Clonagem - Anotações

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Clonagem
Definição: produção de indivíduos idênticos (clones).
É feita por bipartição de embriões e separação dos blastômeros nos estágios iniciais de desenvolvimento. 
A capacidade de se desenvolver dos blastômeros bipartidos era de até 16 células, que formam os embriões. Acima de 16, o blastômero perdia sua capacidade. Em 1989, foi descoberta a técnica de células do botão embrionário (stem cells) = fonte ilimitada de núcleos para produção de clones. Até esse momento, só eram clonados embriões. Depois, o cientista fez clonagem de célula germinativa primordial (oogônia), de vacas entre o 50-70 dias de gestação – clonagem do feto. Depois, nos anos 90, foi feita clonagem a partir de uma célula somática fetal, não mais indiferenciada – célula: fibroblasto de um feto de 26 dias. Ele fez com que uma célula diferenciada se tornasse uma célula indiferenciada - reprogramação. Em 1997, o Wilmut fez um clone a partir de células somáticas adultas (fibroblasto mamário) da ovelha Dolly, e foi o primeiro clone criado a partir de um animal vivo.
É feita para fins de melhoramento genético, pesquisa fundamental, clonagem de espécies em extinção (mas não tira a espécie da extinção, pois a clonagem reproduz animais homozigotos – mesma família – e para tirar de extinção devem ser heterozigotos), e animais transgênicos.
Técnica resumida: 
Há 4 formas de tirar o núcleo do oócito (que já deve estar maduro em metáfase 2):
Colorir o núcleo: destaca o núcleo e facilita a retirada da célula, porém, não é boa para o oócito.
Expor o oócito em meio democolcina: essa substância faz com que o núcleo se desloque para a periferia do oócito e forme um “calombo” – pseudo corpúsculo polar. Também não é a maneira ideal.
Separação do oócito pela metade e retirada da parte com o corpúsculo polar (pois o núcleo provavelmente estará próximo). É bem agressiva.
Exposição o oócito a soluções de cálcio: o cálcio induz a ativação da anáfase e telófase e libera o segundo corpúsculo polar, então, pipetou a região próxima ao segundo corpúsculo solar, pois o núcleo deve estar próximo.
Oócito sem núcleo vai servir para ser fusionado com a célula responsável pela clonagem (geralmente é uma célula da pele ou do embrião – célula 2n).
Preparação da célula a ser clonada – doadora de núcleo:
Embriões no estádio de mórula compacta no dia 5 ou 6 após fecundação. Retirada da zona pelúcida (Pronase3mg/ml), desagregação das células-15min em PBS sem cálcio e magnésio, aspiração por várias vezes com pipeta fina.
Células somáticas: solução de tripsina 0,1% e EDTA 0,02% para separação das células com lavagem em SFB.
Reconstrução dos embriões = fusão da célula doadora com oócito receptor.
Eletrofusão: em meio de baixa condutância elétrica para evitar produção e dispersão de calor (sol. Manitol ou meio Zimmerman). Corrente alternada alinha as membranas a serem fundidas paralela aos eletrodos e corrente direta induz formação de poros nas membranas, o que leva a fusão entre as células.
Aplicações: 
Clones interespécies
Clonagem de animais transgênicos
Clonagem de animais valiosos ou de estimação
Clonagem terapêutica – cultura de células tronco para tratamento de lesões de medula.
Fatores que interferem na clonagem:
Núcleos vindos de células embrionárias possuem maior potencial de desenvolvimento (sobrevivem mais) do que os derivados de células mais diferenciadas (mais adultas).
Taxa de mortalidade embrionária, fetal e perinatal é maior nos embriões oriundos de células somáticas.
Problemas:
Anomalias cromossômicas
Altas taxas de mortalidade, por muitos problemas de placenta, irrigação sanguínea insuficiente, redução do número e aumento do tamanho dos placentomas (carúnculos e cotilédones).
Aumento do peso ao nascer.
Problemas respiratórios – diminuição do cortisol fetal (tratada com injeção de cortisol para aliviar os pulmões e permitir a respiração).