo da equação da reta. Sendo b igual a 0, já que a reta passa pela origem por iniciar com um tubo em que não há a presença de produto, temos:
y = ax+b (equação geral) .·. y = ax+0 .·. y = ax 
Calculando o coeficiente angular a partir dos valores de concentração do substrato e de absorbância, obtemos:
Tubo 1 e 2 (Inclinação da reta):
y2 - y1/x2 - x1 = (0,133 - 0,065)/(15 - 7,5) = 0,009066666
Logo, a equação da reta corresponde a:
y = 0,009x
4.2. Curso temporalNa prática de curso temporal é visado observar o comportamento da velocidade ao longo de um certo período de tempo. Por isso a placa de 96 poços é submetida a uma análise de duração de 60 minutos, tendo uma agitação e medição feita a cada 3 minutos no leitor Elisa. 
Sabendo que ao início da reação (momento 0) a quantidade de produto é quase nula, é necessário fazer deste momento um branco. Para que a absorbância causada pelo substrato e pela enzima possa ser desconsiderada e assim seja possível observar apenas a absorbância causada pelo produto. A tabela abaixo relaciona a quantidade de absorbância medida em cada um dos intervalos já desconsiderando a absorbância do branco
 
 
Figura 1 - Tabela de dados entre absorbância e intervalos de análise
4.3. Influência da temperatura 
Para que houves-se um melhor entendimento dos dados obtidos sobre o efeito da temperatura sobre as proteínas foi feito uma tabela que relacionavarelacionando a as temperaturas sob em que cada tubo foi exposiçãoto com os valores de absorbância medidos pelo leitor de Elisa.
	
Numeração
Tubo
	
Temperatura
Ra (°C)
	
ABS
405 nm
	1b
	4
	0,051
	1
	4
	0,134
	2b
	Ambiente
	0,055
	2
	Ambiente
	0,413
	3b
	37
	0,068
	3
	37
	0,470
	4b
	68
	0,084
	4
	68
	0,105
	
	Com os resultados das absorbâncias obtidos pode-se calcular a velocidade das reações enzimáticas. Primeiramente subtraindo os valores das absorbâncias de seus respectivos brancos e utilizando da equação da reta (conseguida na prática de curva padrão PNP) para que se obtenha a concentração e a dividindo pelo tempo em que a reação foi mantida (30 minutos). Assim podendo ser confeccionado o gráfico de barras que relaciona a influência da temperatura em uma reação enzimática.
cálculos :
Equação da reta: Y = 0,009X
ABS 1 : 0,134 - 0,051 = 0,085 [equação da reta] = 9,4444 nm ÷ 30 = 0,314814814 nm/min será a velocidade inicial do tubo 1 
ABS 2 : 0,413 - 0,055 = 0,358 [equação da reta] = 39,7778 nm ÷ 30 = 1,325925926 nm/min será a velocidade inicial do tubo 2
ABS 3 : 0,470 - 0,068 = 0,402 [equação da reta] = 44,6667 nm ÷ 30 = 1,48889 nm/min será a velocidade inicial do tubo 3
ABS 4 : 0,105 - 0,084 = 0,021 [equação da reta] = 2,3333 nm ÷ 30 = 0,0777 nm/min será a velocidade inicial da reação do tubo 4
4.4. Influência do pH
Para a notação da influência do pH, a medição no leitor Elisa gerou no total 12 valores de absorbância, sendo o primeiro deles o branco que foi descontado dos outros valores.
	Tubos
	pH
	Absorbância
	Concentração (nmol/ml)
	Velocidade Inicial (nmol/min)
	B 1-3
	6,5
	0,064
	-
	-
	1
	5,5
	0.084
	2,23
	0,074074074
	2
	6,5
	0.129
	7,23
	0,24074074
	3
	7,5
	0.125
	6,78
	0,225925925
	B 4-6
	8,5
	0.055
	-
	-
	4
	7,5
	0.538
	53,7
	1,788888889
	5
	8,5
	0.490
	48,3
	1,611111111
	6
	9,5
	0.777
	80,2
	2,674074074
	B 7-9
	10,5
	0.055
	-
	-
	7
	9,5
	0.205
	16,7
	0,555555555
	8
	10,5
	0.126
	7,89
	0,262962963
	9
	11,5
	0.111
	6,23
	0,207407407
O cálculo das concentrações foi feito a partir da absorbância, já retirado o valor de branco, substituída como y da equação da reta de curva padrão de PNP, encontrada anteriormente na prática (y=0,009x). Uma vez encontrada a concentração do substrato de cada tubo, foi dividido pelo tempo decorrido de reação, conhecidamente 30 minutos, encontrando assim um valor de velocidade inicial em nmol/min.
Cálculos:
Abs 1: 0,084 – 0,064 = 0,020 [equação da reta] = 0,020 / 0,009 = 2,23 nmol/ml
2,23 nmol/ml / 30 minutos = 0,074074074 nmol/min
Vo= 0,074074074 nmol/min
Abs 2: 0,129 – 0,064 = 0,065 [equação da reta] = 0,065 / 0,009 = 7,23 nmol/ml
7,23 nmol/ml / 30 minutos = 0,24074074 nmol/min
Vo= 0,24074074 nmol/min
Abs 3: 0,125 – 0,064 = 0,061 [equação da reta] = 0,061 / 0,009 = 6,78 nmol/ml
6,78 nmol/ml / 30 minutos = 0,225925925 nmol/min
Vo= 0,225925925 nmol/min
Abs 4: 0,538 – 0,055 = 0,483 [equação da reta] = 0,483 / 0,009 = 53,7 nmol/ml
53,7 nmol/ml / 30 minutos = 1,788888889 nmol/min
Vo =1,788888889 nmol/min
Abs 5: 0,490 – 0,055 = 0,435 [equação da reta] = 0,435 / 0,009 = 48,3 nmol/ml
48,3 nmol/ml / 30 minutos = 1,611111111 nmol/min
Vo= 1,611111111 nmol/min
Abs 6: 0,777 – 0,055 = 0,722 [equação da reta] = 0,722 / 0,009 = 80,2 nmol/ml
80,2 nmol/ml / 30 minutos = 2,674074074 nmol/min
Vo= 2,674074074 nmol/min
Abs 7: 0,205 – 0,055 = 0,15 [equação da reta] = 0,15 / 0,009 = 16,7 nmol/ml
16,7nmol/ml / 30 minutos = 0,555555555 nmol/min
Vo= 0,555555555 nmol/min
Abs 8: 0,126 – 0,055 = 0,071 [equação da reta] = 0,071 / 0,009 = 7,89 nmol/ml
7,89 nmol/ml / 30 minutos = 0,262962963 nmol/min
Vo= 0,262962963 nmol/min
Abs 9: 0,111 – 0,055 = 0,056 [equação da reta] = 0,056 / 0,009 = 6,23 nmol/ml
6,23 nmol/ml / 30 minutos = 0,207407407 nmol/min
Vo= 0,207407407 nmol/min
4.5. Curva de substrato
	Para a curva de substrato, a medição no leitor Elisa gerou no total 14 valores de absorbância, sendo o primeiro deles o branco que foi descontado dos outros valores. A partir destes valores e das concentrações de substratos, foi calculada a velocidade que deixou possível a criação do gráfico que segue em anexo, além do gráfico duplo-recíproco que também segue em anexo. Ambos apresentam as retas de substrato e de substrato na presença de inibidor.
Figura 2 - Tabela de relação concentração de substrato e absorbância
	Para o cálculo da velocidade, foi necessário a utilização da equação da reta encontrada na curva padrão de PNP: y = 0,009x. Após calculado o "x", esse valor era divido por 30 ( tempo em minutos em que a reação ocorreu). Com isso era gerado um valor de velocidade em µM/min.
	Como exemplo do cálculo temos no tubo 2:
0,080 = 0,009x
x = 8,89 µM
8,89 µM / 30min = 0,0296 µM/min = V0
Figura 3 - Tabela de relação entre absorbância e velocidade inicial.
	Para a criação do gráfico duplo recíproco da curva de substrato, foi necessário fazer a divisão de 1 pelo valor tanto da concentração de substrato quanto da velocidade.
Figura 4 - Tabela de relação de valores obtidos com os necessários para a construção do duplo recíproco.
4.6. Influência do inibidor
	Assim como a curva de substrato, a influência de inibidor também foi posta no leitor Elisa e gerou 14 valores de absorbância sendo o primeiro deles o branco que foi descontado dos outros valores. Além disso sua reta gerada por esses valores e os valores de velocidade da reação também está presente nos dois gráficos anexados que foram citados na curva de substrato.
Figura 3 - Tabela de relação concentração de substrato e absorbância
	O mesmo tipo de cálculo utilizado na curva de substrato para calcular a velocidade da reação foi utilizado na influência de inibidores, gerando assim a seguinte tabela com os valores:
		Figura 4 - Tabela de relação absorbância e velocidade
Para a criação do duplo recíproco foi necessária a divisão de 1 pelos valores de concentração e de velocidade. A tabela a seguir mostra essa relação de valores.
Figura 5 - Tabela de relação de valores obtidos com os necessários para a construção do duplo recíproco.
Discussão
5.1. Curva padrão de PNP
	A partir da curva da padrão obtida, é possível concluir que o aumento da concentração de produto e da absorbância é proporcional. Uma vez que a absorção da radiação emitida sobre a amostra depende do número e do arranjo dos elétrons nas moléculas ou íons presentes na solução, ou seja, do arranjo do PNP (produto).
5.2. Curso temporal
A absorbância será um valor apresentado pelo leitor Elisa que mede a quantidade de luz absorvida em um certo material. Quando se mede um material com objetivo de observar a cinética enzimática, é preciso fazer um branco para desconsiderar a absorbância apenas do substrato e da enzima.
Feito isso, os próximos valores de absorbância serão referentes unicamente às concentrações de produto no meio. Ao longo do tempo é possível perceber que a absorbânciaapresenta um valor crescente. Isso porque a concentração de produto vai aumentado em razão da ação da enzima no meio.
Uma reação enzimática apresenta uma velocidade inicial da reação que seria a velocidade nos primeiros 60 segundos em que a enzima entrou em contato com o substrato. Isso se dá, pois no meio ainda não há presença de produto, por isso a velocidade vai depender apenas do substrato e do conjuntos de condições no momento (pressão, temperatura, etc.).
 
 Figura 6 - relação entre velocidade e concentração de produto
Após o primeiro instante, a velocidade da reação não será apenas proporcional a concentração de substrato presente, mas essa será influenciada pelo equilíbrio total da reação. Sendo assim tanto substrato quanto produto irão influenciar em seu crescimento.
É observável que após uma crescente linear, a velocidade da reação vai criando um tipo de parábola(figura 2). Neste momento temos que a complexação de enzima com substrato será um fator que interferirá no aumento da velocidade, além da proximidade cada vez maior do equilíbrio da reação. 
Em uma reação enzimática, não se terá apenas uma etapa da reação, mas sim haverá etapas rápidas e uma etapa lenta que definirá a velocidade da reação (etapa limitante). Essas etapas incluem a de ligação entre substrato e enzima,formação de complexo ES e de liberação enzima e produto. A combinação de uma enzima com a molécula do substrato formando um complexo ES é uma etapa necessária na catálise enzimática.
A enzima primeiramente combina-se de modo reversível com o substrato, formando um complexo enzima-substrato em uma etapa reversível e relativamente rápida:
E + S ES
Após isso, o complexo é rompido e a enzima é liberada com o produto em uma reação lenta:
ES E + P
Essa etapa por ser lenta será a etapa que irá limitar a velocidade da reação, tendo assim que a velocidade total deverá ser proporcional às espécies nela presentes ou seja, ES.
Em baixa concentração de substrato, a maior parte da enzima está na forma não combinada E. Assim, a velocidade é proporcional ao substrato porque o equilíbrio da reação é deslocado na direção da formação de mais ES à medida que substrato é colocado no meio.
A velocidade inicial máxima de uma reação catalisada (Vmáx) ocorre quando quase toda a enzima estiver presente como complexo ES e a concentração de enzima for desprezível. Nessas condições, a enzima está “saturada” com o substrato, e então um incremento de substrato não produz efeito na velocidade. Essa condição ocorre quando a concentração de substrato for alta o suficiente para que essencialmente toda a enzima livre se converta na forma ES. Após o rompimento do complexo ES, fornecendo produto, a enzima fica livre para catalisar a reação de mais uma molécula do substrato.
Figura 7 - relação entre concentração de substrato e velocidade
Comparando as duas retas dessa imagem fica claro como seria o aumento da velocidade se esta dependesse apenas da concentração de substrato, desrespeitando o equilíbrio.
Voltando para os valores encontrados na prática pelo leitor Elisa, é preciso analisar a quantidade de absorbância medida nos intervalos com a possível velocidade da reação.
Quando se compara os valores de absorbância obtidos é perceptível que há um declínio no crescimento ao longo do tempo, tal que no começo há uma grande variação do momento 0 para o momento 3 de 0,0743nm, apenas reafirmando a questão discutida em relação aos primeiros 60 segundos da reação onde se teria um grande aumento da quantidade de produto devido a velocidade inicial. Como a amostra não foi analisada nesse intervalo, não há como quantificar com maior precisão o crescimento da concentração de produto no meio.
Continuando a relacionar os valores, é possível observar que o acréscimo de absorbância vai diminuindo com o tempo, até o momento em que fica praticamente estável (intervalo 21), acrescentando aproximadamente 0,05nm para a absorbância.
Esse valores quando relacionados com a linha de velocidade no gráfico, conseguem mostrar que o possível decréscimo e depois a estabilização da quantidade de valor acrescentada, são resultados da proximidade da velocidade máxima, ou seja, a proximidade que o meio está de entrar em equilíbrio substrato-produto.
Por isso se relacionarmos as retas de relação substrato/velocidade inicial, mostradas anteriormente, podemos perceber que ao longo do tempo, essa relação vai caminhando no caminho inverso presente na figura 3, uma vez que quanto a maior formação de produto, menor será a concentração de substrato, logo a velocidade tem como ponto de partida a velocidade máxima e a partir dessa vai decaindo, mostrando assim a menor quantidade de valores de absorbância.
 
 Figura 8 - relação substrato/V0 em relação ao tempo
A reta vermelha da figura 4 mostra exatamente como seria o gráfico se fossemos relacionar a velocidade presente na reação com o passar do tempo.
Por isso podemos concluir que não só o substrato, mas como a formação de produto, de complexo ES e a proximidade do equilíbrio da reação, influenciam a velocidade da reação.
5.3. Influência da temperatura
	Nota-se a partir da análise do gráfico, que a temperatura apresenta uma grande influência na velocidade de uma reação enzimática, e pode-se identificar a temperatura de 37 graus Celsius como a mais adequada para atividade enzimática, pois foi onde apresentou a maior concentração de PNP após o tempo de teste. 
	Isso se deve pois o aumento de temperatura proporciona o aumento de energia cinética das moléculas participantes, ocasionando assim, a elevação da possibilidade dos choques efetivos entre as enzimas e os substratos, que é um dos principais fatores que favorece o aumento da velocidade da reação.
	 Entretanto o aumento da velocidade tem um limite, pois tendo em vista que a maioria das enzimas são formadas por proteínas, se houver uma elevação excessiva na temperatura do meio, ocorre a desnaturação das estruturas tridimensionais das proteínas impossibilitando assim, a formação do complexo enzima substrato. 
5.4. Influência do pH
Conhecidamente as enzimas têm sua atividade otimizada até certo valor de pH e entre determinada faixa. A partir dos resultados analisados em prática, pode-se construir um gráfico – em anexo - da atividade enzimática frente aos diferentes pHs de diferentes tampões. O melhor deles analisados foram as barras do gráfico referente a solução tampão Tris-HCl com pH de 8,5, 7,5, 8,5 e 9,5. Entre essas ainda, analisou-se que a melhor atividade dessa enzima é caracterizada por um pH ótimo de 9,5. Pode-se notar ainda um bom exemplo da atividade dessa enzima para além o valor ótimo: há drástica diminuição da sua velocidade de reação.
5.5. Curva de substrato e Influência do inibidor
	Em uma reação comum entre enzima substrato, tudo ocorreria bem e a velocidade máxima quanto o km seriam dependentes apenas das etapas e dos agentes envolvidos na reação. Mas quando se há a presença do inibidor, esse acaba passando a ser um fator importante na hora da construção de gráfico e na hora de calcular os outros fatores.
	Essas duas práticas agem em conjunto para que se possa ser feito uma comparação entre elas e que assim possa ser visto a ação do inibidor em um sistema real e não só na teoria.
	Quando compara-se os valores obtidos de absorbância nas duas práticas, tendo no sistema as mesmas concentrações, é evidente a diferença de produção de produto. Relacionando os tubos 2, 6, 8,12, 14, por exemplo, pode-se ver a real ação do inibidor do meio.
Figura 9 - Relação de absorbâncias entre soluções sem e com presença de inibidores
	Fica claro que o crescimento de produto é menor quando há presença de inibidor. 
	Levando isso em questão e já sabendo que existem diferentes tipos de inibidores, a construção de um gráfico duplo recíproco ( queencontrada está em anexo) se torna necessária. Assim com a análise deste gráfico fica possíveldeterminar o tipo de inibidor presente nessa solução.
	Para a construção do gráfico, devido a dispersão dos pontos, a utilização de um regressão linear se torna necessária. Assim é preciso construir uma tabela com os valores de x,y,xy,x2,y2; para que assim possa ser feita uma equação da reta que esteja na menor distância de todos os pontos.
Figura 10 - Tabela de relação de valores para a construção de gráfico duplo recíproco de curva de substrato.
Figura 11 - Tabela de relação de valores para construção de duplo recíproco de influência de inibidores.
	Após a construção dessa tabela, é necessária a aplicação desses valores na fórmula de regressão linear:
(n∑xy - ∑x∑y) / (n∑y - (∑x)2)
	A aplicação destes valores na fórmula gerou duas novas equações da reta:
Substrato: y = 0,0061x + 1,16
Influência de inibidor: y = 0,0091x + 2,59
	Essas equações foram utilizadas para marcar outros pontos nos dois gráficos e assim conseguindo a criação de duas retas onde o erro de cada ponto fosse o mínimo.
	Depois desta análise é possível concluir que provavelmente o tipo de inibidor será um misto, ou incompetitivo, uma vez que suas retas chegam a ter inclinação praticamente igual, mudando apenas 0,003 no seu valor. E por apresentarem valores de "b" diferentes, mostra que cruzarão o eixo "y" em locais distintos, por isso que a possibilidade de ser um inibidor competitivo é descartada. 
Conclusão
Apos o término destas práticas, foi possível identificar como diferentes fatores, como variações de temperatura e pH, diferentes concentrações de substrato e a atuação de inibidores reversíveis podem interferir em uma reação enzimática, possibilitando o aumento ou a diminuição de sua velocidade inicial ou inibindo  totalmente a reação por meio de desnaturação das proteínas que compõem as enzimas.
Bibliografia
Fundamentos da espectrofotometria. Disponível em: http://www.ufjf.br/quimica/files/2016/08/Espectrometria-UV-vis.pdf . Acesso em: 09 maio 2018.
NELSON, D.; COX, M. Princípios de Bioquímica de Lehninger: 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014
Atividades enzimáticas disponível em: http://www.ufrgs.br/alimentus1/pao/ingredientes/ing_enzimas_atividade.htm Acessado em 23 maio 2018 
Estudo da velocidade da reação enzimática e como ela se altera em função de diferentes parâmetros. Disponível em : http://www.fcav.unesp.br/Home/departamentos/tecnologia/luciamariacararetoalves/aula-7---cinetica-enzimatica.pdf 
Acessado em 23 maio de 2018