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Microbiologia - Diagnóstico Microbiológico das Infecções Provocadas por Cocos Gram-Positivos, Bastonetes Gram-Negativos Fermentadores e Não Fermentadores da Glicose, Anaeróbios, Micobactérias, Corineb

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SISTEMA DE ENSINO
MICROBIOLOGIA
Diagnóstico Microbiológico das 
Infecções Provocadas por Cocos Gram-
Positivos, Bastonetes Gram-Negativos 
Fermentadores e Não Fermentadores 
da Glicose, Anaeróbios, Micobactérias, 
Corinebactérias
Livro Eletrônico
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Diagnóstico Microbiológico das Infecções Provocadas por Cocos Gram-Positivos, 
Bastonetes Gram-Negativos Fermentadores e Não Fermentadores da Glicose, 
Anaeróbios, Micobactérias, Corinebactérias
MICROBIOLOGIA
Pollyana Lyra
Sumário
Apresentação .....................................................................................................................................................................3
Microbiologia: Diagnóstico Microbiológico das Infecções Provocadas por Cocos 
Gram-Positivos, Bastonetes Gram-Negativos Fermentadores e Não Fermentadores 
da Glicose, Anaeróbios, Microbactérias e Corinebactérias ....................................................................4
Meios de Cultivo ...............................................................................................................................................................6
Meios de Enriquecimento ............................................................................................................................................7
Obtenção de Culturas Puras ......................................................................................................................................7
Testes Bioquímicos e Identificação Bacteriana .............................................................................................7
Testes para Determinar o Tratamento Quimioterápico .............................................................................9
Meios e Métodos para o Crescimento de Microrganismos Anaeróbicos ..................................... 10
Coleta do Material para Diagnóstico de Microrganismos Anaeróbios ..........................................13
Produção de Anaerobiose .........................................................................................................................................14
Provas de Sensibilidade a Antimicrobianos...................................................................................................18
Cocos Gram Positivos..................................................................................................................................................19
Prova da Catalase .........................................................................................................................................................20
Identificação de Estafilococos..............................................................................................................................20
Identificação do Staphylococcus Aureus ........................................................................................................21
Teste da Novobiocina ................................................................................................................................................. 22
Teste da Oxidase ........................................................................................................................................................... 22
Bacilos Gram-Negativos não Fermentadores ..............................................................................................25
Semeadura, Leitura e Interpretação das Provas de Identificação ...................................................27
Enterobactérias Fermentadoras da Glicose ................................................................................................. 28
Principais Testes Utilizados para Identificação de Enterobactérias .............................................30
Principais Provas Bioquímicas ..............................................................................................................................33
Diagnóstico da Tuberculose ...................................................................................................................................34
Corynebacterium Spp .................................................................................................................................................35
Exercícios ...........................................................................................................................................................................37
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Diagnóstico Microbiológico das Infecções Provocadas por Cocos Gram-Positivos, 
Bastonetes Gram-Negativos Fermentadores e Não Fermentadores da Glicose, 
Anaeróbios, Micobactérias, Corinebactérias
MICROBIOLOGIA
Pollyana Lyra
Gabarito ..............................................................................................................................................................................43
Gabarito Comentado ...................................................................................................................................................44
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Bastonetes Gram-Negativos Fermentadores e Não Fermentadores da Glicose, 
Anaeróbios, Micobactérias, Corinebactérias
MICROBIOLOGIA
Pollyana Lyra
ApresentAção
Oi!
Sou eu novamente, enchendo a sua cabeça de informação, risos. Bom, hoje abordaremos 
as principais técnicas de identificação microbiológica de bactérias causadoras de infecções 
de importância clínica, com foco especial nos cocos gram-positivos, bastonetes gram-negati-
vos fermentadores e não fermentadores da glicose, bem como os microrganismos anaeróbios, 
micobactérias e corinebactérias.
Preparado(a)?
Então vamos iniciar!
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Bastonetes Gram-Negativos Fermentadores e Não Fermentadores da Glicose, 
Anaeróbios, Micobactérias, Corinebactérias
MICROBIOLOGIA
Pollyana Lyra
MICROBIOLOGIA: DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DAS 
INFECÇÕES PROVOCADAS POR COCOS GRAM-POSITIVOS, 
BASTONETES GRAM-NEGATIVOS FERMENTADORES 
E NÃO FERMENTADORES DA GLICOSE, ANAERÓBIOS, 
MICROBACTÉRIAS E CORINEBACTÉRIAS
O material nutriente preparado para o crescimento de micro-organismos em um laborató-
rio é chamado de meio de cultura. Algumas bactérias podem crescer bem em qualquer meio 
de cultura; outras requerem meios especiais, e outras ainda não podem crescer fora de or-
ganismos vivos. Os micro-organismos semeados em um meio de cultura para dar início ao 
crescimento microbiano são chamados de inóculo. Os micro-organismos que crescem e se 
multiplicam dentro ou sobre um meio de cultura são denominados cultura.
Para cultivar determinado micro-organismo, provindo de uma amostra clínica em parti-
cular, quais são os requisitos que o meio de cultura deverá apresentar?
Primeiramente, ele deverá conter os nutrientesadequados para o micro-organismo espe-
cífico que se deseja cultivar. Deve também possuir uma quantidade de água suficiente, um pH 
apropriado e um nível conveniente de oxigênio ou não possuir oxigênio, pois algumas bactérias 
são anaeróbias. O meio deve ser estéril, ou seja, deve inicialmente não conter qualquer tipo de 
micro-organismo vivo, garantindo assim que a cultura contenha somente os micro-organismos 
que nele foram introduzidos. A cultura em crescimento também deverá ser incubada a uma 
temperatura propícia ao crescimento do micro-organismo de interesse.
Existe uma grande variedade de meios para o crescimento de micro-organismos no labora-
tório, cada um deles servindo a propósitos específicos. A maioria desses meios, que estão dis-
poníveis em fontes comerciais, possui os componentes principais liofilizados e requer somen-
te a adição de água e a esterilização em autoclaves. Os meios de cultura são constantemente 
desenvolvidos ou melhorados para utilização no isolamento e na identificação de bactérias 
que são de interesse da microbiologia clínica, de alimentos e da água.
Quando se deseja o crescimento das bactérias em meio sólido, um agente solidificante, 
como o ágar, compõe o meio. O ágar, que é um polissacarídeo complexo derivado de uma alga 
marinha, tem sido utilizado há muito tempo para deixar alimentos como geleias e sorvetes 
mais espessos. Ele possui algumas propriedades muito importantes que o tornam valioso em 
microbiologia, nunca tendo sido encontrado um substituto satisfatório. Poucos micro-orga-
nismos podem degradar o ágar, o que permite que ele permaneça sólido. Além disso, o ágar 
se liquefaz a cerca de 100ºC (o ponto de ebulição da água), e ao nível do mar ele permanece 
líquido até a temperatura diminuir a cerca de 40ºC.
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Para utilização no laboratório, o ágar é mantido em banho-maria a 50ºC. Nessa temperatu-
ra, ele não destrói a maioria das bactérias quando adicionado sobre elas. Uma vez solidificado, 
ele pode ser incubado a cerca de 100ºC antes de se liquefazer de novo; essa propriedade é 
particularmente útil quando bactérias termófilas são cultivadas. Os meios com ágar geralmen-
te são contidos em tubos de ensaio ou placas de Petri.
A solidificação em tubos de ensaio é feita com o tubo inclinado em um ângulo que permita 
que uma grande área de superfície esteja disponível para o crescimento microbiano. Quando o 
ágar é solidificado em um tubo mantido na vertical, ele é chamado de profundo. As placas de 
Petri, por sua vez, são placas de vidro rasas com uma tampa que as recobre até o fundo para evi-
tar contaminações; quando preenchidas, são chamadas de culturas sólidas em placas de Petri.
Para favorecer o crescimento microbiano, o meio de cultura deve fornecer fontes de ener-
gia e de nutrientes, como carbono, nitrogênio, enxofre, fósforo e quaisquer outros fatores orgâ-
nicos de crescimento que o organismo necessite. Meio quimicamente definido é aquele cuja 
composição exata é conhecida. Para um quimio-heterotrófico, o meio quimicamente definido 
deve conter fatores de crescimento orgânicos que sirvam como fonte de carbono e energia. 
Por exemplo, a glicose é incluída no meio para crescimento da bactéria quimio-heterotrófica 
Escherichia coli. Muitos fatores de crescimento orgânicos devem ser fornecidos no meio qui-
micamente definido utilizado para cultivar uma espécie de Neisseria. Os organismos q u e 
requerem muitos fatores de crescimento são descritos como fastidiosos.
Os meios quimicamente definidos geralmente são reservados para trabalhos experimen-
tais no laboratório ou para o crescimento de bactérias autotróficas. A maioria das bactérias e 
dos fungos é cultivada em meios complexos feitos de nutrientes como extratos de leveduras, 
de carnes ou de plantas, ou produtos de digestão destas ou de outras fontes. A composição 
química exata varia um pouco de acordo com o lote.
Nos meios complexos, as necessidades de energia, carbono, nitrogênio e enxofre dos mi-
cro-organismos em cultura são fornecidas essencialmente pelas proteínas. Uma proteína é 
uma molécula grande e relativamente insolúvel que alguns micro-organismos podem utilizar 
diretamente, mas uma digestão parcial por ácidos ou enzimas reduz a proteína em cadeias 
de aminoácidos mais curtas, chamadas de peptonas. Esses fragmentos pequenos e solúveis 
podem ser digeridos pela maioria das bactérias. Vitaminas e outros fatores orgânicos de cres-
cimento são fornecidos pelos extratos de carne e de levedura. As vitaminas solúveis e os mi-
nerais das carnes e das leveduras são dissolvidos na água de extração, que é evaporada para 
concentrar esses fatores. Esses extratos de leveduras também fornecem nitrogênio orgânico 
e compostos de carbono. Os extratos de levedura são particularmente ricos em vitaminas B.
Se um meio complexo apresenta forma líquida, ele é chamado de caldo nutriente. Quando 
ágar é adicionado, ele é chamado de ágar nutriente, embora o ágar por si só não seja um nutriente.
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Meios de Cultivo
Na microbiologia clínica ou de saúde pública, frequentemente é necessário detectar a pre-
sença de micro-organismos específicos associados com doenças ou saneamento deficiente. 
Para esse propósito, meios seletivos e diferenciais são utilizados. Os meios seletivos são ela-
borados para impedir o crescimento de bactérias indesejadas e favorecer o crescimento dos 
micro-organismos de interesse. Por exemplo, o ágar sulfeto de bismuto é um meio utilizado 
para isolar a bactéria da febre tifoide, a gram-negativa Salmonella typhi, a partir das fezes. O 
sulfeto de bismuto inibe as bactérias gram-positivas e a maioria das bactérias intestinais gram-
-negativas (além de S. typhi). O ágar Sabouraud dextrose, com pH de 5,6, é utilizado para isolar 
os fungos que dominam a maioria das bactérias neste pH.
Os meios diferenciais, por sua vez, facilitam a diferenciação das colônias de um micro-orga-
nismo desejado em relação a outras colônias crescendo na mesma placa. De maneira similar, 
culturas puras de micro-organismos têm reações identificáveis com meios diferenciais em tu-
bos ou placas. O ágar sangue (que contém hemácias) é um meio utilizado com frequência para 
identificar espécies bacterianas que destroem hemácias. Essas espécies, como o Streptococ-
cus pyogenes, a bactéria que causa infecção de garganta, mostram um anel claro ao redor de 
suas colônias (β-hemólise), onde elas têm lisadas as hemácias circundantes.
Algumas vezes, as características seletivas e diferenciais são combinadas no mesmo meio. 
Por exemplo, se desejássemos isolar a bactéria Staphylococcus aureus, encontrada comumen-
te nas fossas nasais: este organismo é tolerante a altas concentrações de cloreto de sódio, além 
de poder fermentar o carboidrato manitol para formar ácido. O ágar hipertônico manitol contém 
7,5% de cloretode sódio, impedindo o crescimento de organismos competidores e, portanto, 
selecionando ou favorecendo o crescimento de S. aureus. Esse meio salino também contém 
um indicador de pH que muda de cor se o manitol do meio é fermentado a ácido. As colônias 
fermentadoras de manitol de S. aureus são, assim, diferenciadas das colônias de bactérias que 
não fermentam o manitol. As bactérias que crescem em concentração elevada de sal e fermen-
tam o manitol podem ser facilmente identificadas pela mudança de coloração. Provavelmente 
elas sejam colônias de S. aureus, e sua identificação pode ser confirmada por outros testes.
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Meios de enriqueCiMento
Como as bactérias em pequeno número podem não ser identificadas, principalmente se 
outras bactérias estiverem presentes em maior número, algumas vezes é necessário utili-
zar uma cultura de enriquecimento. Os meios enriquecidos mais utilizados geralmente são 
líquidos e fornecem nutrientes e condições ambientais que favorecem o crescimento de um 
micro-organismo específico e não de outros. Deste modo, também funcionam como meios 
seletivos, desenvolvidos para amplificar até níveis detectáveis um número muito pequeno do 
micro-organismo de interesse.
obtenção de CulturAs purAs
A maioria dos materiais biológicos infecciosos, como pus, escarro e urina, contém diversos 
tipos de bactérias, da mesma forma que amostras de solo, água ou alimento. Quando esses 
materiais são semeados na superfície de meio sólido, as colônias formam cópias exatas do 
organismo original.
Uma colônia visível teoricamente vem de um único esporo ou célula vegetativa ou de um 
grupo dos mesmos micro-organismos juntos em agregados ou cadeias. As colônias microbia-
nas frequentemente têm aparência diferente, o que permite distinguir um micro-organismo do 
outro. As bactérias devem ser espalhadas de maneira suficientemente ampla na placa para 
que as colônias possam ser separadas umas das outras.
O método de isolamento mais comumente utilizado para obter culturas puras é o método 
de esgotamento por estrias ou esgotamento de alça. Uma alça de inoculação estéril é mergu-
lhada dentro de uma cultura mista, que contém mais de um tipo de micro-organismo, e é seme-
ada em estrias na superfície de um meio nutritivo. Ao longo da estria, as bactérias são deposi-
tadas quando a alça entra em contato com o meio. As últimas células depositadas na alça são 
afastadas o suficiente para crescer em colônias isoladas. Essas colônias podem ser repicadas 
com uma alça de inoculação e transferidas para um tubo de ensaio com meio nutritivo para 
a obtenção de uma cultura pura contendo somente um tipo de bactéria. O método de esgota-
mento por estrias ou esgotamento de alça funciona bem quando o organismo a ser isolado 
está presente em grande número em relação à população total. Contudo, quando o micro-or-
ganismo a ser isolado está presente em um número muito pequeno, sua quantidade pode ser 
aumentada por enriquecimento seletivo antes do isolamento com o método de esgotamento.
testes bioquíMiCos e identifiCAção bACteriAnA
Os testes bioquímicos frequentemente são utilizados para identificar bactérias e levedu-
ras, pois diferentes espécies produzem enzimas diferentes. Tais testes são projetados para 
detectar a presença de enzimas. Um tipo de teste bioquímico é a detecção de enzimas que 
catabolizam aminoácidos envolvidos na descarboxilação ou na desidrogenação. Outro tipo de 
teste é o teste de fermentação.
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O meio testado contém proteínas, um único carboidrato, um indicador de pH e um tubo de 
Durham invertido para capturar gás. Bactérias inoculadas no tubo podem utilizar a proteína ou 
o carboidrato como fonte de carbono e energia. Se elas catabolizam o carboidrato e produzem 
ácido, o indicador de pH muda de cor. Alguns micro-organismos produzem gás, assim como 
ácido, a partir do catabolismo do carboidrato. A presença de uma bolha no tubo de Durham 
indica a formação de gás.
E. coli fermenta o carboidrato sorbitol. A linhagem E. coli O157, contudo, não realiza essa 
fermentação, uma característica que a diferencia da E. coli comensal não patogênica. Em al-
guns casos, os produtos residuais de um micro-organismo podem ser utilizados como fonte 
de carbono e energia por outra espécie. As bactérias Acetobacter oxidam o etanol produzido 
pelas leveduras. Propionibacterium pode utilizar o ácido lático produzido por outras bactérias. 
As propionibactérias convertem o ácido lático em ácido pirúvico na preparação para o ciclo de 
Krebs. Durante o ciclo, ácido propiônico e CO2 são formados. Os orifícios no queijo suíço são 
formados pelo acúmulo de gás CO2.
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Testes bioquímicos são utilizados para identificar bactérias que causam doenças. Todas 
as bactérias aeróbicas utilizam uma cadeia de transporte de elétrons, mas nem todas suas 
cadeias são idênticas. Algumas bactérias têm citocromo c, enquanto outras não. Nas primei-
ras, a citocromo c-oxidase é a última enzima, que transfere os elétrons ao oxigênio. O teste 
da oxidase é utilizado para identificar rapidamente Neisseria gonorrheae. Neisseria é positiva 
para a citocromo-oxidase. O teste da oxidase também pode ser utilizado para distinguir alguns 
bastonetes gram-negativos: Pseudomonas é oxidase-positiva e Escherichia é oxidase-negativa. 
Shigella pode causar disenteria, sendo diferenciada de E. coli por testes bioquímicos.
Ao contrário da E. coli, a Shigella não produz gás a partir da lactose e não produz a enzima 
lactato-desidrogenase. As bactérias Salmonella são facilmente diferenciadas de E. coli pela 
produção de sulfeto de hidrogênio (H2S), que é liberado quando elas removem o enxofre dos 
aminoácidos. O H2S combina com o ferro para formar um precipitado preto no meio de cultura.
testes pArA deterMinAr o trAtAMento quiMioterápiCo
Diferentes espécies e cepas microbianas têm diferentes graus de suscetibilidade a diferentes 
agentes quimioterápicos. Além disso, a suscetibilidade de um micro-organismo pode se alterar 
com o tempo, mesmo durante o tratamento com uma droga específica. Assim, o médico precisa 
conhecer a sensibilidade do patógeno antes de iniciar um tratamento. Entretanto, os médicos fre-
quentemente não podem esperar pelos resultados de testesde sensibilidade, iniciando o tratamen-
to com base em sua melhor estimativa, de qual patógeno provavelmente esteja causando a doença.
Diversos testes podem ser utilizados para indicar qual é o melhor agente quimioterápico 
para combater um patógeno específico. Entretanto, se os organismos já foram identificados, 
por exemplo, Pseudomonas, estreptococos β- hemolíticos ou gonococos – determinadas dro-
gas podem ser selecionadas sem que testes específicos de suscetibilidade sejam feitos. Os 
testes são necessários somente quando a suscetibilidade não pode ser prevista ou quando 
problemas de resistência antimicrobiana se desenvolvem.
Os testes de disco-difusão, também conhecidos como testes de Kirby-Bauer, provavelmen-
te sejam os mais utilizados, embora não necessariamente os melhores. Uma placa de Petri 
contendo um meio de ágar sólido tem toda sua superfície uniformemente inoculada com uma 
quantidade padronizada do organismo a ser testado. Em seguida, discos de filtro de papel 
impregnados com agentes terapêuticos em concentrações conhecidas são colocados na su-
perfície do meio de cultura. Durante a incubação, os agentes quimioterápicos se difundem dos 
discos para o ágar. Quanto mais distante do disco o agente se difundir, menor será sua concen-
tração. Se o agente quimioterápico for efetivo contra o organismo testado, uma zona de inibi-
ção se formará ao redor do disco após um período de incubação padronizado. O diâmetro da 
zona de inibição pode ser medido e, em geral, quanto maior a zona, maior a suscetibilidade do 
micro-organismo ao antibiótico. O diâmetro da zona de inibição é comparado aos valores em 
uma tabela padronizada para a droga e a concentração, e o organismo pode ser classificado 
como sensível, intermediário ou resistente. Para uma droga que apresenta baixa solubilidade, 
no entanto, a zona de inibição indicando que o micro-organismo é sensível será menor do que 
a zona gerada por uma droga que é mais solúvel e se difunde melhor no ágar.
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Resultados obtidos pelo método de disco-difusão frequentemente são inadequados para 
muitos objetivos clínicos. Entretanto, o teste é simples e barato, sendo o mais utilizado quan-
do instalações laboratoriais sofisticadas não estão disponíveis. Um método de difusão mais 
avançado, denominado teste E, permite ao técnico laboratorial estimar a concentração inibitó-
ria mínima (CIM), ou seja, a menor concentração do antibiótico que previne o crescimento bac-
teriano visível. Uma tira plástica é coberta com um gradiente de concentração do antibiótico, e 
a CIM pode ser avaliada por uma escala impressa na tira plástica. Uma desvantagem dos tes-
tes de difusão é que eles não determinam se a droga é bactericida ou apenas bacteriostática.
Um método de diluição em meio líquido frequentemente é útil para determinar a CIM e 
também a concentração bactericida mínima (CBM) de uma droga antimicrobiana. A CIM é de-
terminada pela preparação de concentrações decrescentes da droga em meio líquido, seguida 
da inoculação com a bactéria a ser testada. As amostras que não apresentam crescimento 
(concentrações superiores à CIM) podem ser cultivadas em outro caldo ou placas de ágar 
livres da droga. Se o crescimento ocorrer nesse caldo, isso significa que a droga não era bac-
tericida, e a CBM pode então ser medida. A determinação da CIM e da CBM é importante, pois 
evita o uso excessivo ou incorreto de um antibiótico caro e minimiza a chance da ocorrência de 
efeitos tóxicos causados por doses em concentrações maiores do que as necessárias.
Os testes de diluição geralmente são automatizados. As drogas são adquiridas já diluídas 
em poços em uma placa plástica. Uma suspensão do micro-organismo-teste é preparada e 
inoculada em todos os poços, simultaneamente, pelo uso de um aparato de inoculação. Após 
a incubação, a turbidez do meio contido em cada poço pode ser avaliada visualmente, embora 
laboratórios com maiores demandas possam utilizar aparelhos que avaliam a turbidez e en-
viam os dados para um computador, que por sua vez fornece os dados de CIM impressos.
Outros testes também podem ser úteis para os clínicos, a determinação da capacidade de um 
micro-organismo de produzir β-lactamase é um exemplo. Um método popular e rápido usa uma 
cefalosporina que muda de cor quando seu anel β-lactâmico é quebrado. Além disso, a medida da 
concentração sérica de um antimicrobiano é especialmente útil quando drogas tóxicas são usadas.
Esses ensaios tendem a variar com o tipo de droga testada e podem não estar disponíveis 
em laboratórios mais simples. Profissionais da saúde responsáveis pelo controle de infec-
ções preparam relatórios periódicos denominados antibiogramas, que incluem dados sobre a 
suscetibilidade de organismos encontrados clinicamente. Esses relatórios são especialmente 
úteis para determinar o surgimento de cepas de patógenos resistentes aos antibióticos em uso 
nas instituições de saúde.
Meios e Métodos pArA o CresCiMento de MiCrorgAnisMos AnAeróbiCos
Existe um grupo de bactérias que produz patologia no ser humano e que não tem capacidade 
de multiplicar-se em presença do oxigênio atmosférico. E mais, para muitas espécies destas bac-
térias, o oxigênio é deletério. Estas bactérias são chamadas de anaeróbios estritos, para diferen-
ciar dos chamados anaeróbios facultativos, que têm a capacidade de desenvolver seus proces-
sos metabólicos tanto em presença como na ausência do oxigênio. A maior parte das bactérias 
patogênicas do ser humano são anaeróbios facultativos, e as famílias Micrococaceae, Streptoco-
caceae, Corynebacteriaceae, Enterobacteriaceae, são exemplos destes microrganismos.
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Anaeróbios, Micobactérias, Corinebactérias
MICROBIOLOGIA
Pollyana Lyra
Existem algumas teorias que tentam explicar a susceptibilidade dos anaeróbios estritos ao 
oxigênio. Dentre elas, destacam-se:
• O oxigênio seria um tóxico direto para a bactéria anaeróbia. As bactérias anaeróbias estritas 
não têm a enzima catalase que impede a formação de grandes quantidades de peróxidos.
• O oxigênio altera enzimas bacterianas importantes no metabolismo (oxida, por exemplo, 
enzimas que contém sulfetos).
• As bactérias anaeróbias estritas não possuem a enzima superóxido dismutase, capaz 
de transformar o radical, o que é altamente tóxico para a bactéria.
Existem vários argumentos a favor e contra essas teorias. Provavelmente mais de um des-
tes fatores seja importante para explicar a ação deletéria do oxigênio nessas bactérias. Esta 
labilidade dos anaeróbios estritos ao oxigênio explica a dificuldade existente nos laboratórios 
para seu isolamento e estudo. Também por este motivo, boa parte das infecções provocadas 
por esses microrganismos não eram diagnosticadas até a década de 1970, quando foram 
desenvolvidos procedimentos práticos de laboratórios para criar atmosferas de anaerobiose.
Assim, as infecções provocadas pelos microrganismosmais resistentes dentro deste gru-
po, os esporulados do gênero Clostridium, eram diagnosticadas com maior frequência. Hoje 
sabemos que as infecções por Clostridium são menos freqüentes que as infecções provoca-
das por outros gêneros de bactérias anaeróbias.
Um fato que também merece ser destacado para explicar a frequência com que estas 
bactérias provocam infecção, é que os anaeróbios estritos são habitantes normais do orga-
nismo humano, ultrapassando em número os aeróbios e anaeróbios facultativos. Assim, os 
anaeróbios estritos estão em proporções 5 a 1000 vezes maiores que os anaeróbios facultati-
vos na microbiota normal do tubo digestivo, pele, trato respiratório superior e genital feminino. 
Quando existem fatores predisponentes, estas bactérias provocam processos patológicos em 
diferentes órgãos e sistemas. Por este motivo, a maior parte das infecções provocadas pelas 
bactérias anaeróbias estritas são infecções chamadas endógenas.
É a própria microbiota bacteriana do paciente que em determinado momento provoca o 
processo infeccioso, sendo este tipo de infecção pouco ou não contagioso. As infecções pro-
vocadas pelo gênero Clostridium são fundamentalmente adquiridas a partir do meio ambien-
te externo e por este motivo são chamadas de infecções exógenas. Nas mucosas, onde os 
anaeróbios estritos formam parte da microbiota normal, existem condições locais de anaero-
biose. Estas condições são provocadas por compostos orgânicos, enzimas, restos celulares e 
bactérias anaeróbias facultativas que baixam o potencial redox nestes locais. Em virtude dis-
so, estas bactérias toleram pequenas quantidades de oxigênio. As mais estritas crescem em 
atmosferas com 0,5% de oxigênio, muitas crescem em atmosferas ao redor de 3% e algumas 
podem crescer ainda em concentrações de até 8% de oxigênio.
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Como as bactérias anaeróbias facultativas e aeróbias favorecem a multiplicação dos 
anaeróbios, por consumirem o oxigênio existente no local e talvez por produzirem alguns fa-
tores de crescimento como substâncias secundárias do seu metabolismo, a maior parte das 
infecções por bactérias anaeróbias estritas são infecções mistas. Assim, são freqüentes as 
infecções conjuntas com Enterobactérias, Pseudomonas e Staphylococcus aureus.
Alguns aspectos clínicos levantam a suspeita de uma infecção com envolvimento de bac-
térias anaeróbias, dentre eles, destacam-se: secreção fétida; infecção nas proximidades de 
superfície mucosa; tecido necrótico; presença de gás em tecidos ou secreções; tromboflebite 
séptica; coloração negra em secreção com sangue; infecção decorrente de mordida humana 
ou de animal; presença de grânulos de enxofre nas secreções; terapêutica prévia com amino-
glicosídeos e gangrena gasosa.
Uma lesão com aspecto de um micetoma e a observação de grânulos de enxofre no pus 
obtido são características de uma infecção por Actinomyces. A infecção por anaeróbios se-
cundária a uma mordida de animal ou do ser humano é explicada pela existência de um grande 
número destas bactérias na cavidade oral destes hospedeiros. Associados a estes elementos 
clínicos, existem alguns outros, laboratoriais, que sedimentam ainda mais a suspeita de uma 
infecção por anaeróbios estritos, como por exemplo a ocorrência de formas pleomórficas na 
coloração de Gram (como regra geral, os anaeróbios são mais pleomórficos que os aeróbios e 
anaeróbios facultativos), a observação no material, de bacilos gram positivos esporulados que 
fazem pensar em Clostridium, a presença de bactérias no Gram direto, que não crescem nos 
meios mantidos em atmosferas de aerobiose, o crescimento de bactérias somente na parte 
inferior de tubos com meios de cultura líquido ou semissólido.
Uma variedade de condições predispõe um indivíduo a desenvolver infecção por anaeróbios. 
Podemos generalizar dizendo que todos os fatores que fazem diminuir a quantidade de oxigê-
nio nos tecidos, e, portanto, o potencial de oxirredução dos mesmos, favorecem a infecção por 
anaeróbios estritos. Entre estes fatores, os mais frequentes são: diminuição do fluxo sanguíneo; 
presença de áreas necróticas; corpos estranhos; acúmulo de sais endógenos (por exemplo, pon-
tos de calcificação), infecção por bactérias aeróbias ou anaeróbias facultativas; manipulações 
cirúrgicas; esterilização intestinal pré-operatória; tumores e processos orgânicos ou caseosos.
Um baixo potencial de oxirredução facilita o crescimento de bactérias anaeróbias, e a cau-
sa clínica mais comum de diminuição do potencial redox é a anóxia dos tecidos resultante de 
lesão vascular, compressão, hipotermia, choque, edema e outras condições que levam à má 
perfusão sanguínea. Quanto às doenças sistêmicas ou condições gerais, como corticoterapia, 
terapêutica de tumores, leucopenia, hipergamaglobulinemia, colagenoses, diabetes, esplenec-
tomias, embora relacionadas como predisponentes, não há evidência concreta de que real-
mente estejam associadas à maior incidência de infecção por anaeróbios.
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ColetA do MAteriAl pArA diAgnóstiCo de MiCrorgAnisMos AnAeróbios
As amostras devem ser colhidas de forma que não entrem em contato com oxigênio e não 
se contaminem com bactérias anaeróbias da microbiota normal. Por este motivo, devem ser 
aspiradas com seringa, da qual é eliminado o ar imediatamente após a obtenção da amostra. 
O material não pode ser colhido com swab. Para evitar a contaminação pelos anaeróbios da 
microbiota normal, não devem ser semeados escarro, secreção faríngea ou nasal, secreções 
vaginais, fezes ou material de colostomia, pois estes materiais sempre têm bactérias anaeró-
bias. Idealmente, as bactérias anaeróbias estritas são pesquisadas em líquidos aspirados de 
cavidades fechadas, material obtido por aspiração profunda de feridas, punção de traqueia ou 
pulmonar e sangue para hemocultura. Em resumo, serve qualquer material que não esteja nor-
malmente contaminado com as bactérias anaeróbias da microbiota normal.
Transporte do Material
O transporte pode ser feito com a mesma seringa com que foi colhido o material. Obvia-
mente que este transporte deve ser o mais rápido possível. O melhor é que o mesmo profis-
sional que colheu leve imediatamente a seringa ao laboratório. Também pode ser empregado 
para este fim um vidro do tipo de penicilina, que contém meio de tioglicolato de sódio (± 7 ml). 
O tioglicolato é um sal redutor, de forma que no interior do meio existem condições de anaero-
biose. A este meio líquido pode-se acrescentar uma pequena quantidade de ágar (0,5%) para 
transformá-lo em um meio mais espesso, o que dificulta a difusão de oxigênio. O meio tem um 
indicador de oxigenação que é a rezarsurina, de modo que, se por algum motivo, exista oxige-
nação do mesmo, o indicador adquire cor rosa. O material aspirado é inoculado no interior do 
meio de cultura, atravésda tampa de borracha. Especial cuidado deve-se ter para não agitar o 
meio, antes e depois da inoculação, para evitar sua oxigenação. As amostras colhidas neste 
meio podem ser encaminhadas ao laboratório várias horas após sua inoculação (até 24 horas).
Processamento do Material
Sempre é feita uma coloração de Gram e de esporos, quando necessário, da amostra recebida, 
o que pode orientar o clínico para o diagnóstico e a terapêutica precoce. Por exemplo, a observação 
num processo com aspecto de gangrena gasosa de bacilos Gram positivos, grandes esporulados, 
é quase confirmação do diagnóstico de Clostridium e de gangrena gasosa. A existência de poucas 
ou muitas bactérias na amostra permite orientar o bacteriologista se ele deve enriquecer previa-
mente a amostra em um caldo ou fazer diretamente a semeadura em placa. Quando o material 
vem numa seringa, a semeadura é feita em tioglicolato e em placa. Quando o material já vem no 
meio de tioglicolato, é feita, a partir deste, a semeadura em placa, e incubados ambos os meios.
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produção de AnAerobiose
Como os microrganismos anaeróbicos podem ser mortos pela exposição ao oxigênio, 
meios especiais, chamados de meios redutores, devem ser utilizados. Esses meios contêm 
ingredientes, como o tioglicolato de sódio, que se combinam quimicamente com o oxigênio 
dissolvido e o eliminam no meio de cultura. Para cultivar e manter culturas puras de anaeró-
bicos obrigatórios, utilizam-se meios redutores armazenados em tubos de ensaio firmemente 
tampados. Esses meios são aquecidos rapidamente antes de serem utilizados, para eliminar o 
oxigênio absorvido. Quando são utilizadas placas de Petri para o crescimento e a observação 
de colônias isoladas, vários métodos estão disponíveis.
Laboratórios que trabalham com relativamente poucas placas de cultura de cada vez podem 
utilizar sistemas para a incubação dos micro-organismos em caixas e jarras seladas, das quais 
o oxigênio é removido quimicamente após as placas de cultura terem sido introduzidas e a jar-
ra selada. Alguns sistemas requerem que seja adicionada água em uma embalagem contendo 
compostos químicos antes da jarra ser fechada, além de exigir um catalisador. Os compostos 
químicos produzem hidrogênio e dióxido de carbono (em torno de 4 a 10%) e removem o oxigênio 
da jarra por sua combinação, na presença de um catalisador, com hidrogênio para formar água.
Em outro sistema disponível comercialmente, cujo ingrediente ativo é o ácido ascórbico, a 
embalagem de compostos químicos é simplesmente aberta para sua exposição ao oxigênio 
na atmosfera da jarra, não sendo necessário o uso de água ou catalisador.
A atmosfera nas jarras em geral tem menos que 5% de oxigênio, cerca de 18% de CO2 e ne-
nhum hidrogênio. Em um sistema desenvolvido recentemente, cada placa de Petri se transfor-
ma em uma câmara anaeróbica. O meio na placa contém uma enzima, a oxirase, que combina 
o oxigênio com o hidrogênio, removendo o oxigênio à medida em que água é formada.
Os laboratórios que realizam muitos trabalhos com anaeróbicos com frequência utilizam 
uma câmara anaeróbica. A câmara é preenchida com gases inertes (geralmente cerca de 85% 
N2, 10% H2 e 5% CO2) e equipada com sistemas de transferência para a introdução e a retirada 
de culturas e materiais.
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Muitas bactérias nunca foram cultivadas com sucesso em meios artificiais de laboratório. 
Por exemplo, Mycobacterium leprae, o bacilo da lepra, geralmente é crescido em tatus, pois 
eles têm uma temperatura corporal relativamente baixa que atende às necessidades do micro- 
organismo. Outro exemplo é a espiroqueta da sífilis, ainda que algumas linhagens não pato-
gênicas desses micro-organismos tenham crescido em meio de laboratório. Com poucas ex-
ceções, as bactérias intracelulares obrigatórias, como riquétsias e clamídias, não crescem em 
meios artificiais. Como os vírus, elas somente podem se reproduzir em célula hospedeira viva.
Muitos laboratórios clínicos têm estufas de dióxido de carbono especiais para o cresci-
mento de bactérias aeróbicas que requerem concentrações de CO2 mais altas ou mais baixas 
que a encontrada na atmosfera. Os níveis desejados de CO2 são mantidos por controles ele-
trônicos. Níveis de CO2 elevados também são obtidos com uma simples jarra com vela. As 
culturas são colocadas em uma jarra grande selada contendo uma vela acesa que consome 
o oxigênio. A vela apaga quando o ar dentro da jarra tem uma concentração baixa de oxigênio 
(mas ainda suficiente para o crescimento de bactérias aeróbicas). Uma concentração elevada 
de CO2 também está presente.
Os micro-organismos que crescem melhor em altas concentrações de CO2 são chamados de 
capnofílicos. As condições de oxigênio baixo e CO2 alto são similares àquelas encontradas no trato 
intestinal, no trato respiratório e em outros tecidos corporais onde bactérias patogênicas crescem.
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As jarras com velas ainda são utilizadas, mas estão sendo substituídas por embalagens 
comerciais contendo reagentes químicos para a produção de uma atmosfera rica em dióxido 
de carbono. Quando somente uma ou duas placas de Petri com culturas devem ser incubadas, 
os laboratórios clínicos frequentemente utilizam sacos plásticos com geradores químicos pró-
prios de gás que são ativados por esmagamento do pacote ou adição de alguns mililitros de 
água. Esses pacotes algumas vezes são desenvolvidos especialmente para fornecer concen-
trações definidas de dióxido de carbono (em geral maiores que as obtidas em uma jarra de vela) 
e de oxigênio para o cultivo de organismos como a bactéria microaerofílica Campylobacter.
As amostras são semeadas em três placas de ágar sangue preparadas com ágar Brucella, 
adicionadas com 10% de sangue de carneiro. Uma das placas é incubada a 37ºC em atmosfera 
aeróbia, e uma segunda é incubada a 37ºC em uma atmosfera com 5% de CO2 para bactérias 
microaerófilas. Para este fim coloca-se a placa em uma jarra com um gerador de CO2, produ-
zindo aproximadamente 5% de CO2. A terceira placa é a que se inocula em atmosfera de anae-
robiose. O meio de cultura desta terceira placa é enriquecido com hemina (5mg/ml), vitamina 
K (10 mg/ml) e extrato de levedura (0,5%). Neste meio acrescenta-se tambémum antibiótico 
aminoglicosídeo (geralmente amicacina, 100 mcg/ml). A adição do antibiótico cria um meio 
seletivo porque os anaeróbios estritos são resistentes a estes antimicrobianos e a maior parte 
das cepas de aeróbios e anaeróbios facultativos é sensível.
Como a maior parte das infecções provocadas pelos anaeróbios estritos são infecções 
mistas, este meio seletivo ajuda o isolamento bacteriano. Não se justifica o uso de mais uma 
placa sem antibiótico porque aumentam os custos sem aumentar o isolamento de anaeróbios. 
Estas placas são incubadas dentro da jarra a 37ºC de temperatura durante 48 horas. Quando 
se suspeita, pelo quadro clínico ou pela coloração de Gram da amostra, que estamos em pre-
sença de uma infecção por Clostridium, que são de crescimento mais rápido, as jarras podem 
ser abertas após 18 a 24 horas de incubação. Por outro lado, bactérias de crescimento mais 
lento, como os actinomices, podem demorar sete dias ou mais para formar colônias visíveis.
Identificação Bacteriana - Comprovação de Anaerobiose Estrita
Após a incubação, as placas são examinadas, e agora o passo mais importante é a compro-
vação de que as bactérias desenvolvidas nas placas de anaerobiose são anaeróbios estritos. 
Para este fim, são feitas colorações de Gram, de todos os diferentes tipos de colônias observa-
das nas três placas e comparada a morfologia bacteriana. Ao mesmo tempo, semeiam-se as 
diversas bactérias obtidas, novamente em anaerobiose e aerobiose. Só é feito o diagnóstico de 
anaeróbio estrito quando, após 24 a 48 horas da nova incubação, a bactéria apenas crescer na 
placa de anaerobiose. O Gram das colônias já orienta para uma identificação preliminar do grupo 
de anaeróbio isolado.
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Identificação Bacteriana Presuntiva
Das colônias de anaeróbios estritos, deve ser feita coloração de Gram. Já nesta etapa o 
laboratório presta uma grande ajuda ao clínico, informando que o paciente tem uma infecção 
por uma bactéria anaeróbia estrita que pertence a determinado grupo morfológico. O diag-
nóstico de gênero e espécie é feito com provas bioquímicas, como a utilização de açúcares, 
produção de indol, redução de nitratos, urease, crescimento em presença de bile, liquefação 
da gelatina, hidrólise de esculina etc.; produção de pigmentos; hemólise; aprofundamento no 
Agar, susceptibilidade a antimicrobianos; formação de ácidos detectados por cromatografia 
líquida; inoculação experimental e testes sorológicos.
Se houver a identificação de cocos Gram positivos, o laboratório deve fazer o diagnóstico 
presuntivo de Peptostreptococcus, que são os mais frequentemente isolados neste grupo mor-
fológico. Diagnóstico diferencial com Streptococcus e Staphylococcus anaeróbios como das 
espécies de Peptostreptococcus deve ser feito com ajuda da cromatografia para detectar a pro-
dução de diferentes ácidos graxos. Na presença de cocos Gram negativos, o laboratório deve 
fazer o diagnóstico presuntivo de Veillonella, gênero mais freqüente neste grupo. Para o diag-
nóstico diferencial com os outros gêneros de cocos Gram negativos, também é recomendada 
a cromatografia líquida para pesquisar ácidos graxos. Na presença de bacilos Gram positivos 
esporulados, o laboratório deve fazer o diagnóstico de Clostridium. Na dúvida no diagnóstico 
de bacilo esporulado, recomenda-se o tratamento com álcool etílico a 95%, durante 1 hora, à 
temperatura ambiente e ressemeadura posterior. Além disso, a suspensão bacteriana pode ser 
aquecida a 80ºC durante 10 minutos, esfriada e feita ressemeadura. Após um ou outro destes 
procedimentos só sobrevivem bactérias esporuladas. Se o Clostridium produzir um duplo halo 
de hemólise, pode ser feito o diagnóstico presuntivo de Clostridium perfringens, espécie mais 
frequentemente isolada dentro deste grupo bacteriano.
Para o diagnóstico diferencial das outras espécies de Clostridium, devem ser feitas provas 
bioquímicas como hidrólise da gelatina, fermentação da glicose, lecitinase, lipase, produção 
de indol, ureia, nitratos e motilidade. Na presença de bacilos Gram positivos não esporulados, 
recomenda-se fazer a prova de catalase, redução de nitratos, hidrólise de esculina, urease e 
produção de pigmento. Para o diagnóstico definitivo, deve ser feita a pesquisa da produção de 
ácidos graxos. Se a coloração de Gram mostrar bacilos Gram negativos, a colônia é semeada 
em ágar sangue (Brucella ágar), colocando um disco de Rifampicina (15 mcg) e um disco de 
Kanamicina (1.000 mcg); a bactéria deve também ser semeada num meio que contém bile a 
20%, e num meio rico em triptofano para determinar a produção de indol, com as placas incu-
badas por 48 horas a 37ºC. Essas provas, junto com a produção de pigmento, permitem fazer 
o diagnóstico presuntivo de Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas e Fusobacterium. Frente 
aos discos de antibióticos, a bactéria é considerada sensível se o halo de inibição é de 12mm 
ou maior e considerada resistente com halos menores de 12mm.
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Como inóculo para a semeadura utiliza-se uma suspensão com turvação semelhante ao 
número 3 de escala de MC Farland ou uma turvação semelhante após incubação em meio de 
tioglicolato. A prova da bile é considerada positiva se existir crescimento bacteriano no qua-
drante respectivo. Para a produção de pigmento, deve-se observar diretamente as colônias, e, 
em caso de não existir pigmento evidente, iluminar a placa com luz ultravioleta (± 360 nm de 
comprimento de onda). Colônias de Prevotella melaninogenicus aparecem de cor tijolo averme-
lhado. Para a prova de indol, deve-se passar uma colônia, a partir do meio com triptofano, com 
ajuda de uma alça de platina num papel filtro impregnado em 1% de paradimetilaminocinamal-
deido (em ácido clorídrico 10%). Uma reação positiva produz imediatamente uma cor azul.
A diferenciação dos gêneros Prevotella e Porphyromonas é realizada através da capacida-
de de fermentar glicose, que é positiva para o primeiro gênero e negativa para o segundo. Em 
algumas infecções, é importante para o diagnóstico determinar a presença de toxinas, como 
acontece nas infecções intestinais por Clostridium difficile. Esta determinação é feita com pro-
vas sorológicas disponíveis comercialmente.
provAs de sensibilidAde A AntiMiCrobiAnos
O estudo da sensibilidade destas bactérias é importante pelo aumento permanente de sua 
resistência frente aos diferentes antimicrobianos. Esta resistência é mais comum nos gêneros 
Bacteroides e Prevotella, mas pode estar presente também nos gêneros Clostridium, Porphyro-
monas e Fusobacterium.
Método de Disco Difusão
O método do disco difusão não é adequado para estudar a sensibilidade das bactérias 
anaeróbias estritas. O NCCLS (National Committee for Clinical Laboratories Standards) dos 
EUA recomenda um método de diluição em Agar, no qual as concentrações de antimicrobianossão incorporadas no meio de Wilkins-Chalgren. Cada placa tem uma concentração de um anti-
microbiano. As bactérias são semeadas utilizando o inoculador múltiplo de Steers, e as placas 
colocadas em jarras com gerador de anaerobiose. A leitura é feita após 48 horas de incubação 
na estufa, determinando-se a CIM (concentração inibitória mínima).
Método da Fita
Um método alternativo mais prático é a determinação da sensibilidade utilizando fitas de 
plástico impregnadas com um gradiente de concentração de antimicrobianos. As bactérias 
são semeadas em forma similar à empregada no método do disco para aeróbios. São coloca-
das duas fitas, cada uma com um antibiótico diferente, em cada placa de 9 cm de diâmetro. 
Em geral, é necessário testar 6 antibióticos (3 placas). Os antimicrobianos com maior ativida-
de in vitro e in vivo frente aos anaeróbios estritos são: cloranfenicol, clindamicina, cefoxitina, 
metronidazol, penicilina e amoxicilina com ácido clavulânico. As placas são incubadas dentro 
de jarra com gerador a 37ºC de temperatura, a leitura é feita após 48 horas de incubação, e a 
sensibilidade é interpretada nos dois métodos seguindo as tabelas publicadas pelo NCCLS.
Existe uma boa correlação nos resultados obtidos entre as duas metodologias descritas.
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CoCos grAM positivos
Os Estafilococos são as bactérias não esporuladas que mais resistem no meio ambiente. 
Podem sobreviver por meses em amostras clínicas secas, são relativamente resistentes ao 
calor e podem tolerar uma concentração aumentada de cloreto de sódio. No entanto, apesar 
dos antimicrobianos existentes, da melhora das condições sanitárias e das medidas de con-
trole de infecção hospitalar, estes microrganismos continuam a ser um dos mais importantes 
patógenos para o homem. Indivíduos sadios são colonizados intermitentemente por Staphylo-
coccus aureus desde a amamentação, e podem possuir o microrganismo na microbiota da 
nasofaringe, ocasionalmente na pele e raramente na vagina. A partir destes sítios, o S. aureus 
pode contaminar a pele e membranas mucosas do paciente, objetos inanimados ou outros pa-
cientes por contato direto ou por aerossol, ocasionando infecções letais por conta dos fatores 
de virulência ou através de resistência aos antimicrobianos atualmente utilizados.
Já foram descritos no Brasil casos de infecções causadas por Staphylococcus aureus par-
cialmente resistentes aos antibióticos mais potentes, como a vancomicina, e relatos da capa-
cidade que os Staphylococcus coagulase negativos têm de desenvolver resistência. Assim, há 
necessidade de uma identificação rápida e eficiente de todos os casos em que estes micror-
ganismos se apresentam.
Os estreptococos foram os maiores causadores de infecção hospitalar na era pré-antibióti-
ca, causando surtos de infecção e morte de puérperas. Apesar de não serem atualmente uma 
importante causa de infecção hospitalar, provocam doenças muito graves e muitas vezes letais, 
mesmo em pacientes imunocompetentes, sendo importante o rápido diagnóstico deste agente.
Já os enterococos apresentam importância crescente como causadores de infecção hospi-
talar, pelo aparecimento de resistência quase total aos antibióticos tradicionalmente utilizados 
para tratamento destas infecções. Os Enterococos mais comumente isolados são: Enterococ-
cus faecalis (90% dos casos) e Enterococcus faecium, com grande capacidade de colonização 
de pacientes e de contaminarem superfícies ou equipamentos utilizados em hospitais. Pos-
suem sensibilidade ou resistência variável aos antibióticos chamados glicopeptídios como a 
vancomicina e teicoplanina. Existem, atualmente, cepas comensais naturalmente resistentes 
à vancomicina e que podem ser isoladas de pacientes internados, porém não sendo ainda ca-
pazes de causarem surtos, mas que devem ser corretamente identificadas.
A identificação prévia dos estreptococos e estafilococos é baseada na morfologia que 
apresentam em meios líquidos. Sendo o estreptococo uma cadeia normalmente longa e os 
estafilococos mostrando-se em forma de cocos aos pares, em cachos de uva ou agrupados. 
A identificação presuntiva começa com a inoculação primária na placa de ágar sangue de 
carneiro, que deve ser incubada em 5% de tensão de CO2 (método da vela ou estufa de CO2). 
As colônias de estafilococos são geralmente maiores, convexas, de coloração variando do 
branco-porcelana a amarelo, podendo apresentar hemólise ou não. Observa-se que o desen-
volvimento da cor amarelada no S. aureus ocorre somente após incubação prolongada (72h), 
à temperatura ambiente. As colônias de estreptococos tendem a ser menores (puntiformes) e 
com halos de hemólise total ou parcial (beta e alfa hemólise). A diferenciação entre os estrep-
tococos e os estafilococos se dá, seguramente, pela prova da catalase.
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provA dA CAtAlAse
A prova da catalase consiste na detecção da enzima catalase em bactérias. Esta enzima 
atua sobre a água oxigenada quebrando suas moléculas, separando assim o oxigênio e a água. 
Esse processo gera a efervescência, que mostra positividade ao teste.
Com o auxílio de uma alça bacteriológica estéril coleta-se o centro da colônia suspeita 
transferindo-a para uma lâmina de vidro, logo após deve ser pingada uma gota de água oxige-
nada a 3% e observada a formação de bolhas. Este teste não deve ser realizado com bactérias 
isoladas em meio de cultura ágar sangue, já que o sangue presente no meio contém a enzima 
catalase, levando assim a resultados falso positivos.
A prova da catalase é utilizado para a identificação de espécies patogênicas de Staphylo-
coccus. As enzimas coagulases possuem a capacidade de reagir com um fator plasmático 
formando um complexo que atua sobre o fibrogênio, originando a fibrina, o que ocasiona a 
coagulação do plasma sanguíneo.
Com a alça bacteriológica ou com um palito, coleta-se o centro de uma colônia suspeita e 
esfrega-se em uma lâmina de vidro. Coloca-se sobre este esfregaço uma gota de água oxigena-
da a 3% e observa-se a formação de bolhas. Para a família Microccocacea (estafilococos), a pro-
va é geralmente positiva, enquanto para a família Streptococcacea (estreptococos) é negativa.
Ao coletar a colônia, não se deve contaminá-la com ágar sangue, que pode acarretar resul-
tados falso-positivos, pois o sangue do meio contém catalase. Algumas cepas de enterococos 
podem dar falsa reação positiva. Para confirmar, deve-se fazer Gram e ver disposição em ca-
deias curtas ou aos pares.
identifiCAção de estAfiloCoCos
O teste mais importante na identificação da família Micrococcaceae é a prova da catalase, 
e esta família é composta de quatro gêneros: Planococcus, Micrococcus, Stomatococcus e 
Staphylococcus. O gênero Staphylococcus apresenta 32 espécies e 14 subespécies, sendo que 
somente 15 espécies são encontradas em amostras humanas.De uma maneira prática, os es-
tafilococos são divididos em duas categorias: coagulase positivos e coagulase negativos, de 
acordo com a resposta ao teste da coagulase.
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Existem cerca de 31 espécies de Staphylococcus coagulase negativa conhecidas, das 
quais os mais freqüentes são:
Staphylococcus epidermidis - causador de infecções de cateteres e próteses e o mais fre-
quente microrganismo encontrado em hemoculturas. Staphylococcus saprophyticus - causa-
dor de infecção urinária em mulheres jovens. Staphylococcus haemolyticus - importante devido 
à resistência aumentada aos antimicrobianos, e por ser comumente confundido com o S. au-
reus, pois apresenta hemólise na placa de ágar sangue de carneiro.
Teste da resistência a novobiocina: a cepa é semeada de maneira semelhante ao antibio-
grama em placa de Muller Hinton, acrescida de um disco teste de novobiocina contendo 5 µg. As 
amostras resistentes mostram zonas de inibição de 6 a 12mm, enquanto as susceptíveis apre-
sentam halos de 16mm ou mais. As cepas de Staphylococcus saprophyticus são resistentes.
identifiCAção do stAphyloCoCCus Aureus
A forma mais simples de identificar o Staphylococcus aureus é a prova da coagulase, que 
pode ser efetuada em tubo ou em lâmina.
Teste da coagulase em lâmina: a maioria das cepas de Staphylococcus aureus possui a 
coagulase ligada (ou fator aglutinante) “clumping factor” na superfície da parede celular, que 
reage com o fibrinogênio do plasma causando a coagulação do mesmo. Neste teste coloca-se 
2 gotas de salina em uma lâmina, emulsionando uma colônia isolada a ser testada; acrescen-
ta-se uma gota de plasma e mistura-se com um palito de plástico ou madeira; ao final, obser-
va-se se há aglutinação em 10 segundos. Não se deve executar este teste a partir de um ágar 
com grande concentração de sal, como ágar manitol.
Teste da coagulase em tubo: este teste baseia-se na presença da coagulase livre, que reage 
com um fator plasmático formando um complexo que atua sobre o fibrinogênio, formando a fibri-
na. Neste teste, adiciona-se 0,1 ml de caldo BHI, incubado por uma noite, com colônia suspeita a 
um tubo de ensaio com 0,5 ml de plasma; incuba-se por 4 horas a 35ºC em estufa ou banho-ma-
ria. A formação do coágulo é observada pela inclinação suave do tubo de ensaio a 90 graus ver-
tical. Um método alternativo é a emulsificação desta mesma colônia suspeita em um 0,5 plasma 
e incubado da mesma forma. Qualquer coágulo indica uma prova positiva, porém deve-se tomar 
cuidado para não confundir com precipitados ou floculação. O melhor plasma a ser usado é o de 
coelho com EDTA, não devendo ser usado o plasma humano vindo do banco de sangue.
Teste da DNase: através deste teste é possível identificar se a bactéria isolada possui a en-
zima desoxiribonuclease, que é a responsável por degradar o ácido desoxirribonucléico (DNA). 
Realiza-se com a inoculação de colônias previamente isoladas em um meio contendo DNA. 
Este teste é positivo quando aparece uma coloração rosa característica ao redor das colônias 
produtoras de DNAse.
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Este teste consiste na inoculação de colônias em meio contendo DNA, (DNAse test agar) 
obtido comercialmente. Adiciona-se ao meio original azul de ortotoluidina na concentração de 
0,1%; o meio adquire uma coloração azul intensa; incuba-se a 35ºC por 24 horas; uma colora-
ção rósea característica ao redor das colônias produtoras de DNAse indica a positividade da 
prova. O meio adicionado com corante demonstra uma melhor facilidade na leitura e permite 
o repique da amostra positiva para o teste de sensibilidade aos antimicrobianos, evitando que 
se retorne à placa original, onde nem sempre as colônias estão bem isoladas.
teste dA novobioCinA
É um teste realizado para verificar a resistência da bactéria a novobiocina, um antibiótico 
aminocumarínico produzido pelo actinomiceto Streptomyces niveus.
Deve-se semear a cepa isolada da mesma maneira que se realiza o antibiograma em placa 
de Muller Hinton, acrescentar o disco de novobiocina, incubar a placa em estufa a 37ºC por 24 
horas, e observar o seu halo de inibição. Amostras resistentes possuem halo de inibição de 6 
a 12mm, enquanto as sensíveis possuem halos de 16mm ou mais.
teste dA oxidAse
Este teste é importante na verificação da produção de enzima oxidase pela bactéria. Inocula-
-se uma colônia isolada da bactéria a ser testada na tira de oxidase (comercial pronta para uso) 
previamente umedecida com água deionizada. A coloração roxa indica positividade ao teste.
Teste da endonuclease: teste da endonuclease termoestável é efetuado no mesmo meio 
de DNA. Neste teste ferve-se o caldo de cultura com a bactéria suspeita por 15 minutos; adi-
ciona-se ao meio de DNA gotas de caldo de cultura turvo com a colônia suspeita; pequenos 
orifícios no meio (em placa) são feitos utilizando canudos de plástico. A leitura do teste é se-
melhante ao da DNAse. Este método pode ser efetuado a partir de caldo de hemocultura em 
que foi observado o crescimento de cocos Gram positivos agrupados.
Existem outras provas que diferenciam o Staphylococcus aureus, dentre elas estão a aglu-
tinação em látex ou em hemácias de carneiro (sorologia). Estes testes geralmente detectam 
a coagulase livre, e alguns apresentam também uma imunoglobulina antiproteína A, que está 
presente na parede do Staphylococcus aureus. Como estes kits são comerciais, deve-se seguir 
as instruções do fabricante.
Teste do crescimento em ágar manitol: o Staphylococcus aureus tem a capacidade de fermen-
tar o manitol em meio contendo 7,5% de cloreto de sódio, denominado ágar manitol salgado ou 
Meio de Chapman. O indicador de pH é o vermelho de fenol, que indica uma reação positiva quan-
do o meio ao redor das colônias se torna amarelo, e negativa quando permanece avermelhado.
A diferenciação entre Micrococcus sp e os Staphylococcus sp se dá pela coloração de Gram, 
em que os Micrococcus aparecem em tétrades, ou pela pigmentação de suas colônias (ama-
relas, róseas ou alaranjadas). Alguns não apresentam pigmentos e podem ser diferenciados 
pela sensibilidade a Bacitracina 0,004 UI, a mesma utilizada na identificação de Streptococcus 
pyogenes, mas utilizando-se a inoculação em ágar Mueller Hinton.
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Teste da bacitracina: este tipo de identificação deve ser realizado em ágar sangue sem 
tensão de CO2 ou os resultados podem ser discrepantes. Semeia-se meia placa de ágar san-
gue com o estreptococo a ser identificado, como para um antibiograma; coloca-se o disco de 
bacitracina 0,004 u, como indicado na figura 06; incuba- se por uma noite a 35ºC sem CO2; 
observa-se qualquer zona de inibição como resultado de sensibilidade. O Streptococcus pyo-
genes (grupo A) é rapidamente identificado por este método.
Teste do sulfametoxazol trimetoprim (SXT): adiciona-se na mesma placa de ágar sangue 
o disco de SXT; incuba-se por uma noite a 35ºC sem CO2. A sensibilidade a esta droga signi-
fica, em conjunto com as outras leituras, que o estreptococo não pertence ao grupo A, B ou D 
de Lancefield. Coloca-se um disco de Bacitracina 0,004 UI à direita e um de Sulfametoxazol-tri-
metoprim à esquerda.
Havendo necessidade, pode ser feito o teste de CAMP na mesma placa, conforme figura 06.
Teste de camp (na mesma placa): inocula-se uma estria única de uma amostra de Staphylo-
coccus aureus produtor de beta lisina (ATCC 25923) no centro de uma placa de ágar sangue pre-
parada obrigatoriamente com sangue de carneiro (esta linhagem de S. aureus deve ser mantida 
continuamente em estoque para o teste). Inocula-se as amostras a serem testadas em estrias 
formando um ângulo reto com a linha de inoculação da amostra teste de estafilococo. As es-
trias não devem se tocar, ficando a 1mm de distância, e deste modo várias amostras podem ser 
testadas em uma mesma placa de ágar sangue. A maneira de inocular é fundamental para a 
observação do efeito esperado. Incuba-se a placa entre 35 e 37ºC durante um período de 18-24 
horas. A positividade da prova (presença de Streptococcus agalactiae (grupo B) é evidenciada 
pelo alargamento da zona de lise, que adquire a forma de ponta de flecha característica na área 
de intersecção entre as duas estrias.
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Teste do PYR: este teste determina a atividade do PYR, também chamado pyrrolidonyl-
-aminopeptidase, uma enzima produzida pelo Streptococcus pyogenes e também pelo Ente-
rococcus sp. Com o auxílio de uma pinça, retira-se um disco de PYR do frasco colocando-o 
sobre uma lâmina, pinga-se uma gota de água destilada estéril e realiza-se um esfregaço com 
a bactéria a ser testada, previamente isolada, sobre o disco de PYR umedecido, aguarda-se 
alguns minutos e coloca-se uma gota do reagente PYR. A reação ocorrerá em até 1 minuto. O 
aparecimento da cor vermelha indica um teste positivo. Streptococcus pyogenes e Enterococ-
cus spp. são PYR positivos. Nesta prova, utilizam-se somente colônias puras para o teste, pois 
podem surgir resultados errôneos. Deve-se seguir as instruções do fabricante, uma vez que o 
teste se encontra disponível comercialmente. Este teste é tecnicamente equivalente à prova da 
hidrólise da bile esculina e crescimento em 6,5% de NaCl, usados na identificação clássica dos 
enterococos, e mais específico que o teste da Bacitracina na caracterização presuntiva dos es-
treptococos beta hemolíticos do grupo “A”, tendo a vantagem de ser mais rápido. Em qualquer 
dos dois casos, o PYR constitui uma alternativa importante para esclarecer testes duvidosos.
Teste da bile esculina: tem como finalidade diferenciar Enterococcus spp. e Streptococcus 
bovis de Streptococcus spp. Inocula-se as colônias a serem testadas em um meio contendo 
bile esculina, incuba-se em estufa a 37ºC por até 72 horas. A presença de cor enegrecida no 
meio indica hidrolise, o que torna a prova positiva.
Teste do NaCl 6,5%: este teste indica a capacidade do microrganismo crescer em altas 
concentrações de sal. Tem por finalidade diferenciar Enterococcus spp. de Streptococcus spp. 
Inocula-se as colônias a serem testadas em caldo BHI (brain heart infusion) suplementado 
com 6,0% de NaCl (com ou sem indicador), incuba-se em estufa a 37ºC por até 72 horas. A 
turvação ou mudança de cor (no caso de adição de indicador) é indicativa de crescimento bac-
teriano, positivando o teste. Somente enterococos são positivos ao teste do NaCl 6,5%.
Teste da bile esculina e do NaCl 6,5%: semeia-se as provas de Bile Esculina e do caldo de 
NaCl a 6,5%; incuba-se da mesma forma. O teste da bile esculina positiva apresenta cor mar-
rom escuro e o do caldo de NaCl a 6,5% deve mostrar turvação para ser considerado positivo. 
Todos os estreptococos do grupo D de Lancefield apresentam a bile esculina positiva, seja 
Enterococcus sp ou Streptococcus do grupo D não enterococo (Streptococcus bovis).
Quanto ao teste da tolerância ao NaCl a 6,5%, somente os enterococos são positivos.
Teste da hidrólise do hipurato: os Streptococcus agalactiae (grupo B) são também capazes 
de hidrolisar o hipurato em seus componentes: glicina e ácido benzoico. A hidrólise do hipurato 
permite a identificação presuntiva dos estreptococos beta hemolíticos dos grupos A, B e D.
Identificação dos estreptococos não beta hemolíticos: somente os estreptococos do gru-
po B (Streptococcus agalactiae) e D (Enterococcus spp. e Streptococcus bovis) podem não 
apresentar nenhuma hemólise (gama hemólise).
Identificação dos estreptococos alfa hemolíticos: a identificação deste grupo não deve ser 
feita por métodos sorológicos, pois a maioria não possui os antígenos de Lancefield.
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Teste da optoquina: semeia-se um quarto de uma placa de ágar sangue com a cepa alfa 
hemolítica a ser testada; aplica-se um disco de optoquina; incuba-se a 35ºC em tensão aumen-
tada de CO2 (método da vela). Uma zona de inibição de 14mm ou mais em volta de um disco 
de 6mm significa sensibilidade e identifica o Streptococcus pneumoniae.
Teste da bile solubilidade: o teste da bile solubilidade também identifica o Streptococcus 
pneumoniae. Pode ser executado em placa ou em caldo. Método em placa: obtém-se um caldo 
turvo após 3 horas de incubação a 35ºC; inocula-se uma suspensão de desoxicolato a 10%. O 
clareamento da turbidez reflete a lise bacteriana e confere um resultado positivo à prova. Mé-
todo em caldo: inoculam-se gotas de desoxicolato de sódio a 2% sobre as colônias suspeitas; 
incuba-se a 35ºC por 30 minutos. As colônias positivas irão desaparecer por lise bacteriana. 
Deve-se suspeitar da presença de “variante nutricional de Streptococcus” destes microrganis-
mos quando o Gram de amostras positivas de hemocultura obtidas em meios comerciais mos-
trarem cocos em cadeias que não crescem no subcultivo em ágar sangue. Semeia-se o repique 
em ágar sangue; fazendo estrias perpendiculares ao sentido da semeadura com Staphylococ-
cus aureus, como para a identificação presuntiva de Haemophilus influenzae; incuba-se a 35ºC 
em atmosfera com CO2.
bACilos grAM-negAtivos não ferMentAdores
Não fermentador quer dizer simplesmente que o microrganismo não realiza fermentação

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