ROTEIRO PARA AULA PRÁTICA E RELATÓRIO - AULA 2 - ANALISE DE ALIMENTOS (1)

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CENTRO UNIVERSITÁRIO FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS - FMU 
CISBEM 
 
 
 
Aline Faria Ferreira de Siqueira 
 
 
 
 
 
 
 
ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP), SEMEADURA 
EM MEIOS SÓLIDOS E COLORAÇÃO DE GRAM EM ALIMENTOS E LEITURA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
São Paulo, 2021
 
1 
Aline Faria Ferreira de Siqueira 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP), SEMEADURA 
EM MEIOS SÓLIDOS E COLORAÇÃO DE GRAM EM ALIMENTOS E LEITURA 
 
Relatório técnico apresentado como 
requisito parcial para obtenção de 
aprovação na disciplina Análise de 
Alimentos, na FMU. 
 
Prof. Msc. Viviane Cristina Longuini de 
Menezes 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
São Paulo, 2021
2 
 
SUMÁRIO 
 
 
1 INTRODUÇÃO..............................................................................................3 
2 DESENVOLVIMENTO..................................................................................4 
2.1 OBJETIVO GERAL.......................................................................................4 
2.2 METODOLOGIAS.........................................................................................4 
2.2.1 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS........................................................5 
2.3 RESULTADOS.............................................................................................12 
3 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES.....................................................13 
ANEXOS ................................................................................................................14 
REFERÊNCIAS............................................................................................. 16 
 
 
 
 
 
3 
1 INTRODUÇÃO 
 
 
 As infecções alimentares são causadas por microrganismos presentes nos 
alimentos, podendo se agravar dependendo da sua manipulação, higienização 
e preparação. Deste modo, a E. Coli é uma bactéria que pode ser encontrada em 
diversos alimentos, ela pertence ao grupo dos organismos infecciosos juntamente 
com a Salmonella e Campylobacter, ou seja, elas crescem em meio ao trato 
intestinal. A presença desta bactéria em alimentos, indica contaminação fecal, o que 
significa que elas podem gerar alterações bioquímicas nos alimentos, que podem 
ser nocivas aos homens e animais, e também quando consumidas podem causar 
sintomas como vômitos, febre, diarreia e dores abdominais. 
 Atualmente a análise microbiológica de alimentos tem foco na segurança 
alimentar em todo o processo produtivo do alimento, em todos os ingredientes 
utilizados para sua preparação. Entretanto, antigamente essa análise era realizada 
apenas no processo final, os lotes finais eram aprovados ou não de acordo com seu 
resultado, se negativo o lote era aprovado para ser comercializado, se positivo era 
reprocessado ou descartados. Essa abordagem mais atual em relação a segurança 
alimentar, garante um melhor controle e previne a entrada de patógenos no 
processo produtivo reduzindo as contaminações. 
 Existem muitos métodos de determinação de microrganismo na indústria, 
porém a aceitação destes métodos se deve a três principais fatores: velocidade, 
exatidão e facilidade no uso. A coloração de Gram é uma técnica muito utilizada 
para identificação de gram-positivas e gram-negativas, no qual as bactérias podem 
ser coradas de vermelho ou de azul, sendo vermelho para gram-negativas, pela 
precipitação do cristal violeta com o lugol e que esta precipitação não pode ser 
extraída do interior da célula após a adição de etanol ou acetona com as gram-
positivas, que coram após a adição de fucsina, obtendo um contraste entre os dois 
tipos de bactérias. A E. Coli é uma bactéria do grupo das gram-negativas, o que 
significa que esta cora em vermelho. 
 
 
4 
2 DESENVOLVIMENTO 
 
 
2.1.1 OBJETIVO GERAL 
 
ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP), SEMEADURA EM 
MEIOS SÓLIDOS E COLORAÇÃO DE GRAM EM ALIMENTOS 
Ao final desta atividade experimental espera-se que o aluno seja capaz de: 
- Realizar análises de identificação coliformes por tubos múltiplos (NMP); 
- Realizar a semeadura em meios sólidos específicos para alimentos e analisar 
os principais microrganismos causadores de toxinfecções alimentares; 
- Realizar coloração de Gram, analisar, identificar diferenças morfológicas e 
arranjos; 
- Realizar a técnica de diferenciação do microrganismo através da prova da 
catalase. 
 
2.2 METODOLOGIAS 
ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP), 
SEMEADURA EM MEIOS SÓLIDOS 
COLORAÇÃO DE GRAM EM ALIMENTOS 
 
2.2.1 ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP) 
2.2.1.1 MATERIAL E REAGENTE 
Bico de bunsen, 
Alça de platina, 
Pissete com Alcóol 70%, 
tubos de Durham estéreis, 
béquer de 100 mL, 
proveta de 50 mL, 
tubos de caldo EC ou caldo Mac Conkey ou caldo BHI estéreis com tampa. 
tubos de caldo BHI com 7,5% NACL com tampa e estéril. 
 
5 
 
 
 
2.2.1.2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
A técnica de tubos múltiplos é a mais tradicional para a análise de coliformes (totais 
ou termotolerantes) e E.coli. Esta metodologia permite a quantificação por “número 
mais provável” (NMP) de microrganismos e é dividida em duas fases sucessivas, uma 
presuntiva e outra confirmativa. E esta última somente é realizada se houver 
crescimento positivo na etapa presuntiva. 
O procedimento da fase presuntiva consiste em fazer a homogeneização e 
transferência de alíquotas e/ou diluições da amostra para tubos de ensaios contendo, 
no fundo, um tubo invertido para coleta de gás (tubo de Durhan), e o meio de cultura 
apropriado (caldo lauril triptose). Todos os tubos são incubados a 35°C durante 24 a 
48 horas e posterior identificação dos que tiverem crescimento (positivo) de coliformes 
totais, resultado identificado pela ocorrência de reação ácida (coloração amarelada) 
ou produção de gás (retida no tudo de Durhan). 
Na fase confirmativa, efetua-se o repique (transferência de alíquotas com alça de 
platina) dos tubos presuntivos positivos para tubos preparados da mesma forma que 
no anterior, porém contendo caldo. Todos os tubos são incubados a 35°C durante 24 
a 48 horas e posterior identificação dos que tiverem crescimento (positivo) de 
coliformes totais, identificado pela ocorrência de produção de gás nos tubos de 
Durhan. 
Na fase confirmativa, efetua-se o repique (transferência de alíquotas com alça de 
platina) dos tubos presuntivos positivos para tubos preparados da mesma forma que 
no anterior, porém contendo caldo. Todos os tubos são incubados a 35°C durante 24 
a 48 horas e posterior identificação dos que tiverem crescimento (positivo) de 
coliformes totais, identificado pela ocorrência de produção de gás nos tubos de 
Durhan. 
(A fase complementar serve para identificação dos coliformes termotolerantes, na 
qual faz-se o repique dos tubos presuntivos para outros tubos, desta vez contendo 
meio EC (recomenda-se que seja feito simultaneamente ao teste confirmativo), que 
deverão ser incubados a 44,5ºC durante 24 horas. Todo este procedimento totaliza no 
6 
mínimo 72 horas para obtenção de resultado positivo para coliformes 
termotolerantes.) 
 
 
2.2.1.3 ANÁLISE DOS TUBOS (ESSA ETAPA SERÁ ANALISADA 
POSTERIORMENTE NA AULA DA PRÓXIMA SEMANA) 
 
 
 
De acordo com o número de tubos positivos em cada uma das diluições e das fases 
utilizadas, determina-se o número mais provável (NMP), tendo como base tabelas 
estatísticas. 
Acesse as tabelas de NMP e os procedimentos completos para análise de coliformes, 
segundo o FDA, no link: 
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm109656.htm
#tab1 
Usando a Tabela, é possível estimar o número de organismos a partir de qualquer 
combinação de resultados positivos e negativos com 95% de confiança dos dados. 
 
2.2.2 SEMEADURA EM MEIOS SÓLIDOS 
Semeadura e isolamento 
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm109656.htm#tab1http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm109656.htm#tab1
7 
Material enriquecido em caldo TSB de swab ou “in natura”: 
Placas: esgotar o material em um ponto da placa e com a alça comum de níquel-
cromo flambada e fria, realizar a semeadura com estrias para isolamento a partir do 
ponto de aplicação da amostra (semeadura direta) (Fig 1 a 4); 
 
As placas a serem utilizadas serão Agar MacConkey e Agar Manitol. 
Levar para a estufa a 36,5°C por 24h, para obter a multiplicação dos Mos. Do meio. 
 
2.2.3 Avaliar o crescimento microbiano nos diferentes meios de cultura e realizar a 
identificação dos microrganismos. 
(ESSA ETAPA SERÁ ANALISADA POSTERIORMENTE NA AULA DA PRÓXIMA 
SEMANA) 
 
Interpretação 
Crescimento no Agar MacConkey – Gram Negativos 
Fermentadores de Lactose – Colônia Rosa 
Não Fermentadores de Lactose – Colônia Incolor ou Branca 
Crescimento no Agar Manitol – Gram Positivas 
Colônia pequeno e rodeadas de uma zona vermelha – estafilococos não-patogênicos 
Colônia maiores e rodeadas de uma zona amarela – Staphylococcus aureus 
fermentadores do manitol 
 
2.2.4 Prova da catalase 
Quando houver suspeita de cocos Gram-positivos, realizar uma bacterioscopia e 
depois a prova da catalase. 
a) Em um tubo de ensaio limpo, colocar cerca de 5 mL de peróxido de hidrogênio 20 
volumes 
Fig 1 Fig 2 Fig 3 Fig 4 Fig 5 
8 
b) Com auxílio de uma alça, transferir uma colônia para o tubo e emulsioná-la no 
peróxido. 
c) Um desprendimento intenso de bolhas indica resultado POSITIVO. 
 
 
2.2.4 Coloração de Gram 
1 INTRODUÇÃO 
A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias que consiste no 
tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes 
cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite a 
separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a 
determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. O método da 
coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias 
Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um 
tratamento com etanol-acetona enquanto as paredes celulares de bactérias Gram 
negativas não o fazem. 
 
2.2.4.1 OBJETIVO 
Nesta aula o aluno irá executar o método de coloração de Gram, em esfregaços já 
previamente preparados e fixados pelo calor. Posteriormente, o aluno realizará a 
visualização dos esfregaços corados no microscópio óptico empregando a objetiva de 
imersão, deverão ser capazes de caracterizar a morfologia individual, a formação de 
agrupamentos e diferenciação da coloração da célula bacteriana. 
 
2.2.4.2 MATERIAL E REAGENTE 
Bico de Bulsen, 
• Alça de Platina; 
• Tubos de Ensaio; 
• Algodão; 
• Estante para tubo de ensaio; 
• Conta-gotas; 
• Placa de Patrick; 
9 
• Hagar Chocolate; 
• Microscópio Ótico 
• Lâmina 
• Lamínula 
• Cristal Violeta 
• Lugol 
• Fucsina 
 
2.2.4.3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
Com todos os materiais sobre a bancada inicia-se pelo processo de esterilização da 
alça de platina sobre o bico de bulsen, para esterilizá-la deve-se segurá-la da mesma 
forma como se segura uma caneta, e rodá-la em cima do bico de bulsen para que o 
fogo percorra toda sua extensão, depois deve-se incliná-la aproximadamente 45º e 
esperar que ela fique incandescente; após a esterilização a alça de platina deve ficar 
apoiada no bico de bulsen para que ela não saia da área de proteção do mesmo. Tudo 
que for pego com a mão direita ou esquerda deve-se permanecer neste mesmo lado, 
visto que a troca de objetos de uma mão para a outra pode ocasionar acidentes devido 
ao risco que o bico de bulsen apresenta por se tratar de um emissor de chama. 
Manuseando na área de segurança, pega-se o tubo de ensaio, retira-se o algodão que 
está tampando-o e com um conta gotas coleta-se a salina que está no tubo; esta salina 
deve ser pingada (uma gota) na lâmina que vai ao microscópio; no final deste 
procedimento deve-se passar o tubo de ensaio no bico de bulsen e tampá-lo 
novamente com algodão. Segurando de maneira leve a alça de platina, deve se abrir 
a placa de Patrick e esfregar a alça nela superficialmente para que possa ser retirada 
uma finíssima camada de microrganismos 
que ali cresceram; tampa-se novamente a placa e realiza-se um esfregaço desta 
camada na lâmina que contêm a salina. 
Com o bico de bulsen aceso, e com um prendedor segurando a lâmina, realiza-se a 
secagem da placa de maneira lenta, sem que ela corra risco de estourar. 
Após a secagem foi realizado o processo de coloração; para corar devem-se realizar 
os seguintes passos: 
a. Pingar o cristal violeta e esperar um minuto 
b. Sobre ele pingar lugol e esperar mais um minuto, 
10 
c. Colocar solução de álcool cetona e lavar com água, 
d. Cobrir com Fucsina e esperar 30 segundos, 
e. Lavar e deixar secar. 
 
 
 
2.2.4.4 ANÁLISE E LEITURA (ESSA ETAPA SERÁ ANALISADA 
POSTERIORMENTE NA AULA DA PRÓXIMA SEMANA) 
 
Observar ao microscópio em menor aumento e, a seguir, colocar 1 gota de óleo 
mineral na lâmina e focalizar com objetiva de imersão. 
Desenhar as bactérias observadas considerando o tipo de coloração (Gram + ou -), a 
forma e o arranjo das células. 
Após o uso, a objetiva de imersão deve ser limpa com papel absorvente. 
As bactérias que tiverem a característica irão formar cristais violeta em seu interior e 
se diferenciarão das demais pela coloração mais acentuada. 
 
 
11 
 
 
 
MORFOLOGIA ARRANJO GRAM 
Cocos Estreptococus positiva 
Bacilos Estreptobacilos negativa 
 
Quando as estruturas celulares, como você explicaria a possibilidade de 
comportamento das bactérias G + e G - na coloração de Gram? 
 As gram-negativas possuem sua parede de peptideoglicano mais fina que as gram-
positivas que possuem a parede celular mais grossa e mais camadas de 
peptideoglicano. Por isso as gram-positivas não coram com a precipitação de violeta 
genciana + lugol.
12 
2.3 RESULTADOS 
Amostra A: 
Meio líquido: Pouca turbidez pela presença do BHI com NaCl (pois este inibe 
crescimento), continuou praticamente límpida. Ou seja, amostra deu negativo. 
Meio sólido: cresceu em meio. 
Catalase: negativa. 
Resultado: E. coli. 
 
Amostra B: 
Meio Líquido: Apresentou maior turbidez pela presença apenas do BHI e houve 
captura de gas pelo tubo de durhan, está positiva. 
Catalase: positiva. 
Resultado: Staphylococcus. 
 
E. Coli cresceu em meio macConkey (colonias avermelhadas) Staphylococcus aureus 
não cresceu neste meio, mas sim em Manitol. 
Relatar os resultados obtidos a partir dos experimentos e dos estudos realizados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
13 
 
3 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES 
 
 
 Na técnica de NMP foi possível identificar o tubo positivo e o negativo através da 
avaliação de turbidez da solução e também pela captura de gás pelo tubo de 
Durhan. Na semeadura em meio sólido pudemos identificar amostra A e B pelo 
meio em que cada uma cresceu, a amostra A foi colocada em meio macconkey 
e manitol e o mesmo foi feito com a amostra B. O meio de cultura MacConkey 
favorece o crescimento de E coli e não é muito propicio para Staphylococcus 
aureus, assim como, o manitol não favorece crescimento de E. coli e sim de 
Staphylococcus. Assim, conseguimos identificar as amostras e observar no 
microscópio a morfologia de cada um, sendo o Staphylococcus em cocos e a E. 
coli em bacilos. Também foi realizada a técnica de catalase, onde a amostra B 
(staphylococcus) de positivo enquanto a amostra A (E. coli) deu negativo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
14 
 
ANEXO 
TÉCNICAS DE SEMEADURA 
Semeadura em Placas de Petri: 
O material a ser semeado deverá conter poucos microrganismos porque o inóculo 
para o isolamento deve ser leve. Lembrar que cada colônia formada na superfície de 
um meio sólido é originada de um ou alguns microrganismos.Quanto maior o número, 
menor possibilidade de isolamento e maior probabilidade de crescimento confluente. 
Quando o inóculo for obtido a partir de meio sólido (inóculo pesado), este poderá ser 
diluído em salina estéril ou ser utilizada a técnica de esgotamento adequada. 
Estrias Múltiplas para Isolamento: Consiste em espalhar o material com o auxílio de 
uma alça bacteriológica, fazendo estrias sucessivas até o esgotamento do material, 
de modo a obter-se um perfeito isolamento das bactérias existentes na amostra. 
Quando o material é muito denso, a alça deverá ser flambada. A semeadura poderá 
ser realizada em um sentido ou em vários, de acordo com a pessoa que realizará a 
técnica, lembrando-se sempre que o objetivo principal desta técnica de semeadura é 
a obtenção do isolamento bacteriano. 
 
 
Semeadura em Meio Líquidos: 
Difusão: Técnica que consiste em acrescentar microrganismos através da alça ou 
agulha de platina em meios líquidos. Tem como principal finalidade a observação de 
propriedades bioquímicas através de testes microbiológicos, bem como poderá ser 
utilizada para o favorecimento do crescimento bacteriano, quando é realizada em 
meios que possibilitem o enriquecimento. 
15 
 
Técnica para semeadura em meios líquidos: 
Segurar a alça com a mão direita, flambar primeiro na chama azul, depois na amarela. 
Esperar esfriar (a alça é flambada na posição vertical e deverá ficar atrás 
da chama para proteção do operador); 
Retirar a rolha de algodão do tubo que contém o microrganismo a ser semeado ou 
repicado (que deverá estar na mão esquerda) utilizando-se o dedo mínimo da mão 
direita. A ROLHA OU TAMPA DEVERÁ PERMANECER SENDO SEGURA COM O 
DEDO MÍNIMO, ATÉ 
O FINAL DA OPERAÇÃO; 
Flambar a boca do tubo, e retirar o inóculo com a alça fria; 
Flambar novamente a boca do tubo e fechar; 
Pegar o tubo onde se irá realizar a semeadura, retirar a rolha e flambar; 
Semear o material, flambar a boca do tubo e fechar; 
Esterilizar a alça, identificar o tubo semeado e levar para incubação em estufa 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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REFERÊNCIAS 
 
 
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS – ABNT. NBR 10719: 
apresentação de relatórios técnico-científicos. Rio de Janeiro, 1989. 9 p. 
 
bsjoi.ufsc.br/files/2010/.../Modelo_de_relatorio_tecnico-cientifico.do 
 
FORSYTHE, S. J. Microbiologia da Segurança de Alimentos. 2°ed. Porto Alegra: 
Artmed, 2013.