Roteiro - Streptococcus

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Sensibilidade à Bacitracina, 
O inóculo poderá ser obtido a partir do crescimento em meio de Todd Hewitt (T.H,) ou, quando possível, diretamente de colônias de ágar-sangue. O caldo T.H. pode ser substituído por outro que propicie crescimento abundante.
Semear em ágar-sangue uma área retangular (2cm de largura e 4cm de comprimento, aproximadamente). Depositar o disco de bacitracina no centro desta área. Incubar  35 a 37°C por 18 a 24 horas. Cada placa de ágar-sangue comporta 4 testes.
Normas recomendadas para a realização e interpretação do teste da bacitracina (Sonnenwirth, 1983):
 
ØUsar apenas discos de diferenciação com 0,04m. Os discos para antibiograma que contém lm não se prestam para os testes.
ØTrabalhar com inóculos espessos e de cultura pura, para evitar que espécies de outros grupos demonstrem falsa sensibilidade em decorrência da escassez de microrganismos.
ØTestar amostras comprovadamente beta-hemolíticas, pois alguns Streptococcus alfa também são sensíveis à bacitracina 0,04m.
ØConsiderar qualquer halo de leitura como sensível.
 
Sensibilidade à Optoquina.
A semeadura é feita como a descrita para a bactracina.
Incubar a 35°C 18 horas em microaerofilia.
Os halos de sensibilidade serão considerados em função do diâmetro dos discos.
Discos medindo 6mm   - halos 14mm ou mais: sensível
                                    - halos entre 6 a 14mm: questionável
Discos medindo10mm  - halos 16 ou mais: sensível
                                    - halos entre l0 a 16mm: questionável
Os testes questionáveis serão confirmados pela bile-solubilidade.
 
Prova Bile-Esculina
 A prova de Bile-Esculina baseiase na hidrólise de esculina em presença de bile por determinadas bactérias. As bactérias Bile-Esculina positivas cresem em presença de sais biliares. A hidrólise da esculina gera glicose e esculetina. A esculetina reage com íons férricos resultando em um complexo de cor preta.
lnocular duas a três colônias ou uma alçada de crescimento do meio de bile-esculina (item 8.5.21). Este meio é distribuído em tubos com camada inclinada. lnocular o bísel. lncubar a 35ºC, por 48 horas.
Considera-se a prova como positiva quando mais da metade do bísel ficar enegrecido em 48 horas.
 
Bile-Solubilidade
Este teste poderá ser realizado empregando-se meio de cultura liquido com crescimento de Streptococcus pneumoniae ou diretamente na placa de Petri com crescimento deste microrganismo. Neste caso, poderá ser aproveitada a placa utilizada no teste da optoquina, procurando analisar o crescimento mais afastado possível do disco.
A partir do crescimento em ágar-sangue, semear 3 a 4 colônias em caldo Todd-Hewitt ou caldo tripticase-soja (TSB), incubando de um dia para outro. Após crescimento, transferir 0,5ml para dois tubos estéreis de 13 x 100mm, adicionando em seguida vermelho-fenol (0,02%) e ajustando o pH na faixa de 7,0 com solução de hidróxido de sódio. Adicionar em seguida 0,5ml da solução de desoxicolato de sódio a 2% em um dos tubos e 0,5ml  de salina a 0,85% no outro tubo. Incubar a 35ºC e examinar de meia em meia hora no período de 2 horas. O teste será considerado positivo quando houver lise ou solubilidade dos microrganismos no tubo contendo desoxicolato de sódio. O tubo-controle com salina permanecerá turvo. Algumas cepas de Streptococcus pneumoniae apresentam uma solubilidade parcial. Neste caso, serão classificados como tal, quando o teste da optoquina for positivo
Como foi dito, pode-se realizar o teste da bile-solubilidade diretamente na placa de Petri com o crescimento em ágar-sange, onde foi realizado teste de optoquina. Neste caso, pinga-se uma gota de desoxicolato de sódio a 2%, incubando-se em seguida a 35°C, durante 30 minutos, mantendo-se a placa de Petri voltada para cima. A lise do crescimento é característica de Streptococcus pneumoniae
 Tolerância ao Cloreto de Sódio A 6,5%,
Inocular duas a três colônias em caldo cloretado (8.5.22). O teste será positivo quando houver turvação do meio indicando crescimento.
 Prova do CAMP
Semear em ágar-sangue uma única estria da amostra-padrão de Staphylococcus aureusprodutora de beta-hemolisina e, perpendicularmente a uma distância de 0,5 cm,  semear a amostra a ser testada, cuidando-se para que as estrias não se encontrem. Incubar entre 35 e 37ºC por l8 a 24 horas.
Em provas positivas, na região de confluência entre as linhas dos dois microrganismos, ocorre lise total das hemácias, com configuração de meia lua ou ponta de seta.